Articolo metodologico

Biosensing potenziale del membrane del neurone del motore in embrioni di Zebrafish in tensione

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DOI:

10.3791/55297

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26 giugno 2017

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1Department of Medical Biotechnology and Translational Medicine, Università degli Studi di Milano, 2Department of Neuroscience; Department of Cell Biology, Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, 3Program in Cellular Neuroscience, Neurodegeneration and Repair, Yale University School of Medicine, 4Department of BioSciences, Università degli Studi di Milano

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

I protocolli qui descritti consentono lo studio delle proprietà elettriche delle cellule eccitabili nelle condizioni fisiologiche più non invasive impiegando embrioni di zebrafish in un sistema in vivo insieme a un indicatore di tensione geneticamente codificato (GEVI) basato sul trasferimento di energia per risonanza di fluorescenza (FRET) espresso selettivamente nel tipo di cellula di interesse.

Abstract

I protocolli qui descritti sono progettati per consentire ai ricercatori di studiare la comunicazione cellulare senza alterare l'integrità dell'ambiente in cui si trovano le cellule. In particolare, sono stati sviluppati per analizzare l'attività elettrica delle cellule eccitabili, come i neuroni spinali. In uno scenario del genere, è fondamentale preservare l'integrità della cellula spinale, ma è anche importante preservare l'anatomia e la forma fisiologica dei sistemi coinvolti. Infatti, la comprensione del modo in cui il sistema nervoso – e altri sistemi complessi – funziona deve basarsi su un approccio sistemico. Per questo motivo, l'embrione vivo di zebrafish è stato scelto come sistema modello e le variazioni di tensione della membrana del neurone spinale sono state valutate senza interferire con le condizioni fisiologiche degli embrioni.

Qui, viene descritto un approccio che combina l'impiego di embrioni di zebrafish con un biosensore basato su FRET. Gli embrioni di zebrafish sono caratterizzati da un sistema nervoso molto semplificato e sono particolarmente adatti per applicazioni di imaging grazie alla loro trasparenza, che consente l'impiego di indicatori di tensione basati sulla fluorescenza sulla membrana plasmatica durante lo sviluppo del zebrafish. La sinergia tra queste due componenti permette di analizzare l'attività elettrica delle cellule negli organismi viventi intatti, senza perturbare lo stato fisiologico. Infine, questo approccio non invasivo può coesistere con altre analisi (ad esempio, registrazioni di movimenti spontanei, come mostrato qui).

Introduzione

L' analisi di componenti sistemica in vivo consente agli scienziati di indagare sul comportamento cellulare in modo più affidabile. Ciò è particolarmente vero quando l'attività sotto controllo è fortemente influenzata dalle interazioni delle cellule cellulari (sia a contatto che a contatto non dipendente), come nel sistema nervoso, dove la tensione della membrana cambia la comunicazione tra le cellule eccitabili. La comprensione delle informazioni codificate da questi segnali elettrici è la chiave per comprendere il modo in cui il sistema nervoso funziona sia negli stati fisiologici che nelle malattie.

Per studiare le proprietà elettriche delle cellule nelle condizioni fisiologiche non invasive, sono stati recentemente sviluppati diversi indicatori di tensione geneticamente codificati 1 . Contrariamente alle precedenti generazioni di sensori di tensione ottica (principalmente coloranti sensibili alla tensione) 2 , GEVI consentono analisi in vivo del sistema neurale intatto eLa loro espressione può essere limitata a specifici tipi di cellule o popolazioni.

L'embrione zebrafish è il "substrato" in vivo della scelta che sfrutta il grande potenziale attribuito ai GEVI. Infatti, grazie alla sua chiarezza ottica e al suo sistema nervoso semplificato ma evoluzionatamente conservato, il modello zebrafish consente la semplice identificazione e manipolazione di ogni componente cellulare in una rete. Infatti, l'impiego della GEET Mermaid 3 a base FRET ha portato all'identificazione di alterazioni pre-sintomatiche nel comportamento dei neuroni dei moti spinali in un modello zebrafish della sclerosi laterale amyotrofica (ALS) 4 .

Il seguente protocollo in vivo descrive come monitorare le proprietà elettriche dei neuroni del motore spinale in embrioni di zebrafish intatti che esprimono la Sirena in maniera specifica al neurone. Inoltre, dimostra come il farmaco farmacologicamente indottoIn tali proprietà elettriche può essere associato con alterazioni della frequenza delle bobine spontanee embrionali, l'attività stereotipica del motore che caratterizza il comportamento di movimento dei zebrafish in fasi molto avanzate di sviluppo.

