Articolo metodologico

Isolamento delle cellule tumorali circolanti in un modello di topo ortotopico del tumore del colon-retto

DOI:

10.3791/55357

⸱

18 luglio 2017

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1Department of Gastrointestinal, Thoracic and Vascular Surgery, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 2German Cancer Consortium (DKTK), 3German Cancer Research Center (DKFZ)

In questo articolo

Sommario

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Descriviamo la creazione di tumori colorettali ortotopici attraverso l'iniezione di cellule tumorali o organoidi nel cecum dei topi e il successivo isolamento di cellule tumorali circolanti (CTC) da questo modello.

Abstract

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Nonostante i vantaggi di una facile applicabilità e di un rapporto costo-efficacia, i modelli del topo sottocutaneo presentano gravi limitazioni e non simulano accuratamente la biologia tumorale e la diffusione delle cellule tumorali. I modelli di topo ortotopico sono stati introdotti per superare queste limitazioni; Tuttavia, tali modelli sono tecnicamente impegnativi, specialmente negli organi cavi come il grande intestino. Al fine di produrre tumori uniformi che crescono e metastasiano in modo affidabile, le tecniche standardizzate per la preparazione e l'iniezione delle cellule tumorali sono critiche.

Abbiamo sviluppato un modello di topo orthotopico del cancro del colon-retto (CRC) che sviluppa tumori altamente uniformi e può essere utilizzato per studi di biologia tumorale e studi terapeutici. Le cellule tumorali da tumori primari, linee cellulari 2D (2D) o organoidi tridimensionali (3D) vengono iniettati nel cecum e, a seconda del potenziale metastatico delle cellule tumorali iniettate, formano tumori altamente metastatici. Inoltre,I CTC possono essere trovati regolarmente. Qui descriviamo la tecnica della preparazione delle cellule tumorali da entrambe le linee cellulari 2D e dagli organoidi 3D, nonché dal tessuto tumorale primario, le tecniche chirurgiche e di iniezione, nonché l'isolamento di CTC dai topi tumorali e suggerimenti per la risoluzione dei problemi.

Introduzione

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Il cancro del colon-retto (CRC) è una delle cause più comuni della morte del cancro nei paesi occidentali. 1 Mentre il tumore primario può spesso essere ripreso, il verificarsi di metastasi distanti peggiora drasticamente la prognosi e spesso porta alla morte. 2 , 3 Il correlato biologico della metastasi è la circolazione delle cellule tumorali (CTC), che si staccano dal tumore, sopravvivono in circolazione, si attaccano all'epitelio nell'organo bersaglio, invadono l'organo e, in ultima analisi, superano le nuove lesioni. 4 Anche se i CTC sono noti per essere di rilevanza prognostica, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 la loro biologia è solo in parte capita a causa della loro estrema rarità nel CRC. 10

I modelli del mouse sono un potente tOol per studiare vari aspetti della biologia del cancro. I modelli classici tumorali sottocutanei vengono prodotti mediante iniezione sottocutanea di cellule tumorali in topi riceventi, che possono essere immunocompetenti (se vengono utilizzate cellule tumorali murine singeniche) o immunodeficienti. I modelli tumorali sottocutanei sono poco costosi e producono dati veloci; La loro crescita del tumore a punto finale può essere facilmente misurata e non invasiva. Tuttavia, l'88% dei nuovi composti che hanno dimostrato un'attività antitumorale in tali modelli non riescono a studi clinici. 11 Ciò è in parte dovuto alle differenze tra le specie umane e topi; Tuttavia, gran parte di questo fallimento è dovuto al basso valore predittivo dei modelli del topo sottocutaneo.

I modelli di topo ortotopico, in cui le cellule tumorali vengono iniettate nell'organo d'origine e quindi crescono nel loro microambiente originale, sono quindi sempre più utilizzate nella ricerca sul cancro. 11 , 12 , 13 , 14 I modelli ortotopici non solo simulano le condizioni di crescita tumorale locale; Come risultato del sito anatomicamente corretto della crescita tumorale, i modelli ortotopici del mouse permettono anche una simulazione realistica di metastasi e sono quindi utilizzati per studiare la biologia CTC 8 , 15 , 16 o la loro risposta a diversi trattamenti in CRC. 13 , 17

