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Articolo metodologico

Identificazione di sequenze di localizzazione Plasmodesmal in proteine In Planta

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DOI:

10.3791/55301

⸱

15 agosto 2017

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York, 2Department of Plant Pathology and Plant-Microbe Biology, Cornell University

In questo articolo

Sommario

Connessioni intercellulari di pianta, la Plasmodesmi (Pd), giocano un ruolo centrale nella pianta interazioni pianta-virus e di fisiologia. Critica ai trasporti Pd sono smistamento segnali che indirizzano proteine al Pd. Tuttavia, la nostra conoscenza di queste sequenze è ancora nella sua infanzia. Descriviamo una strategia per identificare i segnali di localizzazione di Pd in proteine Pd-mirati.

Abstract

I Plasmodesmi (Pd) sono connessioni cellula--cellula che fungono da gateway attraverso cui piccole e grandi molecole sono trasportate tra cellule vegetali. Considerando che il trasporto del Pd di piccole molecole, quali gli ioni ed acqua, è presunta per accadere passivamente, cellula--cellula trasporto di macromolecole biologiche, tali proteine, si verifica molto probabilmente attraverso un meccanismo attivo che coinvolge specifici segnali di targeting sul trasportato della molecola. La scarsità di segnali di localizzazione identificati i Plasmodesmi (Pd) (PLSs) ha limitato severamente la comprensione della proteina-ordinamento pathways coinvolti nella pianta cellula--cellula macromolecolari trasporti e comunicazioni. Da una ricchezza di pianta proteine endogene e virale conosciute al traffico attraverso Pd, PLSs solo tre sono stati segnalati fin qui, tutti loro da proteine vegetali endogeni. Quindi, è importante sviluppare una strategia sperimentale sistematica e affidabile per identificare una sequenza PLS funzionale, che è necessario e sufficiente per il Pd targeting, direttamente nel soggiorno cellule vegetali. Qui, descriviamo una tale strategia utilizzando come paradigma della proteina della cellula--cellula movimento (MP) del virus del mosaico del tabacco (TMV). Questi esperimenti, che identificato e caratterizzato il primo impianto PLS virale, può essere adattati per l'individuazione di sequenze PLS in proteine più Pd-mirati.

Introduzione

I Plasmodesmi (Pd) funzionano come condotti per trasporto intercellulare di regolatori chiave di sviluppo di pianta e morfogenesi, che vanno da fattori di trascrizione di mRNA e piccole molecole di RNA. Inoltre, questa capacità di trasporto macromolecolare del Pd è utilizzata dalla maggior parte dei virus vegetali per la loro diffusione intercellulare durante l'infezione; per spostarsi tra Pd, virus vegetali si sono evolute proteine specializzate, chiamate proteine di movimento (MPs), che si rivolgono specificamente a Pd1,2,3,4,5,6 , 7. vie molecolari di trasporto Pd molto probabilmente sono intimamente interconnesse con le sequenze specifiche che mirano le proteine trasportate in queste vie. Così, identificazione di questi segnali di localizzazione di Pd (PLSs) può essere diagnostica del pathway di trasporto corrispondente di Pd. Questo è per analogia di Pd trasporto8, ad esempio, alle vie di importazione nucleare differenti, che possono essere specifiche per differenti localizzazione nucleare (NLS) di segnale sequenze9,10. Concettualmente, sia NLSs e PLSs rappresentare non liberabili sequenze di targeting subcellulare che sono necessarie e sufficienti per il targeting. Tuttavia, a differenza di NLSs11, le informazioni di sequenza PLSs sono severamente limitate. In particolare, sono state segnalate solo quattro sequenze di proteine coinvolte nel Pd targeting, con tutti i loro derivati da proteine vegetali endogeni. Il primo è rappresentato da un dominio homeobox di KN112 – un fattore di trascrizione che si muove da strati di cellule interne all'epidermide della pianta foglia13 – e i suoi omologhi di KNOX14. Quello secondo è anche da un fattore di trascrizione, Dof, che contiene un putativo PLS descritto come la tratta intercellulare (IT) motivo15. La terza sequenza è dalla proteina della membrana i plasmodesmi residente tipo 1 PDLP1, ed è rappresentato da un dominio transmembrana16. Infine, il quarto Pd sequenza di targeting recentemente è stato segnalato per glicosilfosfatidilinositolo (GPI)-proteine ancorate ed esso è rappresentato dal segnale di modificazione glicosilfosfatidilinositolo (GPI)17.

