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Articolo metodologico

Bioluminescenza e vicino infrarosso Imaging di neurite ottica e cervello infiammazione nel modello EAE della sclerosi multipla nei topi

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DOI:

10.3791/55321

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1 marzo 2017

 , 
1Institute of Clinical Pharmacology, University Hospital Frankfurt

In questo articolo

Sommario

Mostriamo una tecnica per bioluminescenza vivo in vivo e vicino infrarosso per immagini di neurite ottica ed encefalite nel modello di encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) per la sclerosi multipla in topi SJL / J.

Abstract

Encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) in SJL / J topi è un modello per la sclerosi multipla recidivante-remittente (RRMS). punteggi EAE clinici che descrivono i deficit delle funzioni motorie sono letture di base della infiammazione immuno-mediata del midollo spinale. Tuttavia, i punteggi e il peso corporeo non permettono una valutazione in vivo di infiammazione del cervello e neurite ottica. Quest'ultima è una manifestazione precoce e frequente in circa 2/3 dei pazienti con SM. Qui vi mostriamo i metodi per bioluminescenza e vicino infrarosso immagini dal vivo per valutare EAE evocato neurite ottica, infiammazione del cervello, e la barriera emato-encefalica interruzione (BBB) nei topi che vivono con un sistema di imaging in vivo in. Un substrato bioluminescente attivato da ossidasi soprattutto ha mostrato neurite ottica. Il segnale era specifico e ha permesso la visualizzazione degli effetti di farmaci e gli andamenti temporali di malattia, che in parallelo i punteggi clinici. nanoparticelle fluorescenti pegilato che sono rimasti all'interno del vasculature per lunghi periodi di tempo sono stati utilizzati per valutare l'integrità BBB. Vicino infrarosso di imaging rivelato una perdita BBB al picco della malattia. Il segnale era più forte intorno agli occhi. Un substrato vicino infrarosso per metalloproteinasi della matrice è stato utilizzato per valutare l'infiammazione EAE-evocato. Auto-fluorescenza interferiva con il segnale, che richiede unmixing spettrale per la quantificazione. Nel complesso, imaging bioluminescenza è un metodo affidabile per valutare neurite ottica e farmaci effetti EAE-associata e era superiore alle tecniche vicino infrarosso in termini di specificità del segnale, robustezza, facilità di quantificazione, e costo.

Introduzione

La sclerosi multipla è causata dall'attacco autoimmune mediato e dalla distruzione della guaina mielinica nel cervello e nel midollo spinale1. Con un'incidenza complessiva di circa 3,6 casi per 100.000 persone all'anno nelle donne e di circa 2,0 negli uomini, la SM è la seconda causa più comune di disabilità neurologica nei giovani adulti, dopo le lesioni traumatiche2,3. La patologia della malattia è causata da fattori genetici e ambientali4, ma non è ancora completamente compresa. I linfociti T autoreattivi entrano nel sistema nervoso centrale e innescano una cascata infiammatoria che provoca infiltrati focali nella sostanza bianca del cervello, del midollo spinale e del nervo ottico. Nella maggior parte dei casi, questi infiltrati sono inizialmente reversibili, ma la persistenza aumenta con il numero di recidive. Sono stati sviluppati numerosi modelli di roditori per studiare la patologia della malattia. L'EAE recidivante-remittente nei topi SJL/J e l'EAE primario-progressivo nei topi C57BL6 sono i modelli più popolari.

I punteggi EAE clinici, che descrivono l'entità dei deficit della funzione motoria, e il peso corporeo sono i gold standard per valutare la gravità dell'EAE. Questi segni clinici concordano con l'entità dell'infiltrazione delle cellule immunitarie e della distruzione della mielina nel midollo spinale e predicono moderatamente l'efficacia del trattamento farmacologico nell'uomo5. Tuttavia, questi segni riflettono principalmente la distruzione dei tratti di fibre ventrali nel midollo spinale. Attualmente, non esiste un metodo facile, non invasivo, affidabile e riproducibile per valutare l'infiltrazione cerebrale in vivo e la neurite ottica nei topi vivi.

