Questo protocollo descrive cloacal massaggio, tecnica manuale non invasiva per la raccolta di sperma da uccelli ed estrazione di DNA da aviaria dello sperma usando un kit di estrazione commerciale con modifiche.
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Articolo metodologico
Raccolta dello sperma aviaria Cloacal massaggi e isolamento di DNA da sperma
In questo articolo
Sommario
Abstract
Raccolta di sperma può essere utile per una vasta gamma di applicazioni, tra cui studi su qualità dello sperma, sperma del telomero dinamiche e l'epigenetica. Gli uccelli sono soggetti ampiamente usati nella ricerca biologica e sono ideali per studi condotti su campioni di sperma ripetuti. Tuttavia, poche risorse sono disponibili per coloro che desiderano imparare a raccogliere ed estrarre DNA da sperma aviaria. Qui descriviamo cloacal massaggio, una tecnica manuale dolce, non invasiva per la raccolta dello sperma aviaria. Anche se questa tecnica è stabilita nella letteratura, può essere difficile da imparare dalle descrizioni disponibili. Forniamo anche informazioni per l'estrazione del DNA da aviaria sperma usando un kit di estrazione commerciale con modifiche. Massaggi cloacal possono essere facilmente utilizzato su qualsiasi uccello maschio medio-piccole in condizione riproduttiva. Dopo il prelievo, lo sperma può essere utilizzato immediatamente per saggi di motilità, o bloccato per l'estrazione del DNA seguendo il protocollo descritto nel presente documento. Questo protocollo di estrazione è stato perfezionato per aviaria sperma ed è stato utilizzato con successo su campioni raccolti da diverse specie di passeriformi (Passer domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanuse Turdus migratorius ) e un columbid (Columba livia).
Introduzione
Gli uccelli sono soggetti ideali per studi su qualità dello sperma e concorso1, sperma del telomero dinamica2, epigenetica3e argomenti simili, come essi sono ampiamente utilizzati nella ricerca biologica e dello sperma può essere facilmente campionato utilizzando cloacal massaggi. Cloacal massaggio è una tecnica manuale dolce, non invasiva per la raccolta dello sperma da uccelli4,5,6. Campioni ripetuti possono essere ottenuti facilmente e attrezzi speciali non sono necessari, che lo rende semplice da eseguire nel campo o nel laboratorio. Anche se cloacal massaggi sono stato in uso per decenni, è difficile da imparare dalla scritta descrizioni disponibili. Questa pubblicazione è intesa a ridurre il tempo e l'incertezza coinvolti nell'apprendimento massaggi cloacal.
Lo sperma raccolto da uccelli utilizzando cloacal massaggio può essere utilizzato immediatamente per motilità valutazione4,7 o8di inseminazione artificiale, o congelato per altri usi come imaging avanzato e l'estrazione del DNA. Campioni di liquido seminale da uccelli passeriformi sono piccoli ma contengono sperma densamente imballato. Il DNA è estratto usando un kit di estrazione commerciale per semplicità, con modifiche per superare le caratteristiche protettive specializzate di sperma9. Dopo l'estrazione, i telomeri dello sperma possono essere misurati usando qPCR10.
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Protocollo
Questo protocollo coinvolge soggetti animali vertebrati ed è stato approvato dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) North Dakota State University.
1. centri di raccolta da un uccello passeriforme utilizzando cloacal massaggi
Nota: Cloacal massaggio è una tecnica di raccolta di sperma efficace sugli uccelli riproduttivo attivi solo, ma può essere eseguita correttamente di fuori della stagione riproduttiva nelle opportune situazioni in cattività. Attività riproduttiva deve essere determinata per specie di destinazione prima di utilizzare massaggio cloacal. Questa tecnica può essere utilizzata su uccelli selvatici al momento cattura o sugli uccelli tenuti in cattività.
- A partire con un uccello maschio, (in condizioni di allevamento) presa di Bonetti nella mano non dominante, trasferire l'uccello alla mano dominante con il lato ventrale toccando il palmo (Figura 1).
- Assicurarsi che la testa dell'uccello è più vicino il bordo laterale del palmo della mano. Garantire leggermente la testa e il corpo utilizzando il mignolo, anello e le barrette centrali. Questo lascia l'uccello dello sfiato e coda esposti.
- Lasciare le gambe d'uccello sciolti o leggermente trattenuto usando il palmo.
Figura 1 : Presa per massaggi cloacal. L'uccello è protetto con leggerezza nella mano dominante con il lato ventrale toccando la Palma e la testa, protetta dal dito mignolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Posizionare l'indice e pollice dominante su entrambi i lati dell'estremità superiore della cloaca e leggermente avvicinare le dita esercitando una pressione molto lieve verso la coda ( Figura 2). La cloaca sarà evert, esponendo la mucosa cloacale (interni rosa).
Nota: Se l'uccello non è attualmente in produzione dello sperma, la protuberanza cloacal può essere piccola e la cloaca è difficile da evert. Con esperienza, è facile distinguere tra il cloacas i maschi riproduttivi attivi e inattivi5,11.