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Protocollo

1. Generazione di plasmidi pHuC_Mermaid

NOTA: La sirena è un biosensore sviluppato accoppiando il dominio di tensione (VSD) della Ciona intestinalis (ora Ciona robusta ) 5 sensori di tensione contenenti fosfatasi (Ci-VSP) con i fluorofori partner FRET Umi-Kinoko Green (mUKG: donatore) e una versione monomerica della proteina fluorescente arancione Kusabira Orange (mKOk: accettore). Per questo biosensore, i cambiamenti conformazionali del dominio VSD, indotti dalla depolarizzazione della membrana, aumentano la prossimità delle proteine ​​fluorescenti donatori e accettore, aumentando così il trasferimento di energia tra di loro (aumentando il rapporto FRET) 3 . Il VSD assicura la localizzazione efficiente del biosensore alla membrana plasmatica. L'espressione neuronale del biosensore (nel midollo spinale, il segnale è rilevabile sia in interneuroni che nei neuroni motori) è ottenuta clonando la sirenaEn frame di lettura (ORF) sotto il promotore pan-neurale zebrafish HuC 6 .

  1. Amplificare con la reazione a catena polimerica (PCR) l'ORF della sirena dal plasmide 3 della sirena pCS4 + con la polimerasi di DNA Pfu (bozza) utilizzando il primer universale T3 e il primer sirena Sma I (5'TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA) per inserire un sito di restrizione SmaI a monte Della sirena ORF.
    1. Utilizzare la seguente miscela di PCR: 0,5 μL di DNA polimerasi di Pfu, 7,5 μL del buffer 10x specifico, 1 μL di dNTP 10 mM, 2,5 μL di dimetilsolfossido (DMSO), 0,5 μL (50 ng) del plasmide e 1 ΜL di soluzioni di stock di 20 μM di ogni primer in un volume totale di 50 μL.
    2. Riscaldare la miscela PCR per 15 s a 95 ° C, prelevarla per 15 s a 50 ° C e allungarla per 4 minuti a 72 ° C per un totale di 35 cicli.
  2. Gel-purifica la specifica puntaPCR utilizzando un kit di depurazione del gel commerciale, seguendo il protocollo del produttore.
  3. Clonare il frammento del DNA nel vettore blunt pCMV-SC seguendo il protocollo del produttore.
  4. Linearizzare il plasmide sirena-positivo (denominato pCMV-SC_Mermaid) con l'enzima di restrizione Sma I per il successivo inserimento del promotore HuC.
    1. Impostare la reazione di restrizione come segue: 0,5 μL (10 U) di enzima di restrizione SmaI, 2 μL del kit 10x tampone e 5 μg di DNA plasmidico in un volume totale di 20 μL. Incubare la reazione a 25 ° C per 1 ora.
  5. Gel-purifica il plasmide digerito usando un kit di depurazione del gel commerciale seguendo il protocollo del produttore.
  6. PCR amplifica il promotore HuC (pHuC), con DNA polimera Pfu DNA e DNA genomico zebrafish come template, utilizzando una coppia di primers HuC-specific (HuCprom-forw1_SalI: 5'-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA e HuCproM-rev1: 5'-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) e che copre una regione di 3.150 bp a monte dell'ATG.
    1. Impostare la miscela PCR utilizzando il seguente schema: 0,5 μL di polimero DNA di Pfu, 7,5 μL del buffer 10x specifico, 1 μL di dNTP 10 mM, 2,5 μL DMSO, 200 ng di DNA genomico e 1 μL di 20 μM Soluzioni di ciascun primer in un volume totale di 50 μL.
    2. Dopo una fase iniziale di 2 minuti a 95 ° C, scaldare la miscela PCR per 15 s a 95 ° C, prelevare per 15 s a 50 ° C e allungarlo per 4 min a 72 ° C per un totale di 35 cicli .
  7. Gel-purifica il prodotto specifico blunt PCR usando un kit di depurazione del gel commerciale seguendo il protocollo del produttore.
  8. Si lega una quantità equimolare della pCMV-SC_Mermaid purificata (fase 1.5) e del pHuC DNA (fase 1.7) usando 1 μL di ligasi del DNA T4 e 1 μl del buffer specifico 10X in un volume totale di 10 μL. Incubare la reazione per 16 ore a4 ° C.
  9. Trasformare una aliquota di cellule competenti con 5 μL di reazione di legatura (passo 1.8) seguendo le istruzioni del produttore.
  10. Selezionare i cloni pHuC-positive (pHuC_Mermaid) con il promotore inserito nel giusto orientamento mediante una doppia digestione Sal I- Eco RV (il sito di restrizione Sal I è stato inserito a monte del frammento promotore nel passaggio 1.6 mentre il sito di restrizione Eco RV È posizionata a valle della regione di poliadenilazione, PolyA, del plasmid pCMV-SC).
    1. Impostare la reazione di restrizione come segue: 0,5 μL (10 U) di entrambi gli enzimi di restrizione Sal I e Eco RV, 2 μL del tampone kit10X e 1 μg di pHuC_Mermaid DNA in un volume totale di 20 μL. Incubare la reazione a 37 ° C per 1 ora. Eseguire le reazioni su un gel agarosio.

