Identificazione di sequenze di localizzazione Plasmodesmal in proteine In Planta

Summary

Connessioni intercellulari di pianta, la Plasmodesmi (Pd), giocano un ruolo centrale nella pianta interazioni pianta-virus e di fisiologia. Critica ai trasporti Pd sono smistamento segnali che indirizzano proteine al Pd. Tuttavia, la nostra conoscenza di queste sequenze è ancora nella sua infanzia. Descriviamo una strategia per identificare i segnali di localizzazione di Pd in proteine Pd-mirati.

Abstract

I Plasmodesmi (Pd) sono connessioni cellula--cellula che fungono da gateway attraverso cui piccole e grandi molecole sono trasportate tra cellule vegetali. Considerando che il trasporto del Pd di piccole molecole, quali gli ioni ed acqua, è presunta per accadere passivamente, cellula--cellula trasporto di macromolecole biologiche, tali proteine, si verifica molto probabilmente attraverso un meccanismo attivo che coinvolge specifici segnali di targeting sul trasportato della molecola. La scarsità di segnali di localizzazione identificati i Plasmodesmi (Pd) (PLSs) ha limitato severamente la comprensione della proteina-ordinamento pathways coinvolti nella pianta cellula--cellula macromolecolari trasporti e comunicazioni. Da una ricchezza di pianta proteine endogene e virale conosciute al traffico attraverso Pd, PLSs solo tre sono stati segnalati fin qui, tutti loro da proteine vegetali endogeni. Quindi, è importante sviluppare una strategia sperimentale sistematica e affidabile per identificare una sequenza PLS funzionale, che è necessario e sufficiente per il Pd targeting, direttamente nel soggiorno cellule vegetali. Qui, descriviamo una tale strategia utilizzando come paradigma della proteina della cellula--cellula movimento (MP) del virus del mosaico del tabacco (TMV). Questi esperimenti, che identificato e caratterizzato il primo impianto PLS virale, può essere adattati per l'individuazione di sequenze PLS in proteine più Pd-mirati.

Introduction

I Plasmodesmi (Pd) funzionano come condotti per trasporto intercellulare di regolatori chiave di sviluppo di pianta e morfogenesi, che vanno da fattori di trascrizione di mRNA e piccole molecole di RNA. Inoltre, questa capacità di trasporto macromolecolare del Pd è utilizzata dalla maggior parte dei virus vegetali per la loro diffusione intercellulare durante l'infezione; per spostarsi tra Pd, virus vegetali si sono evolute proteine specializzate, chiamate proteine di movimento (MPs), che si rivolgono specificamente a Pd^1,2,3,4,

Protocol

1. il materiale vegetale

1. Scelta delle specie vegetali
2. Utilizzare le specie vegetali autoctone alla proteina di interesse, vale a dire, uno che codifica questa proteina per proteine endogene o che rappresenta l'ospite naturale per l'agente patogeno per proteine virali. Inoltre, le specie vegetali selezionati devono essere suscettibili del metodo scelto di trasformazione genetica transitoria.
   Nota: Gli studi utilizzano abitualmente Nicotiana benthamiana, che rappresenta un buon padrone per TMV e si trasforma in modo efficiente con la tecnica di trasformazione genetica mediata da Agrobacterium, vale a dire, agroinfiltrazi....

Results

I dati rappresentativi, che fedelmente illustrano i risultati attesi dai protocolli descritti e identificano il TMV MP PLS, sono adattati da Yuan et al. ²¹. Figura 1A prima vengono riepilogate le principali costrutti esprimendo il full-length TMV MP (1-268), TMV MP PLS (comprendente i primi 50 residui dell'amminoacido della proteina, 1-50), e sua alanina scansione V4A derivati fusa per PCP (generata come descritte al punto 2.2 passaggi, 5........

Discussion

Questo protocollo ha quattro componenti principali: il concetto di identificazione di una sequenza che è necessario e sufficiente per il targeting al Pd, divisione sistematica della proteina di interesse in frammenti che sono progressivamente ridotti in lunghezza, fondendo il collaudato frammenti di una proteina di autofluorescent che serve sia come tag e come cargo macromolecolare e analisi funzionale per il Pd targeting in vita pianta tessuti dopo l'espressione transitoria delle proteine di fusione testata. Si noti che.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopio confocale a scansione laser (CLSM)	Zeiss	LSM5	Qualsiasi CLSM con capacità simili è appropriato
Software Zen per l'imaging al microscopio confocale	Zeiss	versione 2009	Il software deve essere compatibile con il
kit di mutagenesi sito-specifica Quickchange II	Agilent	200523
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406
MES	Sigma-Aldrich	69892
Siringhe senza aghi	BD	309659
MgCl2	FisherScientific	M33-500
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S4014
Rifampicina	Sigma-Aldrich	R3501
Ampicillina	Sigma-Aldrich	A0166