Una Camera Semplice per l'Imaging Confocale a lungo termine dello sviluppo di radici e ipocotili

Sommario

Presentata qui è una tecnica semplice per l'imaging rapido a tempo determinato di elevata risoluzione di sviluppo radicale e ipocotile per un massimo di 3 giorni utilizzando elevati obiettivi di apertura numerica e perfluorodecalin come mezzo di immersione.

Abstract

Diversi aspetti dello sviluppo delle piante, come la morfogenesi laterale della radice, si verificano in termini di tempo di diversi giorni. Per studiare i sottostanti processi cellulari e subcellulari, sono necessarie strategie di microscopia ad alta risoluzione che conservano condizioni fisiologiche. I tessuti vegetali devono avere adeguata nutrizione e approvvigionamento idrico con uno scambio gassoso sostenuto, ma, sommersi e immobilizzati sotto una copertura, sono particolarmente suscettibili all'anossia. Una strategia che è stata impiegata con successo è l'utilizzo di un sistema di perfusione per mantenere un'offerta costante di ossigeno e sostanze nutritive. Tuttavia, tali disposizioni possono essere complicate, ingombranti e richiedono attrezzature specializzate. Presentata qui è una strategia alternativa per un semplice sistema di imaging utilizzando perfluorodecalin come mezzo di immersione. Questo sistema è facile da installare, richiede un'attrezzatura minima ed è facilmente montato su uno stadio microscopico, permettendo di impostare e produrre diverse telecamere in parAllel. In questo sistema, i tassi di crescita della radice laterale sono indistinguibili dai tassi di crescita in condizioni standard sulle piastre agariche per i primi due giorni e la crescita laterale della radice continua a tassi ridotti per almeno un altro giorno. I tessuti vegetali vengono forniti con sostanze nutritive attraverso una lastra di agar che può essere utilizzata anche per somministrare una gamma di composti farmacologici. Il sistema è stato stabilito per monitorare lo sviluppo laterale della radice, ma è facilmente adattabile all'immagine di altri organi vegetali come ipocotili e radici primarie.

Introduzione

Per studiare processi cellulari e subcellulari che sono alla base dello sviluppo delle piante, esiste una crescente domanda di strategie a lungo termine ad alta risoluzione a lungo termine. Una sfida fondamentale in questi esperimenti di imaging è il mantenimento delle condizioni fisiologiche, incluso lo scambio di gas sufficiente, più una fornitura di acqua e sostanze nutritive ^{1 , 2 , 3} . Per utilizzare obiettivi con alte aperture numeriche per una risoluzione ottica ottimale, i campioni devono essere posizionati in prossimità e orientati in parallelo alla copertina. Il movimento in x, y e z dovrebbe essere idealmente minimo durante l'imaging.

Mentre le piantine sono spesso montate in acqua o soluzione acquosa per imaging a breve termine, l'acqua ha una bassa capacità di dissoluzione di CO ₂ e O ₂ (1,54 mg / ml e 0,04 mg / ml rispettivamente a 20 ° C, 0,1 MPa) ⁴ , che rendeÈ inadatto per esperimenti di time-lapse prolungati. I sistemi di perfusione che mantengono livelli costanti di ossigeno e sostanze nutrienti sono una soluzione a questo problema e sono state sviluppate per la microscopia confocale a scansione laser (CLSM) ^{1 , 2 , 3} e la microscopia a foglio leggero (LSM) ⁵ . Sistemi come il RootChip ² e il RootArray ³ sono stati progettati appositamente per l'imaging di tempi di sviluppo delle radici e coinvolgono germinazione dei semi in un dispositivo multi-specimen su misura. Questi accordi assicurano una minima perturbazione meccanica e sono progettati per l'analisi parallela di piantine multiple, ma non ottimizzate per l'imaging di strutture subcellulari. Calder e colleghi hanno progettato una camera di imaging più complessa a base di perfusione ottimizzata per l'imaging di strutture subcellulari in cui il campione è tenuto in posizione da una magliaPer consentire l'utilizzo di lenti ad alta immersione di ingrandimento ¹ .