2. Microinjection dell'embrione

  1. Trasferire il fertilizzato, ad esempioGs ottenuti da ceppi selvatici (AB strain) o Sod1-G93R zebrafish adulti 4 ad un piatto di Petri da 10 mm utilizzando una pipetta di plastica.
  2. Sciacquare gli embrioni in acqua fredda (4 ° C) e immediatamente microiniziarli nel tuorlo con 200 pg di pluuro di pHuC_Mermaid utilizzando un microinjector (per una descrizione generale e dettagliata della procedura di microinjection, vedere Riferimenti 7 e 8).
  3. Usando una pipetta di plastica, trasferire gli embrioni in un piatto di Petri e incubarli in acqua di pesce a 28 ° C fino a raggiungere la fase di sviluppo desiderata (20-24 ore dopo la fertilizzazione, hpf) per le seguenti analisi.

3. Analisi spontanea del coil di coda

NOTA: Valutare il comportamento di coil spontaneo della coda negli embrioni da 20-24 hlf con o senza il riluzolo di farmaco.

  1. Trasferire un embrione in un piatto di Petri da 90 mm riempito con acqua di pesce contenente 0,2% DMSO (veicolo riluzolo) e manualmente dechorionate usando twO pinze di gioielliere con punte taglienti. Incubare l'embrione per 5 min.
  2. Rileva la bobina di coda in RT durante una registrazione video di 1 min usando una fotocamera digitale montata su uno stereomicroscopio. Acquisizione di serie temporali a una risoluzione di 30 fotogrammi / s.
  3. Calcolare la frequenza delle bobine di coda spontanee contando il numero di curve (sia contralaterali che ipsilaterali) per unità di tempo.
  4. Per valutare l'effetto del riluzolo di farmaco, utilizzare delicatamente una pipetta di Pasteur plastica per trasferire l'embrione in un nuovo piatto di Petri da 90 mm riempito con acqua di pesce contenente 5 μM riluzolo.
    1. Incubare l'embrione per 5 minuti prima di registrare un video di 1 minuto e eseguire l'analisi comportamentale come sopra.

4. Imaging per la visualizzazione di Mermaid Biosensor in embrioni viventi: rilevazione simultanea dei segnali di donatore e ricevente

