Un protocollo per Rapid post-mortem delle cellule Cultura della diffusa intrinseca Pontine glioma (DIPG)

Summary

Questo protocollo descrive un metodo per la rapida trasformazione del post mortem diffuse campioni di glioma pontino intrinseca per la definizione di modelli di coltura cellulare derivati ​​da pazienti o la caratterizzazione diretta delle cellule tumorali e microambiente.

Abstract

Diffuse intrinseca Pontine glioma (DIPG) è un tumore del tronco cerebrale infantile che trasporta una prognosi universalmente fatale. Perché la resezione chirurgica non è una strategia di trattamento vitale e la biopsia non viene eseguita di routine, la disponibilità dei campioni dei pazienti per la ricerca è limitata. Di conseguenza, gli sforzi per studiare questa malattia sono state contestate da una scarsità di modelli di malattia fedeli. Per rispondere a questa esigenza, che descriviamo qui un protocollo per la rapida elaborazione dei campioni di tessuto autopsia post-mortem al fine di generare modelli di coltura cellulare derivati da pazienti resistenti che possono essere utilizzati in test in vitro o in vivo esperimenti di xenotrapianto ortotopico. Questi modelli possono essere utilizzati per lo screening per i potenziali bersagli farmacologici e di studiare i processi patobiologici fondamentali all'interno DIPG. Questo protocollo può essere ulteriormente esteso per analizzare e isolare le cellule tumorali e microambientali utilizzando cellulare fluorescenza-attivato (FACS), che consente la successiva analisi del gene expressione, espressione della proteina, o modificazioni epigenetiche del DNA presso la cella di massa o livello di singola cellula. Infine, questo protocollo può anche essere adattato per generare culture derivati ​​da pazienti di altri tumori del sistema nervoso centrale.

Introduction

DIPG è un tumore maligno del sistema nervoso centrale aggressivo che si pone nel ponte ventrale, in genere durante l'infanzia a metà ^{1, 2.} Nonostante decenni di studi clinici, il trattamento corrente è limitata alla radioterapia, che fornisce temporaneo miglioramento o la stabilizzazione dei sintomi e si estende solo sopravvivenza mediana da una media di 3 mesi. Anche con la radioterapia, la sopravvivenza globale mediana è a soli 9 mesi con il 90% dei bambini che muoiono a causa della malattia entro 2 anni dalla diagnosi iniziale. A causa della natura infiltrante del tumore e le funzioni critiche del tronco cerebrale, la resezione chirurgica non è possibile. Inoltre, negli Stati Uniti, ottenendo biopsie chirurgiche per DIPG storicamente non è stata effettuata ^3, come l'analisi istopatologica non ha alcun ruolo attuale nel guidare trattamento clinico e la diagnosi in genere può essere fatto da neuroimaging solo. Pertanto, la disponibilità di tessuto tumorale fo lo studio è limitato, limitando gli sforzi per condurre una ricerca su molecole di droga candidati e la biologia del tumore sottostante. In particolare, i miglioramenti nelle tecniche di neuroimaging e stereotassica hanno permesso lo sviluppo di biopsie sicuri di DIPG negli ultimi anni ^4, che, se combinati con i progressi della biologia molecolare, hanno trasformato la nostra comprensione della malattia. Attualmente, più studi clinici utilizzando la biopsia in anticipo e profilo molecolare di DIPG per l'individualizzazione piani di trattamento sono in corso (NCT01182350, NCT02274987) ^5.