Presentata qui è una soluzione alternativa e semplice a questo problema che non si basa sui sistemi di perfusione, ma utilizza perfluorodecalina (PFD), un perfluorocarbon che ha recentemente guadagnato la popolarità come mezzo di montaggio per l' imaging Arabidopsis ^{6 , 7 , 8} . In tali applicazioni, l'elevata capacità di PFD per la dissoluzione di CO ₂ e O ₂ (1,9 g / mL per O ₂ in PFD rispetto a 0,04 mg / ml in acqua) ⁹ , consente lo scambio gassoso dal tessuto immerso. Inoltre, il PFD non è fluorescente e il suo indice di rifrazione (1.313) è paragonabile a quello dell'acqua (1.333) ed è più vicino a quello del citosolo (~ 1.4) rispetto all'aria (1.000) ⁶ . Perfluorocarburi sono stati riportati di avere un effetto fisiologico minimo su una varietà di piante e piante tI numeri ⁶ , con i semi di ravanello che germogliano prontamente quando immersi in PFD e che presentano una normale crescita e sviluppo per almeno due giorni interi quando sono forniti con acqua ¹⁰ . Sono state fatte osservazioni analoghe per germinare i semi di Arabidopsis ⁶ . Sulla base dello spargimento Raman stimolato per rappresentare direttamente la distribuzione di PFD nei tessuti delle foglie di Arabidopsis dopo l'infiltrazione, Littlejohn e colleghi concludono che la PFD non è probabilmente occupata dalle cellule vive ⁸ . PFD è stato precedentemente utilizzato principalmente per i tessuti aerei di immagine, dove aumenta notevolmente la profondità dell'immagine poiché infiltra facilmente gli spazi aerei a causa della bassa tensione superficiale ⁶ . Qui, PFD è adottato per l'imaging confocale a lungo termine di sviluppare radici laterali. In questa configurazione, una o più piantine sono disposte su una lastra di terreno di crescita solidificata con agar e immersa in PFD. Il PFD consente gScambio armonioso nella camera di imaging, impedendo l'anossia. PFD è altamente volatile e viene mantenuto da una guarnizione di gomma poli (dimetilsilossano) che ha anche un'elevata permeabilità del gas (1,5 x ^10-12 pmol m ^-1 s ^-1 Pa ^-1 per CO ₂ ) ¹¹ . I nutrienti e l'acqua vengono forniti dalla lastra di media solidificata con agar. Allo stesso tempo, questa lastra di agar preme dolcemente la radice contro la copertura, fissando così la relativa posizione nella camera di imaging e consentendo l'utilizzo di lenti ad immersione ad alta risoluzione ad acqua. Inoltre, la lastra di agar può essere usata per somministrare una gamma di trattamenti farmacologici, compresi deksametasone, orizalin e isoxabene. Le camere di imaging possono essere assemblate in grandi numeri da diapositive standard di microscopia utilizzando attrezzature minime. Le camere di imaging sono state sviluppate e caratterizzate per studiare lo sviluppo laterale della radice, ma sono adattabili all'imaging di altri organi di piantina come i suggerimenti primari della radice eipocotili.