L'imaging in vivo concorda con i principi 3 "R" di Russel e Burch (1959), che rivendicano una Replacement, Reduction, and Refinement of animal experiments6, perché l'imaging aumenta le letture di un animale in diversi punti temporali e consente una riduzione dei numeri complessivi. Attualmente, l'infiammazione o lo stato della mielina sono principalmente valutati ex vivo tramite immunoistochimica, analisi FACS o diversi metodi di biologia molecolare 7, che richiedono l'eutanasia di topi in momenti specifici.

Sono state sviluppate numerose sonde per sistemi di imaging in vivo per valutare l'infiammazione della pelle, delle articolazioni e del sistema vascolare. Le tecniche si basano sull'attivazione di substrati fluorescenti bioluminescenti o nel vicino infrarosso da parte delle perossidasi tissutali, tra cui la mieloperossidasi (MPO), le metalloproteinasi della matrice (MMP)8 e le catepsine9 o cicloossigenasi2. Queste sonde sono state convalidate principalmente in modelli di artrite o aterosclerosi9,10. Una sonda sensibile alla catepsina è stata utilizzata anche per l'imaging tomografico molecolare a fluorescenza di EAE11. Le MMP, in particolare MMP2 e MMP9, contribuiscono all'interruzione della BBB mediata dalla proteasi nell'EAE e sono sovraregolate nei siti di infiltrazione delle cellule immunitarie12, suggerendo che queste sonde possono essere utili per l'imaging EAE. Lo stesso vale per le sonde a base di perossidasi o catepsina. Tecnicamente, l'imaging dell'infiammazione nel cervello o nel midollo spinale è sostanzialmente più impegnativo perché il cranio o la colonna vertebrale assorbono segnali bioluminescenti e nel vicino infrarosso.

Oltre agli indicatori di infiammazione, sono state descritte sostanze chimiche fluorescenti, che si legano specificamente alla mielina e possono consentire la quantificazione della mielinizzazione13. È stato scoperto che una sonda fluorescente nel vicino infrarosso, lo ioduro di 3,3'-dietiltiatricarbocianina (DBT), si lega specificamente alle fibre mielinizzate ed è stato convalidato come strumento quantitativo in modelli murini di difetti di mielinizzazione primaria e in demielinizzazione evocata da cuprizone14. Nell'EAE, il segnale DBT era piuttosto aumentato, riflettendo l'infiammazione delle fibre mieliniche5.

Un ulteriore segno distintivo di EAE e MS è la degradazione della BBB, con conseguente aumento della permeabilità vascolare e stravaso di cellule del sangue, fluido extracellulare e macromolecole nel parenchima del SNC. Questo può portare a edema, infiammazione, danno agli oligodendrociti e, infine, demielinizzazione15,16. Pertanto, la visualizzazione della perdita di BBB utilizzando sonde fluorescenti, come l'album5, che normalmente si distribuiscono molto lentamente dal sangue al tessuto, può essere utile per valutare l'EAE.

Nel presente studio, abbiamo valutato l'utilità di diverse sonde in EAE e mostriamo la procedura per la tecnica bioluminescente più affidabile e robusta. Inoltre, discutiamo i pro e i contro delle sonde nel vicino infrarosso per l'attività MMP e l'integrità della BBB.