DIPG e altri gliomi ad alto grado pediatrici rappresentano malattie distinte dalle loro controparti adulto glioblastoma ^{6, 7,} e modelli sperimentali in tal modo i fedeli di DIPG sono necessari per capire la sua fisiopatologia unico e scoprire le strategie terapeutiche efficaci. Negli ultimi anni, gli sforzi per ottenere DIPG tumore t focalizzataproblema per la ricerca, al momento dell'autopsia o, meno frequentemente, la biopsia hanno rivoluzionato la nostra comprensione e capacità di studiare DIPG. Gli sforzi di sequenziamento di tutto il genoma ha rivelato una mutazione ricorrente nel H3 istone, 3A famiglia (H3F3A) e istone cluster 1, H3B (HIST1H3B), che rappresenta il primo esempio di malattia umana causata da mutazioni nel istone codifica proteine ^{8, 9, 10, 11} . Inoltre, un sottoinsieme di DIPGs esprime mutazioni nel gene ACVR1, che non sono stati precedentemente riportati in cancro, ma sono identiche a mutazioni trovate nel congenita infanzia dello sviluppo disturbo fibrodisplasia ossificante progressiva ^{8, 9, 10, 11.} Come pure, le prime colture cellulari DIPG derivati ​​da pazienti e ortotopico mo xenotrapiantodels sono state ora stabilito ^{1, 2, 12, 13, 14,} così come modelli murini stabilite attraverso la xenotrapianto diretto delle cellule tumorali in topi immunodeficienti per generare xenotrapianti seriali ^{3, 14, 15.} I primi sforzi di screening di droga che utilizzano questi modelli derivati da pazienti hanno identificato nuovi agenti promettenti per la traduzione clinica ^{4, 14} e hanno gettato le basi per almeno uno studio clinico (NCT02717455).

Questi primi passi verso il progresso sono solo l'inizio, e saranno necessari numerosi campioni di tessuto derivati ​​da pazienti e modelli di coltura per definire sottotipi della malattia e sviluppare le strategie terapeutiche più efficaci. geneticamente motoremodelli murini strati sovrapposti di DIPG faciliteranno anche studi volti a promuovere la nostra comprensione di base della malattia. Gli sforzi fatti per generare modelli genetici per DIPG saranno aiutati dagli studi genomici fondamentali di cui sopra, ma attualmente un numero limitato di opzioni sono disponibili. Uno di questi modelli, che genera istologicamente simili alto grado gliomi del tronco encefalico, utilizza la RCA / tv-un sistema virale per guidare PDGF-B sovraespressione e la perdita Ink4a-ARF nelle cellule nestina-positivo nella fossa posteriore di topi neonati ^{5, 16.} Un altro approccio prevede ricapitolando diversi grandi mutazioni DIPG-associato (istone H3.3 K27M mutazione, perdita di p53 e di attivazione PDGFRA) in cellule precursori neurali derivate da cellule staminali embrionali umane, che è sufficiente a rendere queste cellule tumorali ^{6, 7, 17.} La combinazione di metodi genetici e paziente derivmodelli ED consentiranno test preclinici e favorire lo sviluppo di terapie efficaci.

Per affrontare le sfide per la ricerca DIPG sopra indicato, questo protocollo autopsia rapida è stata sviluppata per generare colture di cellule derivati da pazienti per le indagini ^{8, 9, 10, 11, 12, 14.} Il protocollo mira a tutelare la vitalità del tessuto e massimizzare la probabilità di generare culture durevoli, nonostante le sfide connesse con lunghi intervalli post mortem e tempi di trasporto. Quando generato con successo, queste culture DIPG possono essere utilizzati in vitro manipolazioni in successive e in esperimenti in vivo xenotrapianto, consentendo la valutazione dei potenziali molecole terapeutiche sul paziente cellule derivate.

Protocol

Questo protocollo è stato eseguito con l'approvazione dal nostro comitato istituzionale di revisione con adeguate de-identificazione di tutti i dati dei pazienti e in conformità a tutte le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano. Ottenere tutto appropriato istituzionale approvazione board review e il consenso informato da parte della famiglia del paziente prima di lavorare con questo protocollo.

1. Ottenere campioni di tessuto

NOTA: Una componente fondamentale di questo protocollo richiede una corretta gestione della donazione di tessuti a partire immediatamente al momento della autopsia. La vitalità complessiva del campione dipende in modo significativo a ridurre al minimo l'intervallo post mortem (PMI), immediatamente trasferire il tessuto nel mezzo freddo appropriata integrata con antibiotici / antimicotici, mantenendo il campione in ghiaccio durante il trasporto, e il mantenimento di una tecnica sterile in tutto il protocollo.