Protocollo

1. Creazione della Camera

1. Utilizzando una taglierina di vetro tagliare strisce di larghezza da 3 mm dalla fine di uno scivolo a microscopio spessore di 1 mm. Utilizzando una super-colla cianoacrilata o un nastro a doppio lato, incollare queste strisce di vetro circa 45 mm di larghezza per tutta la larghezza di una seconda scivolo a microscopio ( figura 1A ). È necessaria una diapositiva per camera, più slitte aggiuntive per versare lastre agar (una diapositiva produrrà 2-3 lastre agar). Le diapositive possono essere riutilizzate.
2. Tra le strisce di vetro, modella una guarnizione di altezza identica a quella di poli (dimetilsilossano) gas permeante. Posizionare una sfera di gomma di poli (dimetilsilossano) sullo scivolo ( figura 1B ), bagnare una seconda slitta con una piccola quantità di etanolo assoluto al 100% e appiattire la palla di gomma poli (dimetilsilossano) con la seconda slitta fino a raggiungere l'altezza Delle strisce di vetro ( figura 1C ).
   1. Se necessario, tagliare l'eccesso di poli (dimeThylsiloxane) con una lama di rasoio e ripetere appiattimento.
3. Utilizzando una lama adatta o una lama di rasoio bagnata in etanolo assoluto, rimuovere la parte interna della gomma di poli (dimetilsilossano) per creare la cavità che più tardi avrà la piastra e la lastra di agar ( figura 1D ).
4. Tagliare con cura il gel con una lama di rasoio per creare una guarnizione con uno spessore finale di parete di circa 2 mm ( figura 1E ). La permeabilità dei gas attraverso una barriera di poli (dimetilsilassano) è indipendente da spessori superiori a 50 μm ¹¹ .

2. Creazione della lastra agar-solidificata del medium di crescita

1. Su uno scivolo a microscopia con due strisce di vetro, posizionare una copertura (22 mm x 50 mm) in modo che poggi su entrambe le strisce di vetro.
2. Pipettare mezzo mezzo di resistenza Murashige e Skoog contenente 1% w / v saccarosio e 1,5% w / v agar (½ MS) nello spazio risultanteSotto il coperchio fino a quando quest'ultimo è completamente riempito (circa 1 mL di volume totale) e lasciare fino a quando l'agar è impostato (circa 5 minuti).
   Nota: i composti farmacologici possono essere somministrati attraverso la lastra di agar aggiungendo opportune concentrazioni al mezzo liquido prima che venga versata la lastra. Questo è stato testato con successo per il dexametasone ¹² , isoxaben, 2,6-diclorobenzonitrile (DCB), orisalin e latrunculin B.

3 . Terminare l'impostazione della camera

1. L'aria equilibrata PFD agitando un piccolo volume di PFD in un tubo ⁷ . Aggiungere una piccola quantità (circa 200 μL) di PFD equilibrata in aria al pozzo della guarnizione del gel, ma non riempire completamente la camera. Questo PFD contribuirà ad evitare la cattura di bolle d'aria sotto la lastra di agar quando viene inserita nella camera.
2. Rimuovere la copertura dalla lastra di agar (al punto 2.2 sopra) e utilizzare una lama di rasoio per tagliare una parte delLa dimensione e la forma del sired. Quindi posizionarlo nel pozzetto della guarnizione gel ( Figura 1F ). Dovrebbe esserci una distanza di 2-4 mm dalla guarnizione.
3. Riempire completamente la camera con il PFD equilibrato in aria.
4. Posizionare uno o più piantine di A. thaliana (fino a 3 piantine per immagini in 2-3 giorni) sulla lastra di agar con i cotiledoni e l'ipocotile appesa al bordo, galleggiante in PFD ( Figura 1G ).
5. Per ottenere piantine, sterilizzare i semi con etanolo al 70%, impianto in mezzo ½ MS aggiunto con 1% di saccarosio e 0,8% di agar, stratificare per 2-4 giorni a 4 ° C e crescere su piastre orientate verticalmente a 22 ° C in 16 H luce / 8 h regime scuro. Per l'imaging delle radici laterali, coltivare le piante per 7-10 giorni prima di trasferire alle camere di imaging.
6. Per chiudere la camera, applicare una copertura coprente all'ottica dell'obiettivo, premendola delicatamente con il bordo di una scivolata di microscopio di vetro fino a quando la coperturaPoggia su entrambe le strisce di vetro ( figura 1H ).
7. Se necessario, fissare la copertura con strisce di nastro chirurgico micropore largo 1,25 cm, a metà lunghezza ( Figura 1I ). Lasciare che il campione si stabilizzi per circa 30 minuti prima dell'immagine. Ciò minimizza il movimento dei campioni durante l'imaging.
8. Eseguire l'imaging con un microscopio verticale per mantenere un substrato controllato per la crescita. Utilizza obiettivi 20X / 0.7NA o 63X / 1.2NA CS2.