Figura 2 : Dito posizione e protuberanza cloacal. Evert cloaca applicando leggera pressione all'estremità superiore (A). In un passeriforme maschio riproduttivo attivo, è evidente la protuberanza cloacale e impresa (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Con la mano non dominante, posizionare il cuscinetto del dito indice sul lato dorsale della base della coda per stabilizzare la mano e quindi posizionare la punta del pollice appena sotto la cloaca anteverso.
Nota: Una miniatura corta e liscia è vantaggiosa per l'esecuzione di massaggi cloacal e protegge l'uccello da un infortunio accidentale. - Spostare il pollice non dominante cranialmente e profondo in un movimento ripetitivo con media pressione, restando di sotto della cloaca. Continuare fino a quando l'uccello eiacula. A seconda dell'individuo, ciò avviene in genere tra 1 e parecchi dozzina colpi.
- Non appena l'uccello eiacula, raccogliere lo sperma in un tubo di microhematocrit. Ripetere cloacal massaggio per ottenere più eiacula.
Nota: Lo sperma passeriforme è marrone chiaro e in genere ha una consistenza piuttosto densa. Bianche o scure sostanze espulsione dalla cloaca non sono lo sperma e potrebbero contaminare il campione di sperma. L'aspetto di una piccola quantità di sangue sulla cloaca o misto in con lo sperma è solitamente causato da troppa pressione durante il massaggio. - Per estrazione del DNA, è possibile inserire lo sperma in un tubo del microcentrifuge con 20 µ l di 1X PBS (pH 7.4). Nota: Semen memorizzati in 1X PBS non è adatto per l'inseminazione artificiale, ma può essere utilizzato per l'estrazione di DNA in un secondo momento quando conservato a-80 ° C. Il PBS può essere a temperatura ambiente o refrigerati, ma dovrebbe essere in uno stato liquido quando viene depositato il campione di sperma.
- Confermare la presenza di spermatozoi nel campione visualizzando una piccola quantità del campione diluito sotto un microscopio composto (Figura 3).
- Conservare lo sperma diluito a-80 ° C fino all'estrazione.
2. estrazione di DNA da sperma di uccello
Nota: Questo protocollo è stato testato con più kit commerciali di estrazione del DNA, ma ha solo avuto successo quando viene utilizzato con un DNA kit12. Passaggi che vengono modificati dal protocollo kit sono indicati da *.
- Preparare una soluzione 1 M di ditiotreitolo (DTT) in acqua e mescolare usando un vortex.*
- Aliquota della soluzione DTT e conservare a-20 ° C fino a immediatamente prima dell'uso. Ogni campione deve essere estratto richiede 10 µ l di soluzione di 1m DTT
- Preparare un tampone contenente 20 mM Tris-Cl, pH 8.0; 20 mM EDTA; 200 mM NaCL; e 4% SDS. Ogni campione deve essere estratto richiede 90 µ l di questa buffer.*
- Conservare il tampone a temperatura ambiente. Se è precipitato, riscaldarlo a 56 ° C per dissolve.*
- Preriscaldare un incubatore contenente un rocker o agitatore a 65 ° c. *
- Immediatamente prima di iniziare l'estrazione, mescolare 10 µ l di soluzione DTT con 90 µ l di tampone preparata al punto 2.2 per ciascun campione da estrarre, ad esempio 900 µ l di tampone più 100 µ l di soluzione DTT se l'estrazione di 10 campioni. Questa miscela si chiamerà DTT-buffer.*
- Aggiungere 70 µ l 1X PBS per il campione di sperma diluito intero e mescolare bene con un vortex.*
- Aggiungere 100 µ l DTT-buffer e 10 µ l di soluzione di proteinasi K al campione. Vortice per 20 secondi, quindi Incubare in incubatrice preriscaldato per 1 ora su un bilanciere o shaker.*
- Aggiungere 200 µ l tampone AL e 200 µ l fresco EtOH (100%) e vortex per 20 seconds.*
- Trasferire l'intero campione a una colonna di spin e centrifugare a 1 minuto a 6.000 x g. gettare la provetta di raccolta.
- Posizionare la colonna su un tubo nuovo e aggiungere 500 µ l preparati buffer AW1. Centrifugare 1 minuto a 6.000 x g. gettare la provetta di raccolta.
- Posizionare la colonna su un tubo nuovo e aggiungere 500 µ l preparati buffer AW2. Centrifugare per 1 minuto a 6.000 g. x eliminare il flusso continuo e posto la colonna posteriore sul tubo.
- Centrifugare per 3 minuti a 20.000 x g. gettare il tubo di raccolta e posizionare la colonna in una microcentrifuga da 1,5 mL.
- Dispensare 35 µ l di AE buffer direttamente sulla membrana di colonna e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. *
- Centrifugare 1 minuto a 14.000 x g. gettare la colonna di spin e conservare i campioni estratti a-80 ° C.