1. Dopo la notificadi una donazione imminente, preparare un kit per la raccolta del campione. Utilizzando una scatola di spedizione con un contenitore isolato che può essere utilizzato direttamente per il trasporto di ritorno del campione di tessuto, comprendere i materiali seguenti:
   1. Includere materiali per la preparazione sterili, compresi i guanti sterili, tende, e bisturi.
   2. Include 8 - 10 sterili 50 provette coniche ml contenente 30 mezzi di trasporto ml nel contenitore isolato con ghiaccio o impacchi freddi.
      NOTA: Durante qualsiasi supporto standard di coltura cellulare può funzionare, la migliore redditività del campione si ottiene con Hibernate-A integrato con antibiotico / antimicotico.
   3. Includere eventuali ulteriori tubi di esempio per altre analisi (ad esempio, fissativi).
   4. Se l'autopsia non sarà eseguita presso la sede del sperimentatore, includere un documento che indichi chiaramente come raccogliere il campione di tumore. Questo include dettagli come il mantenimento della sterilità, mantenendo le provette dei campioni in ghiaccio, e compresi i campioni dal mesencefalo e midollo come tumor cellule spesso invadono queste regioni.
2. Mantenere la sterilità durante l'autopsia. Considerare il cervello sterile all'interno del cranio, in modo da osservare una tecnica sterile (compresi i guanti spogliatoi) una volta che il cranio è aperto. Evitare la contaminazione con la pelle e dei capelli è fondamentale.
3. Sezionare il tumore dal lato ventrale (la "pancia" del ponte, vedi Supplemental Figura 1). Con un bisturi sterile, tagliare piccoli pezzi 1 cm dal tumore e trasferire immediatamente in mezzi di trasporto a freddo (vedi NOTA al punto 1.1.2) e mettere in ghiaccio bagnato. Mettere 10 mL di tessuto in ogni provetta, risultando in un volume finale di tessuto e media in ogni provetta di 40 mL.
   NOTA: Nel caso di DIPG, il tumore infiltra diffusamente il ponte e spesso il resto del tronco cerebrale. In quanto tale, raccogliere la maggior quantità di campione il più possibile, in genere di cui 3 - 4 tubi (30 - 40 ml di tessuto) dal ponte e 1 - 2 tubi (10 - 20 mL di tessuto) ciascuno da mesencefalo e midollo.
4. raccogliere samples dal mesencefalo e midollo giustapposta alle Pons, che spesso contengono molte cellule tumorali.
5. Dopo la raccolta del campione, spedire i campioni O / N sul ghiaccio bagnato nel contenitore isolato. Non spedire il campione in ghiaccio secco, come il congelamento uccidere le cellule.

2. Preparazione per l'elaborazione del campione

1. Prima di iniziare la preparazione del campione, sterilizzare cappe di coltura tissutale con lame di rasoio, emostatiche curve, e tutti gli altri strumenti non sterili sotto la luce UV per 1 ora. Eseguite tutte le seguenti operazioni in condizioni sterili per evitare la contaminazione delle culture.
2. Preparare e soluzioni di filtro sterili.
   1. Per preparare 1,8 M soluzione di saccarosio, sciogliere 308,07 g di saccarosio in 300 ml di acqua distillata. Aggiungere 50 ml 10x Hank's-Buffered Saline Solution (HBSS) senza calcio o magnesio e portare il volume totale a 500 ml con acqua distillata. Conservare a 4 ° C.
   2. Per preparare la soluzione digestione enzimatica, prendere 50 mL HBSS con calcio e magnesio per ogni 10 ml di tessuto tritato e aggiungere 500 microlitri 5 mg / mL deossiribonucleasi I (concentrazione finale 50 mg / mL), 500 microlitri 2,5 mg / ml di collagenasi I / II e soluzione dispasi (concentrazione finale 25 ug / mL), e 500 microlitri di buffer 1 M HEPES. soluzione di digestione Preriscaldare a bagnomaria C 37 °.
   3. Per preparare stelo supporto (TSM) di base del tumore, mescolare 250 mL Neurobasal-A, di 250 mL Dulbecco Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (DMEM / F12), 5 mL 100x antibiotico-antimicotico, 5 ml 200 mm L-alanil-L glutammina dipeptide (Glutamax-A), 5 mL tampone HEPES, 5 mL 100 mM sodio piruvato, e 5 mL 100x MEM aminoacidi non essenziali.
   4. Per preparare completa TSM con fattori di crescita, aggiungere i seguenti supplementi a base di TSM: 50x B27 Supplemento Minus vitamina A (1:50), fattore di crescita epidermico umano (H-EGF, 20 ng / mL), fattore di crescita fibroblasti umani (H- FGF, 20 ng / mL), fattore di crescita derivato dalle piastrine umane AA (H-PDGF-AA, 10 ng / ml),umano piastrine-derivato fattore di crescita BB (H-PDGF-BB, 10 ng / mL), e la soluzione di eparina (2 mg / mL).
3. Preraffreddamento una centrifuga da laboratorio dotato di un rotore oscillante benna a 4 ° C.