Risultati

Le radici laterali crescono a tassi fisiologici nelle camere di imaging.

Le lunghezze di radice laterale delle piante nelle camere di imaging sono state misurate ad intervalli orari ( figura 2A , sinistra, film 1, n = 23) e le percentuali di crescita sono state confrontate con quelle delle radici laterali coltivate su piastre standard Petri contenenti lo stesso agar-solidified medium 2A , a destra, Movie 2, n = 23). I tassi di crescita possono variare notevolmente tra le radici laterali, con la lunghezza della radice essere un fattore determinante per le zone sempre più lunghe di crescita e di proliferazione ¹³ . Pertanto, sono state selezionate serie di radici laterali per rappresentare radici di diverse lunghezze iniziali (da 50 μm a 1150 μm) sia nella camera di imaging che nella piastra agar. Media lunghezza laterale media all'inizio dell'esperimentoEra simile in ciascun set (439 e 442 μm rispettivamente per camere e lastre di imaging). Nell'intervallo temporale analizzato di 27 h, la crescita laterale della radice era circa lineare sia nelle camere di imaging che nelle piastre, con un tasso medio di crescita di 52 μm / h (R2 = 0.997) sulle piastre e 51 μm / h nelle camere di imaging R ² = 0,993) ( Figura 2B ). Le percentuali di crescita delle singole radici laterali dove sono molto variabili sia sulle piastre che nelle camere di imaging ( Figura 2C ), che vanno da 17 μm / h a 82 μm / h nelle camere di imaging e da 13 μm / h a 87 μm / h sulle piastre. Mentre i tassi di crescita generalmente aumentavano con la lunghezza della radice, i tassi di crescita continuavano tuttavia a variare sostanzialmente tra radici di lunghezza simile, ma la varianza era simile nelle camere di imaging e sulle lastre.

Le radici laterali si proliferano nelle camere di imaging e possono essere riprese utilizzando hiGh obiettivi numerici.

Le radici laterali che coesprendono il marcatore a membrana plasmatica NPSN12-YFP ¹⁴ e il microtubulo marcatore UBQ1 :: mRFP-TUBULIN BETA6 (RFP-TUB6) ¹⁵ sono stati immagazzinati da CLSM ¹⁰ ad intervalli di 1h per documentare il comportamento del microtubulo durante la proliferazione cellulare nelle camere di imaging ( Figura 2D , film 3). In queste camere, le radici laterali erano altamente stabili nella loro posizione sugli assi x, y e z, consentendo l'acquisizione di stack confocali continui di tempo per parecchie ore. Le cellule meristemiche continuano a proliferare, come risulta dalla formazione di bande preprofase ( figura 2D , frecce verdi), mandrini mitotici ( figura 2D , frecce bianche) e phragmoplasti ( figura 2D , frecce blu). Come per le piantine sui piatti di Petri,Le cellule di radice completamente allungate nelle camere di imaging hanno avviato i peli di radice ( figura 2A , figura 2D , teste di freccia), indicando inoltre che lo sviluppo ha proceduto come previsto nelle camere di imaging. Per fornire un ampio campo di vista, le immagini in Figura 2D sono state ottenute con un obiettivo 20x / 0.7 NA. E 'stato inoltre possibile ottenere immagini ad alta risoluzione delle radici laterali utilizzando un obiettivo di immersione ad acqua di 63x / 1,2 NA con elevata apertura numerica ( Figura 2E ).