È interessante notare che, fino a poco tempo fa, nessun PLSs sono stati segnalati per MPs virale. Gli studi precedenti hanno indicato la presenza di presunti PLS sequenze in pianta virale MPs18,19, ma nessun vero PLS, vale a dire, una sequenza di amminoacido minimo necessaria e sufficiente per il Pd targeting di un carico indipendenti molecola ( ad es., PCP) è stata identificata in un MP virali. Ancora una di queste proteine, MP del virus del mosaico del tabacco (TMV), era il primo per cui Pd localizzazione e trasporti sono stati dimostrati20.

Per colmare questa lacuna, abbiamo sviluppato una strategia sperimentale per identificare TMV MP PLS. Questa strategia si basa su tre concetti. (i) abbiamo definito PLS come una sequenza di amminoacido minimo che è necessario e sufficiente per il targeting di proteina a Pd21. (ii) perché TMV MP in primo luogo destinato a Pd e poi trasloca attraverso questi canali22, abbiamo mirato a disgiungere queste due attività e identificare il PLS buona fede, che funziona solo per il targeting del Pd e non per il successivo trasporto. (iii) abbiamo analizzato il PLS identificato per residui dell'aminoacido importante per suo Pd targeting attività, sia strutturalmente che funzionalmente. Utilizzando questo approccio, abbiamo delineato una sequenza di 50-ammino acido residuo dell'estremità amminica di TMV MP che funge da PLS buona fede. Questo è stato fatto da producendo una serie di frammenti di TMV MP che satura l'intera lunghezza della proteina, tagging loro carbossilico-termini con PCP e transitoriamente esprimerli nei tessuti vegetali. Localizzazione del PD di ciascuno dei frammenti testati è stato determinato che li coexpressing con una proteina marker Pd, PDCB1 (Pd callosio proteina obbligatoria 1)23. Il frammento più piccolo che ancora localizzato al Pd, ma non ha fatto attraversare il Pd, è stato considerato per rappresentare PLS. Infine, il PLS era alanina-analizzati per determinare i residui dell'aminoacido chiave necessari per la sua struttura e/o funzione.

Considerando che qui illustriamo questo approccio descrivendo identificazione di TMV MP PLS, può essere impiegato per scoprire PLSs in qualsiasi altre proteine Pd-mirati, se codificato da patogeni vegetali o da impianti stessi; Questo è perché il nostro metodo non approfittare di eventuali caratteristiche uniche di MPs virale per quanto riguarda la loro capacità di destinazione al Pd.

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Protocollo

1. il materiale vegetale

  1. Scelta delle specie vegetali
  2. Utilizzare le specie vegetali autoctone alla proteina di interesse, vale a dire, uno che codifica questa proteina per proteine endogene o che rappresenta l'ospite naturale per l'agente patogeno per proteine virali. Inoltre, le specie vegetali selezionati devono essere suscettibili del metodo scelto di trasformazione genetica transitoria.
    Nota: Gli studi utilizzano abitualmente Nicotiana benthamiana, che rappresenta un buon padrone per TMV e si trasforma in modo efficiente con la tecnica di trasformazione genetica mediata da Agrobacterium, vale a dire, agroinfiltrazione (Vedi punto 3). N. benthamiana piante inoltre sono facilmente coltivate e hanno grandi foglie, che sono facilmente inoculati da Agrobacterium e facilmente analizzabile mediante microscopia confocale.
  3. Crescita delle piante
    1. Pianta N. benthamiana semi nel terreno bagnato ad alta densità. Tenerli in camera un ambiente controllato in 20-25 ˚ c sotto 16 h di luce a ~ 75 µmol fotoni m-2 s-1 e 8 ore di buio. Dopo che il diametro della euphyll raggiunge 0,5 cm, attentamente trasferire le piantine per pentole più grandi e continuare la crescita nella stessa camera alle stesse condizioni.
    2. Mantenere le piante fino a quando crescono alla fase 4-8-foglia entro 4 settimane, quando le foglie più grandi sono 4-6 cm di diametro; in questo momento, può essere utilizzati per agroinfiltrazione (Vedi punto 3).
      Nota: Importante, mai utilizzare le piante se hanno cominciato a fiorire perché, in questa fase inerente allo sviluppo, l'architettura di foglia varia spesso24,25, portando talvolta a risultati incoerenti.