3. La dissociazione meccanica

1. Trasferire il tessuto in un 100 millimetri piatto di coltura cellulare di alto pareti x 20 mm. Rimuovere avanzi di supporti da spedizione e sostituirli con 10 - 15 mL terreni di coltura freddo.
2. Utilizzando i hemostats curve di cogliere una lama di rasoio, tritare finemente il tessuto durante la rimozione dei vasi sanguigni evidenti o meningi.
   NOTA: I frammenti di tessuto finale dovrebbe essere inferiore a 1 mm (vedere Figura 1B).
3. Trasferire il tessuto in un tubo da 50 ml pulito. Lavare il piatto di coltura cellulare con l'aggiunta di 5 ml di terreni di coltura freddo e trasferire al tubo conico. Ripetere questa fase di lavaggio se necessario per trasferire il tessuto rimanente.
4. Utilizzando una pipetta sierologica 10 mL, triturare delicatamente (4 - 5 volte). Consentire tiss più grandiframmenti ue di depositarsi sul fondo della provetta. Se necessario, centrifugare brevemente il campione per 1 min (350 xg, 4 ° C).
5. Raccogliere la frazione dissociato meccanicamente.
   1. Rimuovere il surnatante e filtrare attraverso un filtro 100 micron in un nuovo tubo da 50 ml etichettata "dissociazione meccanica." Invertire il filtro sul tubo conico originale e lavare con terreni di coltura per recuperare i frammenti di tessuto.
   2. Centrifugare la frazione "dissociazione meccanica" per 5 min (350 xg, 4 ° C).
   3. Rimuovere il surnatante dalla frazione pellet "dissociazione meccanica" e risospendere il tessuto in terreni di coltura freddo. Se vi è più di 5 mL di tessuto nel tubo conico "dissociazione meccanica", dividere il tessuto in altri tubi 50 mL coniche tale che nessun tubo ha più di 5 mL di tessuto.
6. Conservare la frazione meccanicamente dissociato in ghiaccio fino alla fase di centrifugazione gradiente di saccarosio (Step 5). In alternativa, la frazione meccanicamente dissociato può passare al punto 5 durante il periodo di incubazione di dissociazione enzimatica (Passo 4.4).

4. enzimatica dissociazione

1. Se vi è più di 5 mL di tessuto nel tubo contenente i frammenti di tessuto grandi rimanenti, dividere il tessuto in altre nuove provette coniche da 50 ml tale che nessun tubo ha più di 5 mL di tessuto.
2. Centrifugare la provetta conica (s) contenente i frammenti di tessuto rimanenti per 5 min (350 xg, 4 ° C).
3. Rimuovere il surnatante e aggiungere la soluzione preriscaldata digestione enzimatica, tale che vi sia soluzione di digestione 5 mL per ogni 1 mL di tessuto (ad esempio, 25 mL soluzione di digestione per 5 mL di tessuto).
4. Sigillare le palpebre tubo conico con parafilm e incubare la reazione su un rotatore a 37 ° C per 30 min.
5. Dopo l'incubazione, triturare i campioni delicatamente (vedi Figura 1C).
   1. Utilizzando una pipetta sierologica 10 mL,pipetta il campione su e giù per 6 - 8 volte. Evitare la generazione di bolle d'aria eccessive.
   2. Aggiungere una punta di pipetta 1000 microlitri alla fine della pipetta e triturare altri 6 - 8 volte.
   3. Lasciare i restanti pezzi di depositarsi sul fondo della provetta. Rimuovere e filtrare il surnatante con le cellule ancora in sospensione attraverso un filtro 100 micron in un nuovo tubo da 50 ml con l'etichetta "enzimatica dissociazione" e memorizzare sul ghiaccio.
   4. Se significativi frammenti di tessuto rimangono, aggiungere un ulteriore 10 mL HBSS con calcio e magnesio ai frammenti e ripetere i punti 3.5.1 e 3.5.2. Filtrare la soluzione finale attraverso un filtro 100 micron nel tubo "enzimatica dissociazione".
6. Centrifugare il tubo "enzimatica dissociazione" per 5 min (350 xg, 4 ° C) e proseguire al saccarosio centrifugazione in gradiente.