La crescita laterale laterale è sostenuta nelle camere di imaging fino a tre giorni.

Per esaminare quanto tempo le camere di imaging avrebbero potuto sostenere la crescita laterale della radice a velocità fisiologiche, la lunghezza della radice laterale nelle camere di imaging (n = 27) e sulle piastre (n = 33) è stata quantificata a 0 h, 24 h, 48 h e 72 h. Le radici choSen erano inferiori a 200 μm a 0 h, con una lunghezza di radice laterale media di 117 μm nelle camere di imaging e 121 μm sulle piastre. Dal momento che le radici più corte crescono più lentamente in media ( Figura 2C ), sono cresciute più volte sul bordo della lastra di agar e sono state più facili da produrre. La crescita media di tutte le radici laterali non era significativamente diversa nelle camere di imaging rispetto alle piastre Petri nelle prime 48 ore ( Figura 3A ). Tuttavia, la crescita media è stata significativamente ridotta tra 48 h e 72 h ( figura 3A ). Mentre i tassi di crescita sembrano generalmente rallentare nelle camere di imaging dopo 48 h, i tassi di crescita tra gli individui restano molto variabili ( Figura 3B , 3C ), il che significa che esiste un consistente sottoinsieme di radici laterali che crescono a tassi paragonabili su lastre e camere Durante il completo periodo di crescita di 72 ore. 23 delle 33 radici laterali cresciuteSulle piastre (69,7%) raggiungono una lunghezza entro una deviazione standard della lunghezza media a 72 h (tra 927 e 3.163 μm, figura 3B , rosso). 10 di 27 (37,0%) le radici laterali nelle camere di imaging raggiungono una lunghezza entro questo intervallo ( figura 3B , rosso).

Le camere di imaging possono essere facilmente adattate per le radici laterali più anziane, le radici primarie e le ipocotili .

Una delle limitazioni del disegno originale della camera di imaging era che mentre la lastra di agar rigida forniva una certa resistenza meccanica, le radici gravitropicamente crescenti infine penetrarono nella lastra di agar, con conseguente perdita di qualità dell'immagine ( Figura 4B ) e crescita oltre la distanza di lavoro di alto NA Lenti, anche l'obiettivo di lunga distanza di lavoro (0,3 mm) 63X / 1,3 NA CS2. Le giovani radici laterali mancano del contenente statoliteCellule columella necessarie per gravitropismo ^{17 in} modo da inizialmente crescere parallelo alla copertura in camera di imaging ( Figura 2E ). Mentre crescono più a lungo e columella e statoliti, le radici laterali mostrano un gravitropismo crescente positivo, mentre le radici primarie presentano una forte risposta gravitropica dalla germinazione in avanti. Ciò limita a poche ore il periodo in cui le radici primarie possono essere riprese e limita gravemente la lunghezza iniziale delle radici laterali che possono essere riprese in continuo per 48 ore o più. Per ovviare a questa limitazione, la camera è stata modificata in modo tale che la crescita sia mantenuta parallela alla copertura da una membrana di cellophane cellulosica che funge da barriera di penetrazione sulla superficie della lastra di agar ( figura 4A ). I tentativi iniziali usando una lastra di agar 1,5% hanno causato una crescita radicale ridotta entro i primi 24 h, dovuta forse allo stress meccanico. Le concentrazioni inferiori dell'agar nella lastra sono state testateSi è trovato che nelle camere con una lastra contenente 0,8% agar e pellicola di cellulosa, i giovani tassi di crescita della radice laterale non differivano significativamente dai tassi di crescita nelle camere convenzionali per le prime 48 ore. Per 0-24 h la crescita media delle radici nelle camere di cellulosa e nelle camere convenzionali era rispettivamente di 242 μm e 262 μm (p = 0.78 Student's t-Test) e di 24-48 h rispettivamente pari a 330 μm e 355 μm (p = 0.67 Student's t-test); N = 12 e n = 11, rispettivamente. Questa disposizione impediva efficacemente le radici laterali a muoversi lontano dalla copertina, nell'agar, e consentiva anche l'imaging delle radici primarie fino a 48 ore ( figura 4C ).