2. espressione vettoriale costruzione

  1. Scelta del sistema di espressione
    1. Scegliere il sistema, cioè, vettori e vettore consegna metodo di espressione, più adatto per l'espressione della proteina di interesse per le specie vegetali studiate.
      Nota: Occasionalmente, tali specifiche combinazioni di specie testate proteina/vegetali possono richiedono vettori specifici e vector metodo di consegna per l'ottimale espressione e funzione della proteina di interesse. Per le piante dicotiledoni più, tuttavia, selezionare plasmidi binari come vettori di espressione e agroinfiltrazione come sistema di consegna.
  2. Proteina fluorescente tagging
    1. Fluorescente tag ogni proteina espressa per l'analisi della sua distribuzione subcellulare22, tra cui localizzazione Pd.
      Nota: Impiegare autofluorescent proteine, come la PCP e DsRed2, come tag. Tag la proteina testata con PCP e coesprimere esso con un DsRed2 gratuito. Funzioni di PCP sia come tag e come una molecola di carico virus-indipendenti. DsRed2 funzioni per calibrare l'efficienza complessiva dell'espressione transitoria e, poiché esso è autonomo in cella, per identificare la cella inizialmente trasformata; Questa funzione di quest'ultima è importante nel valutare il movimento di cellula--cellula di proteine provate potenzialmente non-cella-autonomi. Per coexpression con il marcatore di Pd PDCB1, che è anche cella-autonoma, tag la proteina testata con PCP e PDCB1 con DsRed2.
    2. Come regola generale, fusibile il tag autofluorescent carbossi-terminale della proteina espressa. Tuttavia, se le esposizioni di proteina testata full-length taggati compromessa Pd targeting, trasferire il tag per l'ammino-terminale della proteina.
    3. Clonare le sequenze di codificazione delle proteine per essere testato in un vettore di espressione pianta adatta.
      Nota: Ci sono molti vettori di espressione di piante diverse che consentono di etichettare fluorescente. Utilizziamo una serie di pSAT plasmidi26 o alcuni dei loro derivati27,28, che sono adatti per la clonazione della sequenza di interesse direttamente nel telaio con i tag suggeriti autofluorescent (Vedi punto 2.2.1) in entrambi amminico- e orientamenti di carbossi-terminale.
    4. Trasferire ogni cassetta di espressione in un vettore binario Agrobacterium.
      Nota: Anche se basati su pSAT costrutti sono adatti per la consegna diretta Biobalistica nei tessuti vegetali, agroinfiltrazione, che è il metodo di trasformazione consigliato qui (Vedi punto 3), richiede che la cassetta di espressione per essere collocato tra il T-DNA bordi di un file binario vettore29.
      Nota: Tutti i vettori di pSAT sono progettati per consentire tale trasferimento al pPZP-RCS2 espressione multigenica vettore binario26,30 da un singolo passaggio clonazione usando nucleasi raro taglio AscI, PpoI, -SceI-CeuI, PI-PspI e PI-TliI 26. i ricercatori che preferiscono utilizzare la clonazione recombinatorial, ad esempio, utilizzando eterologa lox siti31, possono impiegare pSAT vettore varianti26,27.
    5. Per coexpression, trasferire entrambi cassette di espressione, ad esempio, testata proteina-CFP e DsRed2 o testata proteina-CFP e PDCB1-DsRed2 (Vedi punto 2.1), per lo stesso vettore binario pPZP-RCS2.
      Nota: In alternativa, Agrobacterium culture che harboring costrutti binari individuali possono essere mescolate insieme per l'infiltrazione nel N. benthamiana (Vedi punto 3.1).

3. agroinfiltrazione

  1. Aggiungere 1 µ g di un plasmide basati su pPZP-RCS2 da cultura di 2.2.5 a 100 µ l di passaggio delle cellule competenti del ceppo di Agrobacterium tumefaciens EHA105 o GV3101 preparato come descritto32, Incubare in ghiaccio per 30 min, flash-congelamento in azoto liquido per 1 min, e Incubare a 28 ° C per 15 min.
    1. Quindi, aggiungere 1 mL di terreno LB (10 g/L triptone, 5g/L estratto di lievito e 10 g/L NaCl) alla miscela delle cellule competenti e incubare a 28 ° C per 2 h. Spin giù le cellule a 3.000 × g per 1 min, li risospendere in 0,2 mL di LB e impiattatelo su LB agar completati con gli antibiotici adatti (per esempio, spectinomicina 100 mg/L e 50 mg/L rifampicina per vettori basati su pPZP-RSC226,30). Crescere a 28 ° C per 48 h fino a quando le singole colonie sono visibili.
  2. Pick e piastra diverse singole colonie su una piastra di agar LB fresca (Vedi punto 3.1), crescere a 28 ° C per 48 h e prendere una piccola quantità di batteri per l'analisi di Colonia PCR33 per confermare la presenza dei costrutti specifici di binari.
  3. Crescere ogni colonia di Agrobacterium con il costrutto di interesse durante la notte a 28 ° C in 5 mL di LB medium completate con gli antibiotici adatti (Vedi punto 3.1.1). Centrifugare le cellule a 3.000 × g e ri-li sospende a OD600= 0,5 nel buffer agroinfiltrazione (10mm MgCl2, 10mm MES (pH 5,6), 150 µM acetosyringone). Incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
    1. Se usando una miscela di plasmidi binari piuttosto che un plasmide di espressione multigenica singolo per coexpression di proteina, mescolare le culture cella corrispondente al rapporto di 1:1 v/v prima di infiltrazione. Incubare le cellule a 28 ° C per 2 h.
  4. Caricare l'inoculo in una siringa di plastica da 1 mL e premere che l'ugello della siringa (senza ago) contro dell'epidermide (abbagliai) più bassa della pienamente matura N. benthamiana lascia. Tenere la foglia con un dito guantato sul viso adassiale34,35.
    1. Introdurre l'agrobatterio nel mezzo di infiltrazione tramite iniezione lenta. Significatività statistica, infiltrarsi numerose foglie su ogni pianta.
      Nota: Si noti che le foglie più vecchie non vengono utilizzate come non cedono i livelli di espressione coerente.
    2. Inoculare tutte le foglie in situ. Mantenere la pianta infiltrata fino osservazione come indicato al punto 1.2.