Uno svantaggio maggiore dei modelli di topi ortotopici è la loro complessità tecnica. A seconda dell'organo in cui le cellule devono essere iniettate, la curva di apprendimento finché lo sperimentatore non è in grado di indurre tumori riproducibili è piuttosto lunga. Ciò vale in particolare per i modelli del cancro del colon-retto, in quanto le cellule tumorali devono essere iniettate nella parete intestinale, che spesso provoca perforazioni, perdite di cellule tumorali o perdita cellulare tumorale endoluminale. Questo unL'obiettivo è quello di descrivere il metodo di preparazione cellulare dai campioni di tessuto primario, dalle linee cellulari 2D e dalla cultura organoidea 3D e dalla loro iniezione nel cecum dei topi. La tecnica qui descritta porta a tumori altamente uniformi e, a seconda della biologia tumorale della linea cellulare utilizzata per l'iniezione, la riproducibile formazione di metastasi distinte e CTC nei topi riceventi. 15

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Protocollo

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Gli esperimenti animali presentati qui sono stati riesaminati e consentiti in maniera indipendente da un comitato istituzionale e governativo per la cura degli animali e sono stati condotti secondo le linee guida dell'Associazione federale delle scienze animali animali (FELASA). Tutte le misure possibili sono state prese per ridurre al minimo la sofferenza, inclusa l'anestesia e l'analgesia o, se necessario, l'eutanasia precoce.

1. Preparazione delle cellule e degli organoidi

NOTA: utilizzare un volume di 20 μL con 100.000 celle per ogni iniezione. Utilizzare la matrice della membrana basamento (BMM) per evitare perdite e assicurare l'iniezione standardizzata. Al fine di garantire risultati riproducibili, eseguire test di autenticazione delle linee cellulari ( ad esempio , tramite profilatura STR) a intervalli regolari.

  1. Preparazione di sospensioni cellulari primarie da tessuti freschi
    NOTA: lavorare sempre in condizioni sterili. Trasferimento immediato del frescoIl tessuto resecato dalla sala operatoria al laboratorio sul ghiaccio è necessario per garantire un'elevata vitalità delle cellule.
    Il benessere del paziente e il trattamento ottimale devono sempre essere la prima priorità. Pertanto, i campioni di tessuto per la ricerca devono essere ottenuti in modo da non interferire con il successivo processo di formazione patologica e la messa a punto del tumore resecato. Nella maggior parte dei casi è pertanto ragionevole avere i campioni per la ricerca ottenuta da un patologo addestrato al fine di garantire la non interferenza con la diagnosi patologica.
    1. Immediatamente dopo la rimozione sterile dal campione resecato (idealmente ~ 1 cm 3 ), posizionare il campione di tessuto in un tubo da 50 ml pre-riempito con 20-30 ml di soluzione salina fosfato-tamponata (PBS). Conservare il tubo sul ghiaccio e trasferirlo immediatamente nel laboratorio.
    2. Mettere il tessuto in un piatto di Petri e lavare due volte con abbondante PBS per rimuovere il sangue rimanente.
    3. Tagliare il tessuto in piccoli pezzi (~ 2-4 mm) con uno scaLpel ( ad esempio , con una lama # 20 o # 36).
    4. Utilizzare il dissociatore secondo le istruzioni del produttore allo scopo di dissociare ulteriormente il tessuto tumorale a una sospensione a singola cellula. In alternativa, utilizzare altri protocolli di digestione tumorale enzimatica.
