Qui, vi presentiamo un protocollo per isolare microglia da cuccioli di topo postnatale (giorno 1) per la sperimentazione in vitro. Questo metodo improvvisato di isolamento genera sia elevata resa e purezza, un vantaggio significativo rispetto ai metodi alternativi che consente un'ampia gamma sperimentazione ai fini di chiarire biologia microglia.
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Articolo metodologico
Rapid e raffinato CD11b isolamento magnetico di primaria microglia con purezza migliorata e versatilità
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Microglia sono i responder primari a insulti del sistema nervoso centrale; Tuttavia, molto resta sconosciuto circa il loro ruolo nella regolazione neuroinfiammazione. La microglia sono cellule mesodermiche che funzionano in modo simile ai macrofagi nel rilevamento stress infiammatorio. La classica (M1-type) ed alternativa (M2-type) attivazioni dei macrofagi sono stati anche esteso ad microglia nel tentativo di meglio comprendere l'interazione sottostante questi fenotipi hanno in condizioni neuroinfiammatori quali il Parkinson, morbo di Alzheimer e il morbo di Huntington. Nella sperimentazione vitro utilizzando microglia primaria offre risultati rapidi ed affidabili che possono essere estese per l'ambiente in vivo. Anche se questo è un chiaro vantaggio rispetto sperimentazione in vivo, isolando microglia mentre raggiungere adeguati rese di purezza ottimale è stata una sfida. I metodi più comuni attualmente in uso o soffrono di bassa recupero, bassa purezza, o di entrambi. Qui, abbiamo DEMstrare un perfezionamento del metodo di separazione magnetica senza colonne CD11b che realizza un recupero delle cellule elevata e una maggiore purezza in metà tempo. Proponiamo questo metodo ottimizzato come modello altamente utile di isolamento microgliali primario ai fini di studio neuroinflammation e neurodegenerazione.
Introduzione
Microglia sono macrofagi residenti Myb indipendenti di origine mesodermica che differenziano da c-kit + / CD45- progenitori nelle isole sanguigni del sacco vitellino 1, 2 erythromyeloid. Una volta microglia embriologici hanno colonizzato il sistema nervoso centrale (CNS), la fase di transizione da un ameboide ad una forma ramificata 3. Questi microglia adulti sono classificati come surveillant dal loro ramificazioni dinamiche sondare il parenchima cerebrale sano per i potenziali insulti 4. Sebbene microglia contribuiscono solo a circa il 10% della popolazione cellulare CNS, la loro capacità di piastrelle tra di loro assicura scansione massima del parenchima 4, 5. Modelli pericolo associati molecolari (smorza), come α-sinucleina 6, 7 e 8 β-amiloide, o ppattern molecolari athogen-associati (PAMPs) come lipopolisaccaride (LPS) 9, attivano classicamente microglia per promuovere una risposta infiammatoria caratterizzata da reversione allo stato attivo amoeboid e la produzione di ossido nitrico, fattore di necrosi tumorale-α (TNF), interleuchina 1β (iL-1β), iL-6, iL-12, e il motivo CC chemochina ligando 2 9, 10, 11. In condizioni neuroinfiammatorie come il morbo di Parkinson, in cui patogeni α-sinucleina ha accumulato, un ciclo neurodegenerativa è creato dalla morte dei neuroni dopaminergici, che rilasciano più aggregate α-sinucleina, promuovendo un'ulteriore attivazione classica della microglia 7. Simile a macrofagi periferici, microglia può anche avere la capacità di attivare alternativamente in presenza di citochine antinfiammatorie IL-4 e IL-10, dando loro la potenteial di promuovere la riparazione neurale e attenuando l'infiammazione 2, 11. A parte i loro ruoli immunologici nel SNC, microglia sono stati descritti come regolatori vitali della circuiteria neuronale potatura sinapsi durante lo sviluppo. Ad esempio, i topi hanno Cx3cr1- KO microglia meno dense e ridotta potatura sinaptica, che porta ad una sovrabbondanza di spine dendritiche immature, sinapsi, ei modelli elettrofisiologici di un sottosviluppato CNS 12. La comprensione di queste complessità fisiologici ei diversi ruoli funzionali della microglia nell'omeostasi del sistema nervoso centrale è fondamentale per la ricerca di terapie rivolte malattie neurodegenerative.
Nel settore della neuroimmunologia, esperimenti in vitro sono altamente desiderabile a causa della maggiore fattibilità per studi meccanicistici, i minori costi di manutenzione, e per essere meno tempo e laborioso. Furthermori, la possibilità di isolare popolazioni di cellule è fondamentale per delineare la funzionalità di tali cellule bersaglio nelle condizioni prescritte. Numerosi metodi di isolamento microgliali esistono, ma sono limitati dalla loro capacità di ottenere numeri relativamente elevati e purezza per un'ampia sperimentazione 13, 14, 15. Ad esempio, un cluster di differenziazione 11b (CD11b) è un marcatore di superficie comune dei monociti, macrofagi e microglia 16. Sfruttando CD11b, un metodo di separazione magnetica è stata descritta come un approccio basato su colonne che ha dato ~ 99,5% di purezza e ~ 1,6 x 10 6 microglia per neonatale cervello 17. Il nostro laboratorio ha recentemente sviluppato un CD11b metodo di separazione magnetica senza colonne 15, che abbiamo eseguito in un tubo di polistirene mediante codifica CD11b con un anticorpo monoclonale coniugato con ficoeritrina (PE). Una Seconda bispecificoanticorpo ry a PE e complessi destrano con il PE. Una volta legato, particelle magnetiche destrano rivestite vengono introdotti, che si legano alla fine destrano del complesso anticorpo. Infine, il tubo polistirolo viene collocato in un magnete per l'isolamento della microglia. Questo approccio raddoppiato il rendimento a ~ 3,2 x 10 6 microglia al cervello neonatale, ma a costo di ridurre purezza a ~ 97%.
