la rigenerazione della retina zebrafish è stato per lo più studiata utilizzando retine fissi. Tuttavia, i processi dinamici come la migrazione nucleare interkinetic si verificano durante la risposta rigenerativa e richiedono live-cell imaging per studiare i meccanismi alla base. Qui, descriviamo condizioni di coltura e di imaging per monitorare Interkinetic migrazione nucleare (INM) in tempo reale utilizzando la microscopia multiphoton.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Cultura di adulti transgenici Zebrafish retina espianti per live-cell imaging per Multiphoton Microscopia
In questo articolo
Sommario
Abstract
Un programma di rigenerazione endogena è avviata da Müller glia nel zebrafish adulti (Danio rerio) retina seguente danno neuronale e la morte. Le Müller glia ri-entrare nel ciclo cellulare e producono cellule progenitrici neuronali che sono oggetto di ulteriori cicli di divisioni cellulari e differenziarsi in tipi di cellule neuronali persi. Sia Müller glia e cellule progenitrici neuronali nuclei replicano il loro DNA e sottoposti mitosi in posizioni distinte della retina, cioè migrano tra il basale strato interno nucleare (INL) e lo strato esterno nucleare (ONL) rispettivamente, in un processo descritto come Interkinetic La migrazione nucleare (INM). INM è stata studiata principalmente nella retina sviluppo. Per esaminare le dinamiche di INM nell'adulto rigenerante retina zebrafish in dettaglio, è necessario live-cell imaging di / cellule progenitrici neuronali fluorescenza marcata Müller glia. Qui, forniamo le condizioni per isolare e retine cultura dorsalida Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebrafish che sono stati esposti ad una costante luce intensa per 35 ore. Mostriamo anche che queste culture della retina sono vitali per eseguire esperimenti di imaging live-cell, acquisendo continuamente immagini z-stack per tutto lo spessore della espianto della retina per un massimo di 8 ore usando la microscopia multiphoton per monitorare il comportamento migratorio di GFAP: cellule -positive nGFP . Inoltre, si descrivono i dettagli per effettuare analisi post-imaging per determinare la velocità di INM apicale e basale. Per riassumere, abbiamo stabilito le condizioni per studiare le dinamiche di INM in un modello adulto di rigenerazione neuronale. Questo farà progredire la nostra comprensione di questo processo cellulare cruciale e ci permettono di determinare i meccanismi che controllano INM.
Introduzione
A differenza di esseri umani, pesce zebra (Danio rerio) mostrano una robusta risposta la rigenerazione delle cellule alla morte dei neuroni della retina 1, 2, 3, 4. Fattore di necrosi tumorale α, una molecola di segnalazione che viene rilasciato dalla morte dei neuroni della retina induce Müller glia residente nel basale strato interno nucleare (INL) della retina, a proliferare 5 e produrre cellule progenitrici neuronali che continuano a proliferare prima differenziazione in cellule neuronali tipi morti
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Nota: Zebrafish sono state sollevate e mantenuto nella struttura Notre Dame Zebrafish nel Freimann Life Sciences Center. I metodi descritti in questo manoscritto sono approvati dalla University of Notre Dame cura degli animali e del Comitato uso e sono in conformità con la dichiarazione per l'utilizzo degli animali nella ricerca visione dall'Associazione per la Ricerca e la Visione e Oftalmologia.
1. Soluzioni
- Preparare 70% di etanolo per sterilizzare il cofano coltura di tessuti e qualsiasi apparecchiatura / reagenti che vengono trasferiti nella cappa coltura tissutale.
- Aggiungere 2 ml di 2-fenossietanolo a 1....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
L'isolamento della retina secondo la procedura descritta nello schema di figura 1 consente coltura di una retina dorsale appiattito da adulti light-danneggiato Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebrafish per un periodo di almeno 24 h in un CO 5% 2 / ambiente di aria. Questi espianti di retina piatto montate possono essere utilizzate per immagini piani focali a livello dei tessuti profondi. Un esempio è Müller glia / nuclei neuronali di cellule pro.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Gli studi che indagano i meccanismi che regolano la rigenerazione dell'adulto danneggiato retina zebrafish metodi utilizzati prevalentemente immunocitochimiche 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. Stabilire condizioni alla cultura espianti di retina e per eseguire live-cell imaging su fenomeni, c.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Apprezziamo il sostegno fornito da William Archer e il meccanismo di Notre Dame Integrated Imaging. Un ringraziamento particolare sono dirette ai tecnici Freimann Life Sciences per il loro aiuto continuo e la loro cura e l'allevamento del pesce zebra. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Eye Institute di NIH per DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) e il Centro per la ricerca Zebrafish, Università di Notre Dame, Notre Dame, IN.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pinze Dumont #5 | Strumenti di precisione mondiali | 14098 | |
| Pinze Dumont #5, angolo di 45 gradi | Strumenti di precisione mondiali | 14101 | |
| Forbici McPherson-Vannas | Strumenti di precisione mondiali | 501233 | |
| Fluordish | Strumenti di precisione mondiali | FD35-100 | |
| Stereomicroscopio | Nikon | SMZ-1B | tipo simile di stereomicroscopio di dissezione funzionerà |
| Cabina di sicurezza biologica di classe tipo A2 | Labconco | tipo equivalente funzionerà | |
| incubatore per colture tissutali | Thermoscientific | HEPA di classe 100 | tipo equivalente funzionerà Lampade |
| fluorescenti Sylvania OSFP5835HOECO | Bulbtronics | 31850 | |
| 0.2 &; filtro per siringa Acrodisc a pori m | VWR | 4192 | |
| siringa Luer-lok da 10 mL | VWR | BD309604 | |
| siringa Luer-lok da 60 mL | VWR | BD309653 | |
| NaHCO3 | FischerScientific | S233-500 | |
| CaCl2 | ThermoScientific | C79-500 | |
| MgCl2 | EMD Millipore | 5980 | |
| HBSS senza Ca2+/Mg2+, senza rosso fenolo, Gibco | ThermoScientific | 14175-095 | |
| MEM senza rosso fenolo, Gibco | ThermoScientific | 5100-038 | |
| Siero di cavallo, inattivato termicamente | ThermoScientific | 26050-070 | |
| penicillina/streptomicina | VWR | 16777-164 | |
| Agarosio ultrapuro a basso punto di fusione | ThermoScientific | 16520-100 | |
| etanolo, assoluto | ThermoScientific | BP2818-4 | |
| 2-fenossietanolo | Sigma | 77699 | |
| Corning Cell-Tak adesivo per cellule e tessuti | VWR | 354240 | |
| liquido con indice di rifrazione | Cargille Lab | 1803Y | |
| Microscopio multifotone Nikon A1 dotato di un laser a infrarossi MaiTai | sistema equivalente | Nikon | |
| 40X Apo obiettivo ad immersione in acqua a lunga distanza (N.A. 1.15) | |||
| camera ambientale dotata di inserto per petridish da 35 mm | sistema equivalente | Okolab | |
| il software | di analisi NISNikon |
Riferimenti
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Kassen, S. C., et al. Time....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