    5. Conte le cellule della sospensione a singola cellula risultante ( ad es . In un contatore di coulter o un emocitometro).
    6. Centrifugare (5 min a 1.500 xg) e lavare due volte la cellula con PBS.
    7. Resuspendere le cellule in BMM a una concentrazione di 5 x 10 6 cellule / ml e tenerle sul ghiaccio.
  2. Preparazione delle linee cellulari per iniezione
    1. Crescere tutte le linee cellulari del cancro colorettale in condizioni di coltura standard (37 ° C, 5% CO 2 ) e prepararle al giorno della chirurgia.
    2. Raccogliere le cellule secondo protocolli standard della coltura cellulare, contare le cellule ( ad es . In un contatore di coulter o un emocitometro) e calcolare il reqPer tutte le iniezioni a seconda del numero di animali da iniettare.
    3. Preparare 3-5 volte il volume effettivamente necessario per tenere conto delle perdite e del volume morto della siringa d'iniezione.
    4. Centrifugare (5 minuti a 1.500 g) e lavare due volte la cellula con PBS.
    5. Resuspendere le cellule in BMM a una concentrazione di 5 x 10 6 cellule / ml e tenerle sul ghiaccio.
  3. Preparazione dell'organoide
    NOTA: Tutte le colture organoide 3D sono coltivate in condizioni di coltura standard (37 ° C, 5% CO 2 ). I protocolli dettagliati per la cultura organoide sono stati pubblicati prima. 18 , 19 , 20 Simile alle linee cellulari convenzionali, si consiglia un volume di 20 μL BMM con 100.000 cellule per iniezione. Gli organoidi vengono preparati al giorno della chirurgia come segue:
    1. Preparare il seguente supporto (nel seguito riportatoA DMEM / F12 +++): Medio Modified Eagle Dulbecco (DMEM) / F12 + 1% HEPES (1M) + 1% Glutamina (200 mM) + 1% Penicillina / Streptomicina.
    2. Pre-riempire i tubi da 15 mL con 1 mL di DMEM / F12 +++.
    3. Aspirare con cura gli organoidi dalla superficie della piastra di coltura e trasferire il contenuto di 3 a 5 pozzetti in un tubo da 15 ml.
    4. Coltivare con cura gli organoidi in pezzi più piccoli pipettandoli su e giù con una pipetta di vetro estesa.
    5. Aggiungere 5 mL DMEM / F12 +++ al tubo, seguita da centrifugazione a 1000 xg per 5 min.
    6. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante, risospendere il pellet in 600 μl di tampone enzimatico di dissociazione e trasferire la sospensione in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
    7. Incubare a 37 ° C per 1-5 minuti e poi pipettare con cura la sospensione in modo da sciogliere gli organoidi.
      NOTA: Verificare la digestione tramite microscopio; È completo quando tutti i cluster di cellule sono stati dissociatiD alle singole celle.
    8. Al termine della digestione, aggiungere 1.4 mL di DMEM / F12 +++ per fermare la digestione. Quindi trasferire tutti i pozzetti degli organoidi digeriti in un tubo da 50 ml.
    9. Conte le celle e calcolare l'importo richiesto per tutte le iniezioni.
    10. Preparare 3 - 5x del volume effettivamente necessario per tenere conto delle perdite di pipettazione e del volume morto della siringa d'iniezione
    11. Centrifugare (5 min a 1.500 xg) e lavare due volte la cellula con PBS.
    12. Resuspendevano le cellule in BMM a una concentrazione di 5 x 10 6 cellule / ml e li mantengono in ghiaccio.