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Protocollo

1. EAE induzione in SJL / J topi

  1. Topi
    1. Utilizzare 11 settimane di età femminile SJL / J topi e consentire loro di abituano alla sala sperimentale per circa 7 giorni. Utilizzare n = 10 topi per gruppo.
    2. Per la valutazione degli effetti di farmaci, somministrare il farmaco e placebo per il gruppo di controllo in continuo tramite l'acqua potabile o tramite pellet cibo a partire 3 o 5 giorni dopo l'immunizzazione (n = 10 per gruppo). Durante il picco della malattia, somministrare farmaci o placebo con latte o 3% corn flakes acqua zucchero-imbevuti.
  2. materiale Immunizzazione
    1. Utilizzare un kit di induzione EAE costituito da antigene (peptide di proteine ​​proteolipid, PLP139-151, 1 mg / emulsione ml) in una emulsione con adiuvante completo di Freund (CFA, ucciso al calore Mycobacterium tuberculosis H37 Ra) e 2 flaconi (5 mcg ciascuna) di liofilizzato tossina della pertosse (PTX).
    2. Sciogliere il PTX (2 mg / ml) in 1x PBS (PBS, cioè, </ Em> aggiungere 1,5 ml di PBS in ogni provetta PTX, mescolare bene, togliere con la stessa punta della pipetta, e aggiungere 1 ml di PBS in un tubo da 50 ml); mescolare bene.
  3. Immunizzazione
    1. Iniettare PLP / CFA sottocutanea in 2 porzioni, ciascuna di 100 microlitri, sia alla base della coda. Non iniettare nella parte posteriore del collo, in quanto eventuali reazioni immunitarie della pelle nella parte superiore della schiena o al collo disturberanno l'imaging della testa e del midollo spinale.
    2. Iniettare 100 ml di PTX per via intraperitoneale (ip), due volte al mouse, il primo 1 - 2 ore dopo la vaccinazione e il secondo a 24 ore.
    3. Per i topi di controllo, iniettare CFA senza PLP (2 porzioni di 100 ml) più PTX senza PLP.
  4. La gestione del mouse dopo la vaccinazione
    1. Pesare il mouse ogni altro giorno fino al giorno 7, si pesa quotidianamente.
      NOTA: I topi perdono circa 1 - 2 g di peso corporeo durante EAE. Il declino segna l'inizio della EAE.
    2. Valutare i sintomi clinici giorno tutti i giorni dalle 7 accordozione ai sistemi di valutazione standard (ad esempio, Score 0: nessuna modifica evidenti funzioni motorie; segnare 0,5: la paralisi distale della coda; segnare 1: paralisi completa della coda; segnare 1.5: paresi lieve di una o entrambe le zampe posteriori; punteggio 2: grave paralisi delle zampe posteriori; segnare 2,5: completa paralisi di una gamba posteriore; segnare 3: paralisi completa di entrambe le zampe posteriori; segnare 3,5:. paralisi completa delle zampe posteriori e la paresi di una gamba anteriore euthanize topi con i punteggi di 3.5 o superiore per > 12 h.
  5. Naturalmente e ora di imaging EAE
    1. Eseguire la prima di imaging al momento della comparsa della malattia, quando i topi raggiungono punteggi> 1, che avverrà intorno al giorno 10 - 12 dopo la vaccinazione.
    2. Eseguire il secondo di imaging al picco, che sarà raggiunto 1 o 2 giorni dopo i sintomi iniziali sviluppano e durerà per 1 - 3 giorni.
      NOTA: In seguito, i topi recuperare completamente entro 7 a 10 giorni. Imaging durante gli intervalli può ancora mostrare perdite vascolari,ma gli indicatori di infiammazione dovrebbe essere negativo.