5. saccarosio centrifugazione in gradiente

1. Se i campioni sono ancora sospese in soluzione, centrifuge per 5 min (350 xg, 4 ° C).
2. Rimuovere il surnatante e risospendere il tessuto in 20 mL HBSS freddo senza calcio e magnesio. Portare il volume fino a 25 mL totale con HBSS freddo.
3. Aggiungere lentamente 25 ml di 1,8 M soluzione di saccarosio e capovolgere il tubo per mescolare. Ciò si traduce in un gradiente di saccarosio 0,9 M.
4. Centrifugare senza freno per 10 min (800 xg, 4 ° C). Utilizzando un freno centrifugazione interromperà il gradiente e ridurre la resa (vedere Figura 1D per un esempio di un campione prima e dopo centrifugazione).
5. attenzione aspirare detriti mielina e tanto soluzione di saccarosio possibile. Lavare il campione aggiungendo 30 mL HBSS freddo senza calcio e magnesio e mescolando delicatamente. Centrifugare per 5 min (350 xg, 4 ° C).

6. ACK Globulo rosso Lysis

1. Rimuovere il surnatante lavaggio. Aggiungere 5 ml di tampone di lisi ACK e risospendere delicatamente il pellet cellulare, agitando la provetta per 1 minuto a temperatura ambiente.
2. Placare la lYsis aggiungendo 30 mL HBSS freddo senza calcio e magnesio.
3. Centrifugare per 5 min (350 xg, 4 ° C).

7. Manutenzione Cultura iniziale

1. Risospendere il pellet cellulare finale in 10 - 15 mL caldo completo TSM con fattori di crescita e quantificare la densità di cellule vitali su un emocitometro utilizzando trypan esclusione blu.
   NOTA: La gamma di cellule vitali varia ampiamente a seconda delle circostanze della donazione di tessuti, e la quantificazione può essere difficile in questa fase iniziale a causa di detriti cellulari avanzi. In un caso ideale, puntare ad avere un milione di cellule vive per campione. Nei casi in cui rimane detriti eccessivo la piastra ad una densità più bassa in un pallone T175.
2. Trasferire le sospensioni cellulari finali ad un nuovo pallone di coltura T75. Spike in fattori di crescita supplementari ogni altro giorno per mantenere i livelli complessivi di fattori di crescita, e monitorare lo sviluppo delle cellule tumorali neurosfere (vedi Figura 1E e Figura 2).
3. In alternativa, le cellule di processo enzimaticamente dissociate per ulteriori analisi, tra cui citometria a flusso e fluorescenza-attivato l'ordinamento delle cellule.
4. Dopo lo sviluppo di neurosfere (che in media prende 3 - 4 settimane, ma varia da pochi giorni a finchè 2 mesi), il filtro di invertire il campione utilizzando un filtro a rete di nylon 100 micron per ridurre la quantità di detriti.
   NOTA: Il filtrato deve essere mantenuta in coltura nel caso in cui singole cellule vitali o piccole sfere sono presenti.
5. Garantire l'integrità e la purezza della cultura eseguendo DNA fingerprinting mentre passaging, confrontando il campione iniziale del paziente.

Results

Il protocollo descritto è riassunta come un flusso di lavoro in cinque fasi con le immagini del tessuto nelle varie fasi di lavorazione in figura 1. Il campione viene prima ottenuto attraverso una rapida autopsia sterile. Durante la dissociazione meccanica, il tessuto è macinata durante la rimozione dei vasi sanguigni e meningi dal campione, e filtrata attraverso un filtro a rete in nylon 100 micron. frammenti di tessuto rimanenti sono enzimaticamente dissociate in un forno di riscaldamento. Successivamente, detriti viene ridotto mediante centrifugazione su gradiente di saccarosio, isolando uno strato distinto di mielina dal campione. Inoltre, ACK lisi riduce visibilmente la quantità di globuli rossi presenti nel campione. Infine, le cellule sono placcati in mezzi privi di siero addizionato con fattori di crescita.