4. microscopio confocale

  1. Utilizzare una lama per tagliare ogni foglia in frammenti tra le vene 24-48 h dopo l'infiltrazione, (a seconda del rendimento di espressione transitoria della proteina specifica testata); la dimensione di ogni fetta di tessuto deve essere tale che la fetta è completamente coperto da vetro di copertura (22 mm x 40 mm) utilizzato per la microscopia.
  2. Posto le fette foglia sull'oggetto diapositiva con la superficie del foglio abbagliai rivolto verso l'alto, mettere una goccia di acqua sulla fetta foglia e coprirlo con il vetro di copertura. Immobilizzare il vetro di copertura con piccoli pezzi di nastro su ogni lato.
  3. Osservare i tessuti agroinfiltrate sotto un microscopio confocale di scansione laser e registrare le immagini risultanti.
    1. In primo luogo, utilizzare un obiettivo obiettivo 10x per identificare le celle con il segnale e quindi utilizzare obiettivo 63X per osservazioni più dettagliate.
    2. Uso la 458 nm lunghezza d'onda da un laser a ioni argon per eccitare la PCP e 543 nm per eccitare DsRed2. Mantenere tutte le impostazioni per l'acquisizione di immagini, cioè, intensità del laser e fotomoltiplicatore tubo (PMT) impostazioni, tra esperimenti. In media, esaminare le cellule di 100-120 per ogni condizione sperimentale.

5. identificazione di PLS

  1. Diagnosticare la localizzazione della proteina testata utilizzando il microscopio confocale (sezione 4). Verifica se la proteina testata ha il modello punctate periferico caratteristico25,36,37,38,39,40,41 e colocalizza con il marcatore di Pd PDCB123. Questo indica che la proteina testata probabilmente contiene sequenze di PLS.
  2. Dopo la conferma dell'attività della proteina testata, PLS progressivamente suddividere la sua cornice di lettura aperta (ORF) (numero di accessione genbank BAF93925.1) in frammenti più piccoli, autofluorescently, (ad es., PCP,) tag ciascuno di essi e analizzare loro localizzazione sottocellulare come descritto nel passaggio 4. Inizialmente, la dimensione di 100 residui dell'amminoacido per ogni frammento da è raccomandata.
  3. Suddividere ulteriormente i frammenti troncati che hanno l'attività PLS e controllare la loro localizzazione subcellulare come descritto nel passaggio 4 fino al più piccolo frammento che ancora si localizza al Pd, cioè è sufficiente per trasportare il carico di tag autofluorescent al Pd, è identificato. Questo frammento è presunto per rappresentare la sequenza PLS.
  4. Eliminare il PLS presunto dalla proteina testata full-length, cioè fusibile la parte restante della proteina della prova senza putativo PLS autofluorescent tag e determinare la localizzazione sottocellulare della proteina del mutante risultante come descritto nel passaggio 4. se questa proteina mutante che manca il presunto PLS non riesce a localizzare al Pd, questo indicherà che l'identificati PLS non è solo sufficiente (Vedi punto 5.3), ma anche necessario per il trasporto di Pd della proteina testato.
  5. Agroinfiltrate le foglie con una miscela di culture di Agrobacterium che harboring l'espressione costruire per la PCP-etichetta PLS e DsRed2 libero (Vedi punto 3.3). Osservare infiltrato tessuto usando il microscopio confocale con lente dell'obiettivo di 10 x utilizzando le stesse impostazioni passo 4.3.
  6. Punteggio di celle che contengono segnali PCP sia DsRed2 come cellule inizialmente infiltrate e segnare le celle adiacenti che conteneva solo il segnale di PCP come quelli quello movimento di esposizione.
    Nota: Questo passaggio esamina il PLS identificato per la sua potenziale capacità di movimento della cellula--cellula; Questo è perché molte proteine destinate a Pd (tra cui la maggior parte pianta MPs virale) anche passare attraverso Pd alle cellule vicine. La concentrazione di Agrobacterium utilizzato per infiltrazione dipende dall'efficienza di espressione delle diverse strutture rispettivamente. Per agroinfiltrazione, assicurarsi di utilizzare la diluizione di coltura cellulare che garantisce (i) la trasformazione di singole cellule, lasciando le cellule adiacenti trasformate, (ii) raggiunge l'efficienza simile di espressione. Ad esempio, i nostri esperimenti utilizzano OD600 di 0,01 e 0,005 per espressione di PCP-etichetta PLS e libero DsRed2, rispettivamente.