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Risultati
Cloacal massaggi e DNA estrazione utilizzando che il protocollo descritto è stato eseguito su diverse specie di passeriformi e uno columbid (tabella 1). Visualizzando una piccola quantità di campioni diluiti sotto un microscopio composto a 400 ingrandimenti (Figura 3) è stata confermata la presenza di spermatozoi nel seme campioni raccolti da massaggio cloacal. Dopo l'estrazione del DNA dai campioni di sperma raccolto da passeri della camera ...
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Discussione
Descriviamo un metodo semplice e affidabile per la raccolta dello sperma da uccelli di piccoli e medi in stato riproduttivo attivo ed estrazione di DNA da sperma aviaria.
Il protocollo di estrazione del DNA dello sperma descritto viene modificato da un kit per semplicità, ma è stato perfezionato per l'uso su sperma aviaria. Gli spermatozoi sono resistenti alla lisi di estrazione standard prodotti chimici9,13, e campioni di sperma racco...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Grazie Jose Noguera per intervento tempestivo con massaggio cloacal, e Jeffrey Kittilson per il laboratorio di supporto. Questo lavoro è stato supportato da un premio di ND EPSCoR FAR0022429 a BJH. Spese di pubblicazione sono stati generosamente sostenute dal dipartimento di scienze biologiche di NDSU.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette capillari per microematocrito | Fisherbrand | 22-362566 | È possibile utilizzare qualsiasi fornitore. Provette più piccole possono essere più efficaci per la raccolta di piccoli campioni di sperma, ad esempio da uccelli passeriformi molto piccoli come il passero scheggiatore. |
| Provette per microcentrifuga | Qualsiasi | ||
| 1x PBS | Qualsiasi | Utilizzato per conservare i campioni di sperma prima dell'estrazione del DNA. | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | Qualsiasi fornitore può essere utilizzato. |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1233508 | È possibile utilizzare qualsiasi fornitore. |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | È possibile utilizzare qualsiasi fornitore. |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | È possibile utilizzare qualsiasi fornitore. |
| Kit micro QIAamp DNA | Qiagen | 56304 | Il kit micro Qiagen QIAamp DNA è consigliato in modo specifico. Questo protocollo di estrazione del DNA è stato tentato con altri kit commerciali, ma con scarso successo. Le ragioni di ciò ci sono sconosciute. |
Riferimenti
- Briskie, J. V., Montgomerie, R. Sperm size and sperm competition in birds. Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).
- Monaghan, P. Telomeres and life histories: the long and the short of it. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).
- Carrell, D. T. Epigenetics of the male gamete. Fertility and Sterility. 97 (2), 267-274 (2012).
- Burrows, W. H., Quinn, J. P. The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey. Poultry Science. 16 (1), 19-24 (1937).
- Wolfson, A. The cloacal protuberance: a means for determining breeding condition in live male birds. Bird-Banding. 23 (4), 159-165 (1952).
- Kast, T. L., Ketterson, E. D., Nolan, V. Variation in ejaculate quality in dark-eyed juncos according to season, stage of reproduction, and testosterone treatment. The Auk. 115 (3), 684-693 (1998).
- Helfenstein, F., Podevin, M., Richner, H. Sperm morphology, swimming velocity, and longevity in the house sparrow Passer domesticus. Behav. Ecol. Sociobiol. 64, 557-565 (2010).
- Purchase, C. F., Earle, P. T. Modifications to the IMAGEJ computer assisted sperm analysis plugin greatly improve efficiency and fundamentally alter the scope of attainable data. J. Appl. Icthyol. 28, 1013-1016 (2012).
- Gill, P., Jeffreys, A. J., Werrett, D. J. Forensic application of DNA 'fingerprints'. Nature. 318 (12), 577-579 (1985).
- Criscuolo, F., et al. Real-time quantitative PCR assay for measurement of avian telomeres. J. Avian Biol. 40, 342-347 (2009).
- Lovette, I. J., Fitzpatrick, J. W. Cornell Lab of Ornithology Handbook of Bird Biology, 3rd Edition. , Wiley-Blackwell, Princeton University Press. ISBN 9781118291047 (2016).
- QIAamp DNA Micro Handbook. , Third edition (2014).
- Carter, K. L., Robertson, B. C., Kempenaers, B. A differential DNA extraction method for sperm on the perivitelline membrane of avian eggs. Mol. Ecol. 9, 2149-2154 (2000).
- Birkhead, T. R., Buchanan, K. L., Devoogd, T. J., Pellatt, E. J., Catchpole, C. K. Song, sperm quality and testes asymmetry in the sedge warbler. Anim. Behav. 53, 965-971 (1997).
- Lüpold, S., Calhim, S., Immler, S., Birkhead, T. R. Sperm morphology and sperm velocity in passerine birds. Proc. R. Soc. B. 276, 1175-1181 (2009).
- Samour, J. H., Smith, C. A., Moore, H. D., Markham, J. A. Semen collection and spermatozoa characteristics in budgerigars (Melopsittacus undulates). Vet. Rec. 118, 397-399 (1986).
- Stelzer, G., Crosta, L., Bürkle, M., Krautwalt-Junghanns, M. E. Attempted semen collection using the massage technique and semen analysis in various psittacine species. J. Avian Med. Surg. 19 (1), 7-13 (2005).
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Ristampe e permessi