Supplemento figura 1 è un esempio del tumore su autopsia. Il tumore cresce come una infiltrazione diffusa del ponte did le regioni limitrofe del tronco encefalico. Durante i preparativi del campione, piccoli pezzi ~ 1 cm x 1 cm devono essere tagliati e immediatamente inseriti in supporti il ​​trasporto freddo sul ghiaccio.

La figura 2 mostra vari esempi di come i campioni possono apparire dalle prime fasi di coltura ad una cultura durevole. Inizialmente placcato e culture precoce (A, B) spesso non sembrano contenere molte cellule sopravvissute. Inoltre, gruppi di cellule precoci (C, D) spesso non presentano il grado di contrasto tipicamente associati con neurosfere. In particolare, la durata del tempo di coltura prima della comparsa di gruppi di cellule può richiedere settimane per un paio di mesi. Tuttavia, il passaggio iniziale di questi gruppi di cellule, combinata con filtraggio inverso di gruppi di cellule, può isolare le cellule tumorali sani che sono in grado di formare sfere (F). Il filtrato (E) in genere contiene detriti avanzi; tuttavia, si consiglia di placcatura e mantenere il filtrato e monitoraggio per lo sviluppo di gruppi di cellule. Questi campioni derivati ​​da pazienti possono essere mantenute in coltura per passaggi multipli (G, H).

Figura 3 dimostra la capacità di queste cellule di essere xenotrapiantati in topi. In ciascuno di questi casi, le cellule sono state transfettate con DIPG un reporter GFP-luciferasi per monitorare lo sviluppo dei tumori tramite bioluminescenza (A). I tumori possono essere esaminate istologicamente, per esempio osservare attecchimento tumorale (B) o l'espressione di marcatori specifici (C). Questi modelli in vivo, combinate con saggi in vitro possono essere utilizzati per valutare gli effetti di vari farmaci o manipolazioni genetiche (ad esempio, ^{8, 9, 10, 11, 14).}

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Figura 1. I campioni di tessuto nelle varie fasi di lavorazione. (A) ottenere il campione attraverso procedure dell'autopsia sterili e spedizione durante la notte sul ghiaccio bagnato. (B) Da sinistra a destra: (riga 1) provette contenenti tessuto tumorale nei mezzi di trasporto; tessuto fresco in un piatto di coltura cellulare di 100 mm x 20 mm macinazione iniziale di tessuti; (Riga 2) tessuto parzialmente tritato; rimozione delle meningi e dei vasi sanguigni; dimensione finale di pezzi di tessuto tritato. (C) Da sinistra a destra: (riga 1) tessuto incubato su una tavola rotante in un forno a 37 ° C; (Riga 2) triturazione di tessuto attraverso una punta di pipetta 1000 microlitri collegato a una pipetta 10 ml; filtraggio del tessuto dissociato attraverso un filtro a rete in nylon 100 micron. (D) Da sinistra a destra: dissociato tessuto sospeso in 0,9 M soluzione di saccarosio prima della centrifugazione; tessuto dissociato separati in un gradiente di saccarosio dopo centrifugazione; un livello visibile odetriti f mielina sopra del gradiente di saccarosio; un pellet di cellule finale dopo ACK lisi e lavaggio. (E) Il campione finale può essere collocato nella cultura o utilizzato in altre analisi a valle. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Le immagini delle colture primarie e cellule Passage presto. (A - B) Culture placcato immediatamente dopo la dissociazione (SU-DIPG-XXX, A), o che non sono ancora cresciuti neurosfere (SU-DIPG-XXIX, B). (C - D) comparsa precoce di neurosfere in colture primarie di SU-DIPG-XXVIII (C) e SU-DIPG-XXIX (D). (EF) Primo passaggio della coltura primaria da D usando un filtro di nylon 100 micron, con la fiinfiltrato (E) e filtrato inversa (F) placcato. (G - H) neurosfere adulte del primo passaggio di SU-DIPG-XXVII (G) e il terzo passaggio di SU-DIPG-XXV (H) che crescono in coltura. Barra di scala = 200 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. colture cellulari paziente-derivata può innestare e formare tumori nei topi. Immagini (A) bioluminescenza di quattro diverse colture cellulari derivati da pazienti trasfettate con un reporter GFP-luciferasi. (B) sezione sagittale da un xenotrapianto mouse, mostrando le cellule tumorali trapiantate nel ponte del mouse. Verde: GFP, rosso: la proteina basica della mielina. Barra di scala = 1 mm. immunofluores (C) Esempioimmagine scenza che mostra le cellule tumorali GFP trapiantate in un cervello di topo. Blu: DAPI, Verde: GFP, Rosso: IGF2R. Barra di scala = 40 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Supplementare Figura 1. Esempio Autopsia di un tumore pontino. Immediato post mortem aspetto di una diffusa glioma pontino intrinseca. Il tumore appare come una grande massa ricca di mielina sulla superficie ventrale del ponte. Clicca qui per scaricare questa immagine.