  1. Montare gli embrioni da 20 a 24 hpf in agarosio a basso punto di fusione dell'1% nell'acqua di pesce a37 ° C all'interno di un piatto da 35 mm di imaging di vetro. Orientare gli embrioni sui loro lati. Attendere che l'agarosio si solidifichi a temperatura ambiente.
  2. Trasferire il piatto di imaging allo stadio di un confocale invertito montato su un microscopio invertito. Identificare i neuroni dei motori che esprimono il biosensore con un obiettivo 20X (0,7 apertura numerica, NA) emozionando il mUKG con la linea laser a 488 nm di argon e registrando le sue emissioni tra 495 e 525 nm.
  3. Per una misura FRET, eccitate mUKG, donatore della coppia FRET, con la linea laser 488 nm. Rilevare contemporaneamente, con uno scanner a risonanza a 8000 Hz in modalità bidirezionale, la fluorescenza emessa dal donatore (fra 495 e 525 nm) e la fluorescenza emessa dall'accettatore mKOk (tra 550 e 650 nm, canale FRET). Se disponibile, utilizzare il laser da 473 nm.
    NOTA: L'efficienza di eccitazione del donatore sarà leggermente ridotta (85% invece del 93% con 488 nm), ma la eccitazione incrociata dell'acceptore(Dal 17% con il 488 nm al 9% con linea laser 473 nm).
  4. Per ridurre la fototossicità e lo sbiancamento dei fluorofori, minimizzare l'illuminazione del campione riducendo la potenza della linea laser (sulla finestra del fascio del software di acquisizione).
  5. Ottimizzare l'eccitazione per abbinare i parametri di guadagno e di offset impostati all'inizio dell'esperimento e mantenuti costanti durante la sessione. Per impostare l'offset, modificare il colore dell'immagine ai valori di intensità (utilizzando la tabella di ricerca Q) e, durante la scansione con il laser spento, ruotare la manopola offset (smart offset) in modo che i pixel di sfondo abbiano un'intensità leggermente Superiore a zero. Con la stessa tabella di ricerca, attivando il laser durante la scansione, ruotare la manopola di guadagno (guadagno intelligente) per ottimizzare il rapporto segnale / rumore, facendo attenzione a evitare pixel saturi.
  6. Utilizzando un foro aperto (2 unità ariose), acquisire immagini a 16 bit per fornire una gamma dinamica sufficiente per il quantitativoE analizza. Evitate di aumentare la velocità di acquisizione e ridurre al minimo la fotopolimerizzazione.
  7. Nella finestra Acquisizione software, selezionare una dimensione del campo immagine di 512 x 64 pixel (dimensione pixel: 605 nm) dal menu a discesa.
  8. Dalla finestra del modo di acquisizione, selezionare xyt (tempo trascorso su un solo piano xy) f rom dal menu a discesa e registrare le variazioni della tensione neuronale spinale embrionale acquisendo un solo piano xy, impostando i parametri di acquisizione per registrare un'immagine ogni 30 Ms per 1 min.
  9. Per valutare l'effetto della somministrazione del riluzolo sulla depolarizzazione della membrana nello stesso neurone, acquisire un nuovo set di dati 5 min dopo l'aggiunta di acqua di pesce contenente 5 μM riluzolo.
  10. Per l'analisi FRET, utilizzare la macro ImageJ Biosensor_FRET (esprimendo biosensori FRET a catena singola.
  11. Valutare il rapporto FRET di membrana basale di ogni neurone a t 1 come ((FRET background - FRET background) / (Donatore medio - Donator background)), dove FRET e DonO l'intensità media è l'intensità media di fluorescenza calcolata nella stessa regione di interesse (ROI) attirata intorno alla cella per ogni canale acquisito e lo sfondo FRET e Donatore è l'intensità media di fluorescenza calcolata in un ROI del campo visivo senza il campione fluorescente.
    NOTA: Una descrizione dettagliata dettagliata dell'utilizzo del plugin può essere trovata sul sito www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret .
  12. Utilizza un software di grafica per confrontare la frequenza, l'ampiezza e la durata della depolarizzazione tra diversi paradigmi sperimentali. Confronti due gruppi usando un t- test di Student unpaired e considerate i valori medi statisticamente diversi quando P <0.05.

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Risultati

Un vettore di espressione che trasporta la sequenza di codifica biosensore di Mermaid a base FRET sotto il controllo del promotore pan-neuronale di pHuC, che guida la sintesi della proteina esclusivamente nel sistema nervoso, è stata consegnata in uova fecondate a cellule singole mediante una microinezione in Per ottenere embrioni transgenici transitori ( Figura 1 , Pannello sinistro). Dopo aver masterizzato la tecnica di microinjection, la percentuale...

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Discussione

Il protocollo qui presentato ci ha consentito di esplorare l'associazione tra le proprietà elettriche dei neuroni dei motori spinali embrionali zebrafish e il comportamento spintaneo di avvolgimento, la prima attività motoria stereotipica, che si presenta intorno a 17 hpf di sviluppo embrionale e dura fino a 24 hpf 10 .

Il nostro approccio offre ai ricercatori uno strumento per studiare il sistema neurale di embrioni intatti, mantenendo pienamente la complessità d...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare Simona Rodighiero per il suo inestimabile supporto con l'analisi di imaging FRET.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Basso punto di fusione AgarosioSigma-AldrichA9414
DMSO Sigma-AldrichW387520
RiluzoleSigma-AldrichR116
Pfu Ultra HQ DNA polimerasi Agilent Technologies - Divisione Prodotti Stratagene 600389
Primer universale T3Sigma-Aldrich
Wizard SV Gel e PCR Clean-Up systemPromegaA9280
Primer universale SmaI Eurofins
StrataClone Mammalian Expression Vector System / pCMV-SC blunt vector Agilent Technologies - Divisione Prodotti Stratagene 
SmaI New England BiolabsR0141S
T4 DNA ligasiPromegaM1801
SalINew England BiolabsR0138S
EcoRVNew England BiolabsR0195S
35 mm, piatto di imaging con fondo di vetro Pinze Ibidi81151
Stereomicroscopio Sigma-AldrichF6521
LeicaMicrosystemsM10 F
Fotocamera digitaleLeica MicrosystemsDFC 310 FX
Leica Application Suite 4.7.1 software Leica Microsystems
QuickTime Player, v10.4Microscopio
(invertito)MicrosystemsTCS SP5
Microiniettore Eppendorf Femtojet
ImageJ macro Biosensor_FRET 
GraphPad Prisma 6.0c Software GraphPad, Inc
240228 confocale Apple Leica

Riferimenti

  1. Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age. Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).
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