2. Bioluminescent Imaging e vicino infrarosso di neurite ottica e cervello Infiammazione

  1. Impostazione del sistema di imaging
    1. Eseguire imaging in vivo con qualsiasi apparecchiatura che consente l'analisi della bioluminescenza e segnali ad infrarossi.
    2. Mantenere i topi sotto 2-2,5% isoflurano anestesia durante tutte le procedure di imaging.
    3. Posizionare una o due topi accanto all'altra nell'apparato utilizzando le forniture di gas di mezzo. Posizionare il rachide superiore al centro.
    4. Usare due mouse contemporaneamente, uno per gruppo, per la valutazione degli effetti di farmaci per confrontare coppie. Questo è importante per l'imaging bioluminescente.
    5. Schermare il sito dell'immunizzazione con panno nero e prendere un'immagine di fotografia e basale per valutare il corretto posizionamento dei mouse / mice. Utilizzare il B-fuoco con una distanza di 6,5 cm per la macchina fotografica per tutte le immagini.
  2. Iniezione e di imaging di sonda infiammazione bioluminescente
    1. Utilizzare le impostazioni del sistema di imaging in vivo in: Epi-BLI, Em filtro aperto, blocco di filtro Ex, fstop 1, binning 8, concentrarsi B = 6,5 cm, annunci di esposizione 120 s; prendere una immagine di base.
    2. Iniettare 100 microlitri ip del reagente chemiluminescente ready-to-use (40 mg / mL). Mescolare bene prima di riempire la siringa.
    3. Catturare immagini bioluminescenza 5, 10, e 15 minuti dopo l'iniezione. L'andamento temporale del picco bioluminescente differisce tra gli animali.
      NOTA: Il picco si verificherà 5 - 10 minuti dopo l'iniezione; un calo a 15 min indica che ulteriori immagini sono necessarie. Utilizzare coppie murini di controllo e di trattamento gruppi per eliminare distorsioni minori a causa di diversi corsi di tempo.
    4. Compilare descrizioni rilevanti per l'esperimento. Osservare una finestra di dialogo pop-up automatico; include informazioni come ceppo di topi, sesso, punto di tempo, il tempo di iniezione sonda, gruppo, ecc. Salvare i file in tutto ocartella ne; avranno i tag di tempo e tutte le descrizioni.
  3. Iniezione e di imaging di nanoparticelle fluorescenti vicino infrarosso per l'integrità BBB
    1. Utilizzare l'imaging epifluorescenza vicino infrarosso nel B-focus (distanza: 6.5 cm). I massimi di eccitazione / emissione di nanoparticelle fluorescenti pegilati sono 675/690 nm. Catturare due immagini a diverse lunghezze d'onda, a Ex640 / Em700 e Ex675 / Em720; utilizzare un 2-s esposizione, binning 8, e fstop 2. Prendere una immagine di base.
    2. Iniettare 70 ml di nanoparticelle fluorescenti infrarossi pegilati iv attraverso la vena della coda e immaginare il mouse 3 ore e 24 ore dopo l'iniezione utilizzando le impostazioni di cui sopra. Mescolare il pozzo soluzione prima di riempire la siringa.
    3. Iniettare cloruro di sodio allo 0,9% in topi di controllo, che saranno necessarie per valutare la specificità del segnale.
  4. Iniezione e immagini della sonda vicino infrarosso fluorescente per l'attività MMP
    1. La barba o depilare la testa e uregione della colonna vertebrale pper cautamente un giorno prima di prendere l'immagine di base. La pelle non deve essere ferito.
    2. Utilizzare l'imaging epifluorescenza vicino infrarosso nel B-focus (distanza: 6.5 cm). I massimi di eccitazione / emissione della sonda attivabile MMP sono 680/700 nm. Catturare due immagini a diverse lunghezze d'onda, a Ex640 / Em700 e Ex675 / Em720; utilizzare un 1-s esposizione, binning 8, e fstop 2. Prendere una immagine di base.
    3. Aggiungere 200 ml di PBS 1x al tubo 1,5 ml della soluzione pronta per l'uso (20 nmol / 1,5 ml in PBS 1x) in modo che sia sufficiente per 10 topi; mescolare bene prima di riempire la siringa.
      NOTA: Il volume disponibile non tiene conto del fatto che alcune volume perso durante il riempimento della siringa e iniezione.
    4. Iniettare 150 ml di iv sonda attraverso la vena della coda 24 ore prima di imaging. Iniettare PBS solo in animali di controllo per valutare la specificità del segnale.
    5. A 24 ore dopo l'iniezione, prendere immagini Epi-FL almeno a due lunghezze d'onda, Ex640 / Em700 e Ex 675 / EM720, con le impostazioni spiegato in precedenza (1-s di esposizione, messa a fuoco B, binning 8, e fstop 2).
      NOTA: L'uso di due lunghezze d'onda permette unmixing spettrale sottraendo il segnale aspecifico.