6. identificazione di chiave PLS residui utilizzando alanina scansione42

  1. Utilizzare protocolli standard di PCR per amplificare il PLS codifica sequenza impiegando una coppia di primer disegnati per contenere la mutazione desiderata, cioè, sostituzione del residuo dell'amminoacido destinazione con alanina, intorno alla regione centrale di ogni primer come descritto 21. svolgere di disegno dell'iniettore e utilizzare il kit di mutagenesi sito-diretta per mutagenesi sito-diretta secondo le istruzioni del produttore.
  2. Purificare i prodotti PCR risultanti con qualsiasi kit di purificazione del DNA standard e digerire loro a 37 ° C con DpnI per eliminare il parentale (cioè, non-mutato) metilato e DNA hemimethylated. Questo raffreddare per 5 min a temperatura ambiente (non su ghiaccio). Poi trasformare la miscela direttamente in e. coli cellule competenti43e identificare le colonie con i costrutti mutanti desiderati come descritto nel passo 3.2.
  3. Introdurre i costrutti mutanti nel vettore binario come descritto al punto 2.2.4, eseguire agroinfiltrazione come descritto nel passaggio 3 e valutare Pd targeting come descritto nei passaggi 4 e 5.1.

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Risultati

I dati rappresentativi, che fedelmente illustrano i risultati attesi dai protocolli descritti e identificano il TMV MP PLS, sono adattati da Yuan et al. 21. Figura 1A prima vengono riepilogate le principali costrutti esprimendo il full-length TMV MP (1-268), TMV MP PLS (comprendente i primi 50 residui dell'amminoacido della proteina, 1-50), e sua alanina scansione V4A derivati fusa per PCP (generata come descritte al punto 2.2 passaggi, 5....

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Discussione

Questo protocollo ha quattro componenti principali: il concetto di identificazione di una sequenza che è necessario e sufficiente per il targeting al Pd, divisione sistematica della proteina di interesse in frammenti che sono progressivamente ridotti in lunghezza, fondendo il collaudato frammenti di una proteina di autofluorescent che serve sia come tag e come cargo macromolecolare e analisi funzionale per il Pd targeting in vita pianta tessuti dopo l'espressione transitoria delle proteine di fusione testata. Si noti che...

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Dichiarazioni

Conflitti di interesse non dichiarati.

Ringraziamenti

Per la mancanza di spazio, abbiamo citato principalmente articoli di recensione e ci scusiamo con i nostri colleghi cui lavoro originale non è stato citato. Il lavoro in laboratorio V.C. è supportato da sovvenzioni dal NIH, NSF, USDA/catino, BARD e BSF a V.C., e il laboratorio S.G.L è supportato da NIH e fondi dai dipartimenti di patologia vegetale e biologia vegetale-microbo a S.G.L

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Microscopio confocale a scansione laser (CLSM)ZeissLSM5Qualsiasi CLSM con capacità simili è appropriato
Software Zen per l'imaging al microscopio confocaleZeissversione 2009Il software deve essere compatibile con il
kit di mutagenesi sito-specifica Quickchange IIAgilent200523
AcetosyringoneSigma-AldrichD134406
MESSigma-Aldrich69892
Siringhe senza aghiBD309659
MgCl2FisherScientificM33-500
Spectinomycin Sigma-AldrichS4014
RifampicinaSigma-AldrichR3501
Ampicillina Sigma-AldrichA0166
utilizzato per il CLSM

Riferimenti

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