2. Modello ortotopico del mouse

  1. Preparazione degli animali destinatari per la chirurgia
    NOTA: utilizzare i topi 6-8 settimanali NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ (NOD scid gamma, NSG) come destinatari. 21 NSG sono tra i topi più immunocompromessi, privi di mature cellule B, T e NK insieme a molte altre proteine ​​immunitariefetti. 21 Essi aumentano in modo affidabile i tumori anche se vengono iniettati numeri di cellule basse e sono altamente inclini a metastasi distanti. I topi NSG sono erbivori eccellenti e possono essere conservati in unità convenzionali non specifiche per agenti patogeni (SPF).
    1. Prima della prima incisione, iniettare 0.05 mg / kg di buprenorfina sottocutanea.
    2. Utilizzare sevoflurano a 3-3,5 vol% per l'anestesia generale. Una perdita del riflesso del pizzico del piede indica un'anestesia sufficiente.
    3. Coprire gli occhi dei topi anestetizzati con unguento ophtalmico per evitare l'essiccazione della cornea.
    4. Restringere i topi in posizione supina su un piccolo tavolo.
    5. Rasare l'addome con un rasoio elettrico (la crema depilatoria può essere utilizzata alternativamente) e disinfettare con almeno 3 volte la cloressina / iodio e l'alcool del 70% in alternativa.
    6. Coprire il campo chirurgico con tende sterili.
      NOTA: l'uso di antibiotici perioperatori è facoltativo e soggetto a linee guida istituzionali.
  2. Laparotomia midline e esposizione del cecum
    1. Usare forbici (bisturi possono essere usati alternativamente) per effettuare una piccola incisione mediana (3 - 5 mm) della pelle sull'addome inferiore. Prendete la muscolatura della parete addominale con le pinze e accuratamente incise con forbici, aprendo così la cavità addominale.
    2. Identificare e attentamente esternalizzare il cecum con pinze atraumatiche. Posizionare la cassa cieca del cecum sull'addome che punta cranialmente.
    3. Una volta esteriorizzato, mantenere il cecum umido utilizzando tamponi salini caldi in ogni momento.
  3. Iniezione ortotopica, chiusura dell'addome e recupero postoperatorio
    1. Per l'iniezione intracecale, utilizzare una siringa standard da 1 ml con una cannula da 30 G. Montare questa siringa su una pompa di microinjection, che viene a sua volta montata su un micromanipulator.
    2. Cogliere con cautela la punta del cecum con le pinze atraumatiche e lisciandola delicatamente accarezzandola in discesaD con un secondo set di pinze inumidito con salina calda.
    3. Posizionare la cannula direttamente sopra il cecum.
    4. Eseguire le seguenti operazioni sotto controllo visivo con un microscopio chirurgico binoculare.
    5. Afferrare con cautela il cecum con due pinze atraumatiche ad entrambe le estremità della parte esterna del cecum, leggermente allungare e poi lentamente tirarlo sopra la cannula posta in posizione parallela e direttamente sopra. È fondamentale non perforare l'intera parete intestinale (iniettando le cellule nel lumen) e non perforare la serosa oltre il punto iniziale di penetrazione, in quanto ciò porterebbe alla perdita e alla diffusione peritoneale.
      1. Spostare l'intestino verso la cannula, non la cannula verso l'intestino. Tenere e allungare l'intestino tra due pinze. Le mani del chirurgo devono poggiare su una superficie per ridurre il tremito.
    6. Iniettare le cellule tra la serosa (considerata come sottile strato traslucido sopra il thE vasi sanguigni intramurali) e la muscularis. La cannula deve quindi essere visivamente posta sopra i vasi sanguigni e sotto la sottile membrana traslucida.
    7. Utilizzare un interruttore a pedale per avviare l'iniezione per ridurre il tremito mentre la cannula è all'interno della parete intestinale.
    8. Una volta che la cannula è in posizione, avviare l'iniezione. Utilizzare una durata di 20 s, con conseguente impostazione di 1 μL / s sull'unità di controllo della pompa.
      NOTA: L'iniezione in o in prossimità di un vascello sanguigno danneggiato porta ad una diffusione intravascolare diretta e a metastasi distanti e pertanto deve essere evitata.
    9. Dopo aver completato l'iniezione, rimuovere attentamente la cannula tirandola indietro.
    10. Posizionare un tampone asciutto sotto il cecum e poi sciacquare accuratamente il cecum con acqua distillata per liscivare le cellule perdute e quindi evitare la diffusione peritoneale artificiale.
  4. Chiusura dell'addome e recupero postoperatorio
    1. Dopo rInserire, riportare delicatamente il cecum alla cavità addominale.
    2. Chiudere la parete addominale con suture da 6-0 rapidamente assorbibili.
    3. Chiudere la pelle con le ferite chirurgiche.
    4. Posizionare il mouse su una mappa di riscaldamento impostata a 38 ° C finché non sia stata completamente recuperata dall'anestesia.
    5. Osserva attentamente la condizione postoperatoria dei topi per i prossimi 48 h. In caso di disturbi, trattare con 0,05 mg / kg di buprenorfina ogni 12 ore.
    6. Monitorare i topi almeno una volta al giorno per segni di sofferenza a causa della crescita del tumore.

3. Isolamento delle cellule tumorali circolanti da campioni di sangue intero

NOTA: Ottenere il sangue mediante puntura cardiaca transcutanea su topi anestetizzati, seguita da eutanasia. Idealmente, 1.000 μL di sangue vengono prelevati in una siringa pre-riempita con 100 μL di un anticoagulante (acido etilendiammetraceico (EDTA) o eparina). Utilizzare una EpCAM anti-umana (adesione delle cellule epitelialiMolecola) per identificare i CTC. Questo funziona molto bene se le linee cellulari epiteliali umane vengono utilizzate nel modello del mouse. Per altri apparecchi potrebbero essere necessari diversi anticorpi.