Per verificare se le camere di imaging potrebbero essere adattate per organi diversi dalle radici, sono stati scelti gli ipocotili Arabidopsis. Gli ipocotili sono sostanzialmente più spessi delle radici così nella camera convenzionale di imaging, la più alta cGli ells erano schiacciati contro la copertura, portando alla deformazione. Si è quindi sviluppato un disegno alternativo usando diapositive a cavità che contengono una depressione ovale nel loro centro ( figura 4D ). In questa configurazione è stata posizionata una lastra di spessore di 1 mm di agar (preparata come al precedente punto 2.2) con un'estremità sporgente di pochi millimetri nella cavità di scorrimento ( figura 4D ). Gli ipocotili sono stati posizionati sopra la cavità nella diapositiva mentre la radice era posizionata sopra la parte orizzontale. Ciò ha assicurato che la piantina fosse fissata nello spazio dalla radice, ma l'ipocotile non è stato schiacciato. Mentre i tassi di crescita nelle camere rispetto alle piastre non sono stati sistematicamente quantificati, ipocotili nelle camere di imaging hanno mostrato l'onda ben descritta di crescita longitudinale che migra l'ipocotile ( Figura 4E , 4F ) ¹⁶ .

Figura 1 : Assemblaggio di una camera di imaging. Tutti i dettagli sono descritti nel testo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Le radici laterali crescono in condizioni fisiologiche nelle camere di imaging. ( A ) sviluppo della radice laterale di Arabidopsis in una camera di imaging (sinistra) e su una piastra (destra) per 25 ore (luce costante, incubazione orizzontale, imaging simultaneo). Barre di scala = 200 μm. ( B ) Parete che presenta lunghezze di radice laterale superiore a 27 h (misurate in intervalli di 1 h), delle radici laterali come mostrato in ( A ). individLe radici ual grigie (n = 23 per le piastre e le camere di imaging), lunghezza media come cerchi rossi. Barre di errore = 1 SD. La linea rossa è misura lineare attraverso lunghezze medie. ( C ) Trama che mostra il tasso di crescita medio per tutte le radici laterali di cui alla ( B ) relative alla loro lunghezza iniziale. ( D ) Proiezioni di intensità massima di stack confocali 3D acquisite da radici laterali che esprimono NPSN12-YFP e RFP-TUB6 in punti di tempo consecutivi. Inset: Ingrandimento della regione boxed. Frecce verdi: bande preprofase; Frecce bianche: mandrini mitotici; Frecce blu: phragmoplasts; Punte di freccia: peli di radice. ( E ) Proiezioni di intensità massima di immagini ad alta risoluzione acquisite da una giovane radice laterale della linea transgenica mostrata in ( D ) utilizzando un obiettivo 63X / 1.2 NA e un campionamento di Nyquist (dimensioni di pixel 77 nm x 77 nm) a 0 h e 16 h; Gli asterischi individuano le cellule identiche ad ogni punto temporale; La freccia indica una cella che si divide tra 0h e 16h.Barre di scala = 50 μm (AC); 20 μm (E). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Lo sviluppo laterale a lungo termine delle camere di imaging. ( A ) Un diagramma che mostra la crescita media della radice assoluta in tre intervalli di 24 ore consecutive in camera di imaging rispetto alle piastre. Ns indica p> 0,05; *** indica p <0,001 (t-test dello studente). N = 33 (piastre) e n = 27 (camere di imaging). ( B ) Trama che mostra lunghezze di radice laterale a punti consecutivi su tutte le radici utilizzate in (A). Rosso: tutte le radici laterali con una lunghezza finale entro 1 SD della media di tutte le radici laterali coltivate su piastre (tra 927 e 3163 μm). ( C ) Massimo inProiezioni di densità di pile confocali rappresentative 3D del marcatore a membrana plasmatica NPSN12-YFP in radici laterali, acquisite a punti