Discussion

Questo protocollo descrive un metodo per il trattamento rapido di post-mortem donazioni tessuto tumorale sviluppare colture cellulari derivati da pazienti, che può essere utilizzato in una varietà di in vitro o in vivo. A causa della natura di lavorare con campioni autoptici, mantenendo campione redditività rappresenta una sfida significativa. Diversi fattori, tra cui l'intervallo post-mortem ad autopsia o il tempo richiesto per il trasporto del tessuto, dovrebbe essere minimizzato il più possibile, ma spesso sono difficili da controllare. Nella nostra esperienza, un intervallo post-mortem di meno di 6 - 8 ore (dal momento della morte al tempo che il tessuto è messo in ghiaccio il trasporto freddo e mezzi di trasporto), ha dato le migliori possibilità di stabilire una coltura cellulare durevole. E 'meglio quindi ricevere il tessuto in laboratorio entro 24 ore, e di processo per la cultura immediatamente dopo il ricevimento.

Poiché la posizione di questi casi rari varia ampiamente, ela qualità della fase di recupero tessuto influenza fortemente le possibilità di successo, la logistica di eseguire l'autopsia può essere difficile. In molti casi, al fine di ottenere i tempi di 6-8 ore, non è possibile condurre la raccolta dei tessuti in un centro accademico. Invece, avere un servizio di recupero dei tessuti su chiamata per recuperare il tessuto tumorale alla camera ardente in un protocollo IRB approvato è spesso più conveniente per il recupero dei tessuti. Ottenere il consenso informato in anticipo della morte è raccomandato e facilita la pianificazione logistica. Si raccomanda vivamente la preparazione di kit autopsia indipendenti con istruzioni chiare e approfondite e forniture sterili per tessuti di recupero (guanti, tende, bisturi). Inoltre, stabilire punti di vantaggio della comunicazione tra l'investigatore, patologo, e pompe funebri è critica. Ad esempio, il ricercatore deve discutere il protocollo con il patologo prima l'autopsia ed evidenziare gli errori più comuni. Questi errori comprendono microcontaminazione BIAL (di solito lievito) durante il recupero dei tessuti, il mancato nave attraverso il trasporto e la mancata spedizione del campione sul sufficienti ghiaccio umido in un contenitore thermoinsulated notte / accelerato. Infine, si consiglia di utilizzare un servizio di corriere porta a porta per la spedizione dei campioni per ridurre al minimo i tempi di trasporto.

Si deve anche essere presa durante la dissociazione dei tessuti per preservare la vitalità cellulare. Per esempio, l'uso dei mezzi di comunicazione progettata per preservare la salute del tessuto neurale per il trasporto (Hibernate-A integrato con antibiotico / antimicotico) aumenterà la probabilità di generare una cultura di successo. E 'anche importante mantenere il campione ad una temperatura fredda per tutto il protocollo trasferendo sempre i campioni in ghiaccio. Raccolta entrambe le frazioni di dissociazione meccanica ed enzimatici insieme a minimizzare triturazione può migliorare il successo del protocollo, in quanto entrambi i passaggi sono traumatico per le cellule. Nella nostra esperienza, mentre la maggior parte delle culture di successo nascono da entrambe le frazioni, Abbiamo avuto casi in cui uno solo dei due preparazioni stabilita una cultura durevole, potenzialmente riflette la natura delicata di questi campioni. Un altro passo traumatico nel protocollo è triturazione; una strategia che può ridurre il grado di triturazione necessaria a garantire i campioni siano completamente macinate proprio all'inizio della preparazione. Altri esempi di aspetti del protocollo progettato per migliorare la redditività del campione includono tamponi aggiunta (ad esempio, HEPES) in tutto il protocollo, che è particolarmente critico durante la dissociazione enzimatica.