3. Analisi Immagine

  1. Analisi bioluminescenza (BLI)
    1. Fare doppio clic sul software per aprirlo.
    2. Nella barra dei menu in alto, fare clic sull'icona del browser di file, passare alla directory della cartella dell'esperimento, e selezionarlo; questo aprirà tutti i file nella cartella in una tabella.
    3. Configurare le colonne che mostrano le descrizioni rilevanti per l'esperimento.
    4. Per il controllo di qualità, fare doppio clic su un file di un mouse non-responder, senza sintomi di EAE e / o un mouse ingenuo di verificare la specificità dei segnali EAE.
      NOTA: Non ci dovrebbe essere alcun segnale in topi naive e di segnale minima nei topi non-responder.
      1. Controllare l'immagine di base prima che l'iniezione del proa ciascuno mouse come ulteriore controllo della specificità del segnale; dovrebbe essere negativo.
    5. Per selezionare un'immagine, fare doppio clic sul primo file del primo mouse EAE e controllare l'intensità bioluminescente (LUT gamma bar) e la localizzazione. Controllare tutte le immagini una per una. Chiudere il file con l'intensità più basso per ogni mouse (ad esempio, tenere 2 su 3 immagini per ogni mouse).
    6. Regolazione immagine e l'esportazione
      1. Fare doppio clic sul primo file da quantificare. Osservare una nuova finestra pop-up. Sotto "opzioni" (menu in alto), personalizzare le etichette per visualizzare in ogni immagine.
      2. Nella palette strumento giusto, andare a "Regolazione immagine". Per impostazione predefinita, le intensità minime e massime sono impostati su "auto" e visualizzati in arcobaleno pseudocolori. Selezionare "manuale" per modificare le impostazioni, se necessario.
        NOTA: Per esempio, tutte le immagini esportate possono avere barre identici LUT (minimi identici e maxima) per essere facilmente comparabili.La regolazione dei minimi e massimi non ha alcun impatto sui risultati quantitativi.
      3. Clicca su esportazione delle immagini, selezionare png, la directory e un nome di immagine
    7. Quantificazione delle Regioni di interesse (ROI)
      1. Vai allo strumento "ROI" nella palette degli strumenti. Selezionare il metodo di ROI (cerchio, rettangolare, auto, o mano libera) e il numero di ROI. Osservare la finestra ROI pop-up nella finestra dell'immagine.
      2. Utilizzando il mouse, regolare le dimensioni e la posizione. Utilizzare soglie ROI identici per tutte le immagini se si utilizza lo strumento di auto-ROI. Utilizzare aree identiche per tutte le immagini se le dimensioni e le posizioni di ROI sono definite manualmente (ad esempio, ROI circolari).
      3. Clicca su "Misura RO.I. Osservare una nuova finestra pop-up. Personalizzare le colonne (ad esempio, il nome del file, il numero degli animali, il gruppo, esperimento, zona, conteggi totali, conte medie, conteggi SD, min e max conta, zona, tempo punto, il tempo di iniezione della sonda, ecc.) Salvare le impostazioni personalizzate. Quando reAdy, selezionare tutto (Ctrl + A), e copiare e incollare la tabella in un foglio di calcolo.
      4. Esportare l'immagine come png con le ROI in atto. Salvare e chiudere il file di immagine.
    8. Ripetere la procedura (punti 3.1.6 - 3.1.7) per tutti i file di immagini che devono essere quantificati. Copiare tutti quantificazioni ROI nel foglio di calcolo.
      NOTA: Qui, i risultati possono essere ordinati per gruppo, punto di tempo, ecc e analizzati statisticamente. Utilizzare i conteggi totali di segnali bioluminescenza nella ROI per le analisi statistiche.
  2. Near-Infrared (NIR) analisi delle nanoparticelle fluorescenti
    1. Utilizzando i controlli nel software, regolare la soglia dell'immagine.
      NOTA: Ciò non ha alcun impatto sul risultato quantitativo.
    2. confrontare visivamente le immagini catturate a Ex / Em 675/720 e Ex / Em 640/700 per valutare la specificità del segnale.
    3. Utilizzare le immagini catturate a Ex / Em 675/720 per l'analisi quantitativa (massima eccitazione: 680 nm). Definire ROI, per le quali può essere utilizzato lo strumento di auto-ROI. Regolare la soglia di auto-ROI e utilizzarlo per tutte le immagini. Quantificare l'efficienza totale radiante a ROI (vedi punto 3.1).
  3. Near-Infrared (NIR) analisi della sonda proteasi sensibili
    1. Utilizzando controlli software, regolare la soglia dell'immagine.
      NOTA: Ciò non ha alcun impatto sul risultato quantitativo. Eseguire unmixing spettrale della auto-fluorescenza. Lo strumento unmixing è implementato in Living immagine. L'auto-unmixing utilizza l'Ex / Em 640/700 come specifico e 675/720 come l'immagine auto-fluorescente.
    2. Selezionare l'immagine non miscelato e definire le ROI, come descritto sopra. Utilizzare l'efficienza radiante totale nel ROI per le analisi quantitative e statistiche.