consecutivi in ​​72 ore. Barre scala = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : Le camere di imaging possono essere adattate per altri organi vegetali. ( A - C ) Adattamento della camera di imaging per le radici primarie. ( A ) Schema della progettazione della camera di imaging. Questo è identico al disegno standard ( figura 1 ) a parte due modifiche: la lastra media di MS contiene 0,8% agar invece di 1,5% agar e un film di cellulosa (rosso) è posto tra agar e pianta per prevenire la crescitaNell'agar. ( B ) XY (top) e XZ (in basso) proiezioni di intensità massima di stack confocali rappresentativi 3D del marcatore a membrana plasmatica NPSN12-YFP nella radice primaria di un piantone di 7 giorni, imaged a 0 h e 48 h in un normale imaging Camera. Si noti che la radice cresce nell'agar a causa della sua risposta gravitropica. ( C ) XY (top) e XZ (in basso) delle proiezioni di intensità massima di pili confocali rappresentativi 3D del marcatore a membrana plasmatica NPSN12-YFP nella radice primaria di un piantone di sette giorni imaged a 0 h e 48 h nell'immagine Camera con pellicola di cellulosa. Prima dell'applicazione, la pellicola di cellulosa è stata sterilizzata in etanolo al 80% e imbevuta di liquido ½ mezzo MS. Si noti che la crescita gravitropica della radice nell'agar è impedita. ( D - F ) Adattamento della camera di imaging per ipocotili. ( D ) Schema che mostra la progettazione della camera di imaging ipocotile. Una guarnizione di gomma (grigio) di poli (dimetilsilossano) è manufactuRosso su uno scivolo della cavità tra due strisce di vetro (giallo). Una lastra di 1,5% agar di spessore uniforme (beige) è posta sullo scivolo, parzialmente raggiunta nella cavità. La camera è riempita con PFD (blu). Le piante vengono poste sulla lastra di agar, in modo che l'ipocotile occupa la regione inclinata verso il basso della lastra di agar nella cavità mentre la radice è posizionata la parte orizzontale dell'agar. La camera è chiusa con una copertura. ( E ) Proiezioni di intensità massima di pile confocali rappresentative del marker NPSN12-YFP della membrana plasmatica in un ipocotile di un piantina di due giorni, immaginato per 48 ore in punti consecutivi. ( F ) Crescita longitudinale in due intervalli di tempo consecutivi di singole cellule lungo l'asse da basale a quello apicale (posizioni relative a 0 h lungo l'asse indicato in E) dell'ipocotile mostrato in ( E ). Si noti l'ondata di crescita descritta in precedenza che migra nell'ipocotile ¹⁶ . Barre scala = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussione

Il metodo qui presentato è una semplice strategia per l'imaging confocale ad alta risoluzione di sviluppo delle radici laterali per due e tre giorni. Per periodi fino a 48 h, non sono stati osservati effetti negativi del sistema di imaging sullo sviluppo della radice laterale. Dopo 48 ore la crescita media radicale laterale ha cominciato a rallentare, anche se un substrato sostanziale delle radici (37%) ha continuato a crescere a tassi paragonabili alla crescita media delle radici sulle piastre. Pertanto, attraverso la rappresentazione di un numero sufficiente di radici, le radici la cui crescita rallenta dopo 48 h può essere esclusa. Le prove sistematiche delle camere di imaging non sono state eseguite per periodi superiori a 72 h, ma si suggeriscono strategie alternative se si desidera un periodo di imaging esteso. Le camere di imaging possono essere lasciate continuamente sullo stadio del microscopio, se vengono fornite condizioni ambientali adatte o rimosse in un impianto di crescita e restituite periodicamente al microscopio. Ciò consente di immaginare in parallelo numerose camere.