Una possibile variante di questo protocollo per aumentare ulteriormente la vitalità cellulare è la rimozione del sangue rosso fase di lisi cellulare ACK. Tuttavia, in questo caso, è spesso allora necessario eseguire un passaggio ACK lisi durante la prima settimana di coltura per rimuovere le cellule rosse del sangue. Un altro aspetto di questo protocollo che può essere modificato è l'eliminazione della mielina e detriti cellulari utilizzando una densit di saccarosioy gradiente. Specificamente, altre strategie che sono stati segnalati per migliorare la vitalità cellulare delle cellule microgliali sono possibili anche in questo passaggio, come una discontinua Percoll gradiente di densità ¹⁸ o magnetici perline rimozione mielina.

Infine, la durata tra dissociazione tissutale iniziale e la comparsa di neurosfere varia tra i campioni e può richiedere da una settimana ad un mese o più. Dal momento che le culture iniziali di solito contengono un grado significativo di cellule morte e detriti cellulari, può essere difficile determinare se le cellule vitali rimangono; la coltura deve essere mantenuta per almeno 4 - 8 settimane (Figura 2). Una strategia per isolare cellule in crescita dai detriti rimanere qui viene presentato (cioè invertire filtrare gruppi di cellule e ri-placcatura in mezzi freschi). La decisione sull'opportunità di continuare a mantenere una cultura è in definitiva una decisione caso per caso, sulla base di fattori ° circostantie autopsia (ad esempio, un intervallo post-mortem prolungata, i problemi durante il trasporto dei tessuti), la dissociazione dei tessuti (ad esempio, il sangue eccessivo o detriti), e come il campione appare nella cultura. Una volta che una cultura è stabilito, l'identità deve essere convalidato dal DNA fingerprinting utilizzando analisi tandem repeat breve o un metodo simile, confrontando la coltura ad un campione del tumore originale conservati per questo scopo. Si consiglia di routine la convalida culture DNA fingerprinting per garantire che sia avvenuta nessuna contaminazione da altre culture, ad esempio ogni 3 - 6 mesi.

La generazione di queste culture DIPG derivati ​​da pazienti rappresenta un passo importante nello sviluppo di successo delle terapie efficaci. L'espansione dei modelli derivati ​​da pazienti culture DIPG e xenotrapianto disposizione sarà fondamentale per individuare le strategie terapeutiche più efficaci e, infine, superare questa malattia devastante.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hibernate-A	Gibco	A12475-01
HBSS con calcio / magnesio	Gibco	24020-117
HBSS	Corning	21-022-CV
HEPES	Gibco	15630-080
Liberase DH (Collagenasi / Dispasi)	Roche	5401054001
DNAse I	Worthington	Biochemical LS002007
Saccarosio	Sigma	S0389
Gibco	antibiotico/antimicotico	15240-096
Neurobasal-A	Gibco	10888-022
DMEM/F12	Gibco	11330-032
GlutaMAX-I (100x)	Gibco	35050-061
Piruvato di sodio (100 mM)	Gibco	11360-070
Integratore di B27 Meno Vitamina A	Gibco	12587-010
MEM Aminoacidi non essenziali (100x)	Gibco	11140-050
Umano PDGF-AA	Shenandoah Biotecnologia	100-16
Umano PDGF-BB	Shenandoah Biotecnologia	100-18
Umano EGF	Shenandoah Biotecnologia	100-26
Umano FGF	Shenandoah Biotechnology	100-146
Lame sterili per bisturi	Bard Paker	372610
Emostatici curvi	Strumenti di scienza	fine 13013-14
Lame di rasoio	VWR	55411-050
Piatto per coltura cellulare 100 x 20 mm	Corning	353003
Pinze sterili	TWD Tradewinds	DF8988-5
Teli sterili	3M	2037
Guanti sterili	Kimberly Clark	1182307
ACK Lysis Buffer	Gibco	A1049201
Filtro a rete da 100 micron	Fisher	352360
Provetta conica da 50 mL	Fisher	1495949A