  1. Arricchimento CTC:
    1. Pre-riempire i tubi da 15 mL con un campione di gradiente di densità di 5 mL e trasferire con cura il sangue nel tubo da 15 mL.
    2. Centrifugare (30 min a 300 xg senza freno) e rimuovere con cura il supernatante superiore.
    3. Versare il resto in un nuovo tubo da 15 ml e centrifugare (15 min, 300 xg con freno).
    4. Recuperare l'interfaas contenente le cellule mononucleari (scartare il resto) e lavare le cellule due volte con PBS.
    5. Resuspendere il pellet in 200 μl PBS / 1% EDTA e aggiungere 4 μL di anticorpo EpCAM. Incubare 20 minuti sul ghiaccio al buio.
  2. Screening e raccolta
    1. Preparare il seguente buffer (in seguito denominato buffer picking): PBS + 10% siero di vitello fetale (FCS) + 1% Penicillina / STreptomicina (1%) + 0,8% EDTA.
    2. Utilizzare una penna PAP per disegnare un cerchio di ~ 1 cm in un piatto di Petri sterile da 6 cm (impedisce la dispersione del liquido nel piatto) e pipetta 700 μL di tampone raccoglitore in questo cerchio.
    3. Aggiungere 50 μL di sospensione cellulare al tampone di raccolta di 700 μl all'interno del cerchio. Controllare la densità delle cellule con il microscopio. Distribuire il campione in piatti diversi se è troppo denso.
    4. Attendere che le cellule si stabiliscano (~ 5 min).
    5. Schermate la goccia di sospensione cellulare per le cellule colorate (= EpCAM).
    6. Una volta trovata una cellula, raccogliere la cellula con il micromanipolatore e metterla in un buffer di 50 μL a seconda dell'analisi a valle ( ad es. , Tampone di estrazione RNA o campione di coltura).
    7. A seconda delle analisi a valle previste, isolare le cellule e / o il mezzo negativo di EpCAM come controlli negativi.
    8. Procedere con analisi a valle ( ad esempio , cultura cellulare, PCR).

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Risultati

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La generazione di tumori colorettali di successo e riproducibile in questo modello dipende in maniera critica da un'iniezione precisa delle cellule senza perdite o perdite. Se questo è stato raggiunto, questo modello è estremamente affidabile e molto raramente si traduce in una diffusione peritoneale artificiale. La cinetica di crescita dei tumori così come i loro modelli di disseminazione dipendono dalla biologia degli organoidi e delle cellule usate. 15 Mentre l...

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Discussione

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Nonostante la loro attività preclinica dimostrata nei modelli del topo sottocutaneo, la grande maggioranza dei nuovi composti non riesca a sperimentare cliniche e non raggiunge mai la clinica. 11 Questa evidente insufficienza dei modelli del topo sottocutaneo per simulare accuratamente i modelli di biologia e crescita dei tumori ha portato allo sviluppo di modelli ortotopici a base di iniezione di cellule tumorali direttamente nell'organo originale.