Un vantaggio delle camere qui descritte è che le radici laterali sono fisse nella loro posizione e possono essere riprese utilizzando lenti ad alta risoluzione di immersione ad acqua. La stabilità spaziale dipende in modo critico dalla concentrazione di agar utilizzata nella lastra di supporto agar. Inizialmente sono state testate una gamma di concentrazioni diverse da 0,8% agar al 2% agar, rivelando che elevate concentrazioni in questo intervallo hanno radici stabilmente stabilite nello spazio, ma la crescita delle radici ha rallentato più velocemente e alcune radici hanno mostrato segni di stress meccanico, incluso l'allungamento cellulare ridotto. Al contrario, le basse concentrazioni di agar non hanno fornito il supporto richiesto e le radici sono scivolate in x, y e z durante l'imaging. La lastra ottimale dell'agar 1,5% consente di fissare la posizione del campione senza effetti meccanici negativi. In queste condizioni, dopo che si stabiliscono nei primi 30 minuti circa, le radici sono stabili per molte ore, consentendo l'acquisizione di dati durante la notte. Durante l'acquisizione di dati 4D, le serie di z-stack erano tipicamente bRaccolti da un ulteriore 5-10 μm ma questo era principalmente per ospitare la crescita fuori-piano di radici laterali piuttosto che z-drift o wobble. Anche se la concentrazione standard di agar fornisce una certa resistenza alla penetrazione, le radici gravitograficamente in crescita infine penetreranno nell'agar. Tuttavia, con una modifica minore della camera di imaging, la crescita delle radici potrebbe essere mantenuta parallela alla copertura, permettendo di immaginare le più vecchie radici laterali e le radici primarie. Inoltre, la camera di base di imaging potrebbe essere facilmente personalizzata per ipocotili. I hypocotyls sono più liberamente galleggianti in questo sistema quindi la staffa di asse z per l'acquisizione di immagini è stata aumentata di solito a circa 20 μm. In questo studio è stato utilizzato un microscopio verticale, che ha permesso di controllare le proprietà del substrato. La camera di imaging può essere adattabile a configurazioni di microscopio invertito, ma deve essere valutata l'influenza dipendente dal tempo della copertura di copertura rigida sugli organi intercettatori.

Littlejohn e colleghi hanno fatto notare che la PFD stessa non scioglie facilmente le molecole biologiche, il che significa che non può essere usato direttamente per la consegna di composti farmacologici ⁷ . Questo problema è stato superato fornendo tali composti attraverso la lastra di mezzo di crescita solidificato su cui poggia la lastra di agar. Mentre i sistemi di perfusione rimarranno il metodo di scelta per gli esperimenti di lavaggio, la camera di imaging è stata usata con successo per la somministrazione di dexametasone ¹² e di altri composti. Una nota, mentre questo articolo era in preparazione von Wagenheim e colleghi ^{18 hanno} descritto una camera per l'imaging dello sviluppo laterale della radice utilizzando la microscopia a foglio leggero.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Perfluorodecalina	F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, Regno Unito	FLUTEC PP6
Gomma di poli(dimetilsilossano)	Fornitura biologica della Carolina; Burlington, NC, USA	Articolo # 132700	gel di osservazione Carolina
	VWR International Ltd, Lutterworth, UK	10118-600	La cavità ha un diametro di 13 mm e una profondità di 0,2-0,4 mm. Qualsiasi vetrino per cavità sarà probabilmente sufficiente
Colla cianoacrilica	Loctite	604753	Qualsiasi "super-colla" adatta per il vetro sarà probabilmente sufficiente
Membrana cellulosica cellophane	AA Packaging Limited, Preston, UK		Film di cellulosa 325P; disco da 80 mm