Cinetica di Lagging filamento sintesi del DNA<em&gt; In Vitro</em&gt; Dai replica proteine ​​batteriofago T7

Sommario

Descriviamo saggi discontinui sensibili basati su gel per esaminare la cinetica dell'inizio del filamento ritardato utilizzando le proteine di replicazione del batteriofago T7.

Abstract

Qui forniamo protocolli per l'esame cinetico della sintesi di DNA a filamento ritardato in vitro da parte delle proteine di replicazione del batteriofago T7. Il replisoma T7 è uno dei sistemi di replicazione più semplici conosciuti, composto da sole quattro proteine, che è una caratteristica interessante per gli esperimenti biochimici. Particolare enfasi è posta sulla sintesi di primer ribonucleotidici da parte della primasi-elicasi T7, che vengono utilizzati dalla DNA polimerasi per avviare la sintesi del DNA. Poiché i meccanismi di replicazione del DNA sono conservati nel corso dell'evoluzione, questi protocolli dovrebbero essere applicabili, o utili come trampolino di lancio concettuale, ai ricercatori che utilizzano altri sistemi modello. I protocolli qui descritti sono altamente sensibili e un ricercatore esperto può eseguire questi esperimenti e ottenere dati per l'analisi in circa un giorno. L'unica apparecchiatura specializzata richiesta è uno strumento a flusso rapido, ma questa apparecchiatura è relativamente comune e disponibile da varie fonti commerciali. I principali svantaggi di questi saggi, tuttavia, includono l'uso della radioattività e la relativa bassa produttività.

Introduzione

La replicazione del DNA è una caratteristica conservato di tutta la vita cellulare. Mentre l'identità e il numero dei componenti di replica variano ampiamente, i meccanismi generali sono condivisi tra evoluzione ^1. Qui, descriviamo gel a base, discontinue esperimenti cinetici, utilizzando substrati radioattivi, volti a comprendere la cinetica della sintesi del DNA in ritardo filamento in vitro da componenti del replisoma T7. Il meccanismo di replicazione del batteriofago T7 è molto semplice, composto da soli quattro proteine (la DNA polimerasi, GP5, e il suo fattore processività, E. coli tioredossina, le bifunzionali GP4 ....

Protocollo

NOTA: Seguire tutte le normative istituzionali per quanto riguarda l'uso sicuro e lo smaltimento di materiale radioattivo, incluso ma non limitato a, l'utilizzo di dispositivi di protezione individuale, come guanti, occhiali di sicurezza, camice da laboratorio, e scudi acrilico appropriate.

NOTA: Il buffer standard consiste di 40 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM di potassio glutammato, 5 mM DTT, 0,1 mM EDTA (questo buffer viene pre-fatta ad una concentrazione 5x) e 0,3 mM di ogni dNTP. Proteine replica T7 sono purificati come descritto ^{8, 9, 10.}

Risultati

I risultati mostrati in figura 1A sono stati ottenuti come descritto al punto 1 del protocollo, cioè, campionando manualmente una reazione di sintesi di primer catalizzata da GP4 in condizioni multiple-turnover. Qui, una gamma di prodotti dopo elettroforesi su gel può essere osservato mediante CTP marcato con ³² P alla α-posizione in reazioni di sintesi di primer (Figura 1A). Il precursore marcato, CTP, mostra la mobi.......

Discussione

Il fattore più importante nel realizzare questi esperimenti è la disponibilità di enzima purificato altamente attiva. Durante il lavoro con GP4, per esempio, abbiamo scoperto che la memorizzazione dell'enzima purificato in tampone (20 mM fosfato di potassio, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT) contenente 50% glicerolo a -20 ° C porta ad una riduzione l'attività specifica del preparato nell'arco di pochi mesi. Pertanto ora flash congelamento piccole aliquote di gp4 purificato in 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl,.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tris cristalli preimpostati pH 7.5	SIGMA	T4128
Tris base	SIGMA	93362
L-Acido glutammico sale di potassio monoidrato	SIGMA	G1501
Cloruro di magnesio esaidrato	Mallinckrodt Chemicals	5958-04
1,4-Ditiotreitolo	J.T. Baker	F780-02
Sodio Dodecil Solfato	MP Biomedicals	811030
(Ethylenedinitrilo) Acido tetraacetico, sale disodico, diidrato	Mallinckrodt Chemicals	4931-04
[α-32P] CTP	PerkinElmer	BLU508H	radioattivo, adottare misure protettive
[γ-32P] ATP	PerkinElmer	BLU502A	radioattivo, adottare misure protettive
100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Affymetrix	77100	quattro dNTP parte del set
100 mM ATP e CTP	Epicentro	RN02825	parte del set NTP
costrutti ssDNA	DNA Technologies	N/A	sequenze personalizzate
metanolo	Macron Fine Chemicals	3017-08
formamide	Thermo Scientific	17899
blu bromofenolo	SIGMA	B8026
cilene xyanol	SIGMA	X4126
acrilammide	SIGMA	A9099	Tossico
N,N′ -Metilenebisacrilammide	SIGMA	M7279	Tossico
Urea	Boston Bioproducts	P-940
Acido borico	Mallinckrodt Chemicals	2549
Strumento a flusso rapido di estinzione	Kintek Corp.	RQF-3
Esploratore Kintek	Kintek Corp.	N/A
Kaleidagraph	Synergy Software	N/A

Integrated