I modelli di t...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dalla fondazione della ricerca tedesca (WE 3548 / 4-1) e Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Terreni e componenti per colture cellulari
Advanced DMEM F12Invitrogen12634010DMEM/ F12 +++ medium
HEPES (1 M)Life Technologies GmbH15630056DMEM/ F12 +++ medium
Glutamax-I Supplement (200 mM)Life Technologies GmbH35050038DMEM/ F12 +++
medium Penicillina/ Streptomicina (PenStrep)Life Technologies GmbH15140122DMEM/ F12 +++ medium
DMEMLife Technologies GmbH61965026terreno di base di linee cellulari 2D (DMEM/10% FCS)
Siero fetale di vitello (FCS)BIOCHROM AGS 0115terreno di base di linee cellulari 2D (DMEM/10% FCS)
TrypLE Express tampone di dissociazione enzimaticaLife Technologies GmbH12604021
Matrice di membrana basale Matrigel (BMM, senza rosso fenolo)CORNING B.V. Life Sciences356231
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineLife Technologies GmbH14190169
Trypsin-EDTA (0,25%, Phenol-Red)Life Technologies GmbH25200072
piastre a 6/48 pozzetti con coperchioPallone per colture cellulari CORNING3516/3548
75 cm², 250 mLVWR International GmbH734-2066
pallone per colture cellulari 150 cm², 600 mLCorning B.V. Life Sciences355001
Eppendorf provette 1,5 mL / 2 mLSarstedt AG & Co.72.706.400/ 72.695.400
Provette da centrifuga da 15 mL, 50 mLGreiner-Bio-One GmbH188271/227270
TC10 Vetrini di conteggio (per contatrice TC20)Bio-Rad Laboratories GmbH1450016
Pipette Pasteur (vetro, 150 mm)Fisher Scientific GmbH11546963/ FB50251estratte sottilmente con un bruciatore bunsen
delicatamenteDissociatore MACSMiltenyi Biotec130-093-235per la preparazione del tessuto tumorale primario
MACSmix Tube RotatorMiltenyi Biotec130-090-753per la preparazione del tessuto tumorale primario
delicate MACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-237per la preparazione del tessuto tumorale primario
Kit di dissociazione del tumore umanoMiltenyi Biotec130-095-929per la preparazione
del tessuto tumorale primarioFalcon 70 µ m Cell StrainerCorning B.V. Life Sciences352350per la preparazione del tessuto tumorale primario
NameCompanyNumero di catalogoComments
Surgical Equipment
SevofluraneAbbVie Germany GmbH & Co. KG-Ossigeno
medicaleAir Liquide Medical
Temgesic-Bepanthen
- unguento oftalmicoBayer Vital GmbH10047757
Soluzione salina normale 0,9% (E154)Serumwerk Bernburg AG10013
Aqua ad injectabiliaBraun235144
Siringa da 1 ml (senza volume morto) - Injekt-F SOLOBraun/neoLab194291661
30G ago per iniezioneBECTON DICKINSON304000
tamponi di cellulosaLohmann & Rauscher Deutschland13356
Micro-Adson ForcipeFST - Fine Science Tools11018-12
Forbice dell'iride - ToughCutFST - Fine Science Tools14058-11
Porta aghi Olsen-HegarFST - Fine Science Tools12002-12
AutoClip KitFST - Fine Science Tools12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1 (chirurgico sutura)Johnson & Johnson Medical GmbHZ1012H
Macchina per anestesia da tavolo per la ricerca con risciacquo O2 e vaporizzatore di sevofluranoPompa UltraMicro Parkland ScientificV3000PS/PK
con controller Micro4World Precision InstrumentsUMP3-4per iniezione ortotopica altamente controllata
Interruttore a pedale per controller SYS-Micro4World Precision Instruments15867attrezzatura per iniezione ortotopica ad alto controllo
Micromanipolatore manuale a tre assiWorld Precision InstrumentsAttrezzatura M325per iniezione ortotopica ad alto controllo
Supporto magnetico per micromanipolatoreWorld Precision InstrumentsM10per iniezione ortotopica ad alto controllo
Piastra di base in acciaio per supporto magnetico M10World Precision Instruments5479attrezzatura per iniezione ortotopica altamente controllata
Hot Plate 062Labotect13854
Isis - Rasoio per capelliAESCULAP - Braun-Microscopio
chirurgico binoculareParkland ScientificVS-2Z
NomeAziendaNumero di catalogoComments
CTC isolation
EDTARoth8040.1
Gradiente di densità medio – FicollStemCell - Lymphoprep7801
Alexa Fluor 488 anti-umano CD326 (EpCAM) Clone di anticorpi 9C4BioLegend324210
Alexa Fluor 488 anti-topo CD326 (EpCAM) Clone di anticorpi G8.8BioLegend118210
Petri Dish, 60 x 15 mm, 21 cm², VentGreiner bio-one628102
Microscopio per colture cellulari a fluorescenzaLeica
Transferman 4r MicromanipolatoreEppendorf
CellTram AirPompa di aspirazione Eppendorfcollegata al micromanipolatore
Dmz Universal Microelectrode PullerDagan Corporationnecessaria per la produzione di microcapillari per l'aspirazione di singole cellule
Capillari in vetro prismaticoDagan Corporation
PAP penAbcamab2601
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline LifeTechnologies GmbH14190169tampone di prelievo
Fetale Siero di vitello (FCS)BIOCHROM AGS 0115tampone di prelievo
Penicillina/Streptomicina (PenStrep)Life Technologies GmbH15140122tampone di prelievo
EDTARoth8040.1tampone di prelievo
NomeAziendaNumero di catalogoComments
>Immunoistochimica
Clone di anticorpi CD326 (EpCAM) purificato 9C4BioLegend324201EpCAM immunoistochimica (cfr, fig. 2C)
HRP coniglio anti-topo IgGAbcamab97046EpCAM immunoistochimica (cf, fig 2C)
GmbH-Buprenorfina Attrezzatura Attrezzatura

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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