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Risultati

Andamento temporale della bioluminescenza di neurite ottica

Il segnale della sonda bioluminescenza infiammazione era il più forte attorno agli occhi e si è verificato esclusivamente in topi EAE con neurite ottica. Un segnale si è verificato nel né i topi non EAE né i topi non iniettati con la sonda infiammazione. Il segnale è scomparso quando i topi recuperato. Quindi, il segnale è specifico per neurite ottica...

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Discussione

Il presente video mostra le tecniche di bioluminescenza e fluorescenza nel vicino infrarosso imaging in vivo di EAE in topi SJL / J. Abbiamo dimostrato che l'imaging bioluminescenza utilizzando una sonda infiammazione sensibile mostra principalmente neurite ottica, e la quantificazione concorda con la valutazione clinica di EAE gravità e gli effetti del farmaco. Tuttavia, il metodo di imaging bioluminescenza non era in grado di rilevare l'infiammazione del midollo spinale lombare, che è un sito primario...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata sostenuta dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC1039 A3) e il programma di finanziamento della ricerca "Landesoffensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) dello Stato di Hessen, Centro di Ricerca per traslazionale Medicina e Farmacologia TMP e la Else Kröner-Fresenius Fondazione (EKFS), Gruppo formazione mediante la ricerca traslazionale Research Innovation - Pharma (TRIP).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AngioSpark-680Perkin Elmer, Inc., Waltham, USANEV10149Sonda di imaging, nanoparticelle pegilate, utile per l'imaging dell'integrità della barriera ematoencefalica
MMP-sense 680Perkin Elmer, Inc., Waltham, USANEV10126Sonda di imaging, attivabile dalle metalloproteinasi della matrice, utile per l'imaging dell'infiammazione
XenoLight RediJect Inflammation ProbePerkin Elmer, Inc., Waltham, USA760535Sonda di imaging, attivabile dalle ossidasi, utile per l'imaging dell'infiammazione
PLP139-151/CFA emulsione Hooke Labs, St Lawrence, MAEK-0123Kit di induzione EAE
Tossina pertosseHooke Labs, St Lawrence, MAEK-0123Kit di induzione EAE
IVIS Lumina SpectrumPerkin Elmer, Inc., Waltham, USASistema di imaging a bioluminescenza e infrarossi
Software LivingImage 4.5Perkin Elmer, Inc., Waltham, Stati UnitiCLS136334Software di analisi IVIS
IsofluraneAbbott Labs, Illinois, Stati Uniti26675-46-7Anestetico

Riferimenti

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