Qui vi mostriamo un approccio enzimatico per isolare epatociti primari da topi adulti, e descriviamo la quantificazione di una risposta infiammatoria con ELISA e PCR in tempo reale.
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Articolo metodologico
L'induzione di una risposta infiammatoria in colture primarie epatociti di topi
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il fegato svolge un ruolo determinante nella regolazione dell'infiammazione sistemica. Nella malattia renale cronica in particolare, il fegato reagisce in risposta al ambiente uremico, stress ossidativo, endotossiemia e la clearance dell'amlodipina circolante citochine proinfiammatorie producendo un gran numero di proteine della fase acuta. strumenti sperimentali per studiare l'infiammazione e il ruolo di fondo di epatociti sono cruciali per comprendere la regolamentazione e il contributo di citochine epatiche ad una risposta di fase acuta sistemica e uno scenario pro-infiammatoria prolungata, particolarmente in un contesto complicato come la malattia renale cronica. Dal momento che lo studio complessi meccanismi di infiammazione in vivo rimane difficile, e di solito ad alta intensità di risorse richiede l'utilizzo di animali transgenici, epatociti isolati primari forniscono uno strumento robusto per acquisire conoscenze meccanicistici nella risposta della fase acuta epatica. Poiché questa tecnica in vitro offre costi contenuti, alta reproducibilità e la conoscenza tecnica comune, epatociti isolati primari possono anche essere facilmente utilizzato come un approccio di screening. Qui, descriviamo un metodo enzimatico-based per isolare epatociti murini primari, e descriviamo la valutazione di una risposta infiammatoria in queste cellule utilizzando ELISA e quantitativa real-time PCR.
Introduzione
Malattia renale cronica (CKD) può essere definita come uno stato di infiammazione acuta e cronica 1. Nei pazienti con insufficienza renale cronica, i livelli sierici del fattore di crescita dei fibroblasti ormone phosphaturic 23 (FGF23) progressivo aumento al fine di mantenere l'omeostasi fosfato sierico 2. L'aumento dei livelli sierici di FGF23 sono indipendentemente associati con la morbilità e mortalità cardiovascolare tra i pazienti che iniziano il trattamento di emodialisi 3, 4. Inoltre, diversi studi clinici hanno dimostrato una forte correlazione ....
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Protocollo
Tutti i protocolli di animali e procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) dell 'Università di Miami Miller School of Medicine.
1. Preparazione
- mezzi di perfusione epatica di preriscaldamento e fegato digerire media in un bagno d'acqua a 37 ° C.
- Impostare una pompa di perfusione (30 mL / min). precompilare con attenzione il sistema di tubi della pompa con mezzi di perfusione epatica. Evitare eventuali bolle d'aria nel sistema e preparare il microscopio stereotassica.
- Coat piatti di coltura cellulare utilizzando collagene di tipo I secondo il p....
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Risultati
Istologia
Immagini luce microscopia rappresentativi di cellule isolate e coltivate primarie sono descritte nella Figura 1A. Immunocytochemical analisi dimostra che epatociti isolati altamente esprimono albumina (rosso) e fattore di crescita dei fibroblasti receptor 4 (FGFR4) (verde). I nuclei sono colorati con 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (blu). (Figura 1B).
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Discussione
Isolando epatociti primari da topi è uno strumento veloce, economico e affidabile per studiare le risposte infiammatorie ex vivo. Se eseguita correttamente, i risultati possono essere facilmente generati e riprodotti in modo tempestivo ed economicamente efficiente. I seguenti punti devono essere attentamente valutati per assicurare un isolamento efficace.
L'incisione chirurgica e incannulamento della IVC devono essere eseguite in anestesia generale e non dopo l'eutanasia. Un.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal NIH (R01HL128714 a CF) e (F31DK10236101 a KS) e l'American Heart Association (CF e AG).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Consumabili | |||
| Cell Strainer 70 μ m Filtro cellulare in nylon | Falcon | 352350 | |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381412 | |
| 50 mL Tubo conico | in polipropilene Falcon | 352098 | |
| 100 Applicatori con punta in cotone da 6 pollici | Puritan | 806-WC | |
| 1cc U-100 Siringa da insulina 28 G 1/2 | Becton Dickinson | 329420 | |
| Piatto per colture tissutali 100 x 20 mm Stile | Corning | 353003 | |
| 6 pozzetti Cluster di coltura cellulare | Costar | 3516 | |
| 5/0 Seta chirurgica intrecciata nera (100 iarde) | LOOK | SP115 | |
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Equipment | |||
| Minipuls 3 Pompa di perfusione | Kit | F155007 | |
| , Propper | VWR | 48300-474 | |
| Occhiali di copertura per ematocitometro, Propper | VWR | 48300-470 | |
| Forbice chirurgiche - Affilate/smussate | F.S.T. | 14001-12 | |
| Forbici Iris-ToughCut Dritte | F.S.T. | 14058-11 | |
| Dumont SS-45 Pinze | F.S.T. | 11203-25 | |
| Pinze per tessuti per studenti | F.S.T. | 991121-12 | |
| Nome | Azienda | Numero catalogo | Comments |
| Reagents | |||
| Soluzione di acido acetico, 2.0 N | Sigma | A8976-100ML | |
| Isoflurano, USP 250 mL | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| KetaVed 1.000 mg/10 mL (100 mg/mL) | VEDCO | 50989-161-06 | |
| Xilazina 100 mg/mL | AnaSed Iniezione | 139-236 | |
| Terreno di Willams E (1x) | gibco | 12551-032 | |
| Terreno di perfusione epatica (1x) | gibco | 17701-038 | |
| Terreno di digestione epatica (1x) | Life Technologies | 17703034 | |
| Integratori per lo scongelamento e la placcatura degli epatociti primari Life | Technologies | CM3000 | |
| salina tampone fosfato CM4000 (PBS) pH 7,4 | ThermoFisher scientific | 10010031 | |
| Collagene di tipo 1 | Corning | 354236 | |
| Soluzione di tripano blu | VWR | 45000-717 | |
Riferimenti
- Silverstein, D. M. Inflammation in chronic kidney disease: role in the progression of renal and cardiovascular disease. Pediatr Nephro. 24 (8), 1445-1452 (2008).
- Isakova, T., et al. Fibroblast growth f....
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Ristampe e permessi
Tag
Isolamento di epatociti primaricultura di epatociti murinivalutazione della risposta infiammatoriarilevamento di citochine tramite ELISAPCR quantitativa in tempo realeprotocollo di trattamento con LPSstimolazione con FGF23analisi dell'espressione di IL6misurazione della secrezione di CRPmetodo di starvation degli epatociti