Qui, dimostriamo una rapida e raffinato privo di colonna CD11b magnetico protocollo di differenziazione (Figura 1). Questo metodo perfezionato rimane fattibile come nostro metodo libero-colonna originale poiché il prezzo del kit separazione magnetica CD11b è lo stesso. Il tempo di completamento è ridotta a metà, che può essere cruciale per massimizzare la sopravvivenza delle cellule e la resa. In particolare, la purezza ottenuto da questo metodo ottimizzato è ~> 99%, un netto miglioramento rispetto alla purezza raggiunto dal metodo originale senza colonne sviluppato dal nostro laboratorio 15. Ancora più importante, CD11b-PEnon è utilizzata, eliminando la necessità di incubare lontano dalla luce e permettendo l'utilizzo del canale rosso per microscopia a fluorescenza. Infine, come nel metodo originale CD11b, una frazione astrocitaria di elevata resa e purezza è ottenuto con questo procedimento perfezionato. Gli astrociti sono più numerose cellule gliali nel sistema nervoso centrale, che porta l'idea che le loro funzioni omeostatiche sono indispensabili in relazione alla fisiopatologia 18. Queste cellule gliali svolgono un ruolo in diverse funzioni fisiologiche quali formano la barriera emato-encefalica, che fornisce il supporto di nutrienti, mantenendo neurotrasmettitore omeostasi, la formazione di cicatrici gliali in risposta al danno, neuroprotezione, l'apprendimento e la memoria, e neuroinfiammazione, esemplificando il loro potenziale di indagine in gliale biologia 19. Morfologia e la funzionalità della microglia e astrociti sono state accertate tramite microscopia confocale, Western blotting, quantitativa Real-Time Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR), Gtest nitriti Riess, e il test multiplex citochina Luminex. La raffinatezza fornita da questo protocollo offre una maggiore fiducia di pertinenza di purezza microglia o astrociti, più ampia applicazione della microscopia a fluorescenza con la disponibilità del canale rosso, e fa risparmiare tempo, che sono tutti importanti per la sperimentazione in vitro.
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Protocollo
L'uso degli animali e delle procedure di protocollo è stato approvato e supervisionato dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso (IACUC) alla Iowa State University (Ames, IA, Stati Uniti d'America)
1. Coltivazione di colture gliali miste
- Decapitare 1- 2 giorni di età cuccioli rapidamente con le forbici che operano 5.5 pollici, e posizionare le teste immediatamente in un tubo da 50 ml su ghiaccio. Si noti che questa decapitazione è la modalità di eutanasia.
- In una cappa flusso laminare, fare una piccola incisione nel cranio e meningi con le forbici micro-dissezione dritto 4,5 pollici. Iniziare il taglio dall'estremità caudale all'estremità rostrale (naso). Prendi sotto la pelle utilizzando l'apertura formata dalla decapitazione.
- Dopo l'incisione, sbucciare uno degli emisferi al lato. Quindi utilizzare un paio di pinzette curve o ad uncino per rimuovere l'intero cervello.
- Immergere il cervello (s) in una nuova provetta da 50 ml contenente 0,25% tripsina-ethylenediaminetetraacetate acido (EDTA) per 15 minuti in un bagno d'acqua 37 ° C. Utilizzare 2 ml di tripsina-EDTA per il cervello.
- Lavare il cervello (s) con Media fresco crescita (10% FBS, DMEM / F12, 1% di penicillina / streptomicina, 1% L-glutammina, 1% piruvato di sodio, e l'1% di acidi non essenziali amino) aggiungendo e rimuovendo il media. Ripetere questa 4x.
- Per ogni cervello, piatto due T-75 flaconi contenenti terreni di crescita. Quindi, aggiungere 2 ml di terreni di crescita per il cervello al tubo. Così, sarà un equivalente di 1 mL di cervello omogeneizzati con 8-9 ml di terreni di crescita per T-75 pallone.
- Omogeneizzare triturando cervello (s) con pipette di diverse dimensioni di apertura, in ordine dal più grande al più piccolo. Quando è visibile che il tessuto cerebrale non è sempre più piccolo, passaggio al successivo pipetta. Al termine della triturazione, la sospensione deve essere chiaro, senza blocchi visibili.
- Utilizzare una pipetta 25 mL, 5 mL pipetta, e poi a 10 mL pipetta in modo sequenziale.
- Superare ogni omogenizzazionesospensione enous cervello attraverso un colino cella 70 um a farne una singola coltura cellulare.
- Per ogni cervello omogeneizzata, piastra due T-75 beute contenenti mezzi di crescita, come descritto nel passaggio 1,5 (1 mL di cervello omogeneizzati con 8-9 ml di terreni di crescita per T-75 pallone).
- Cambiare i media crescita dopo 6 d e crescere fino a quando l'isolamento il 16 ° giorno.
2. Isolamento di cellule microgliali
- Dopo 16 giorni, rimuovere i mezzi di crescita dal pallone e metterlo in un tubo da 50 ml fresca. Aggiungere 3 ml 0,25% tripsina-EDTA per ciascun pallone T-75. Agitare i flaconi per 5 minuti a temperatura ambiente su un agitatore orbitale.
- Centrifugare i mezzi di crescita rimossi al 0,4 xg per 5 min e utilizzare per fermare la reazione tripsina-EDTA nel passaggio successivo.
- Dopo aver agitato per 5 minuti, aggiungere un minimo di 4 ml di terreni di crescita (fresco o il supporto usato da 2.1.1) per arrestare la reazione tripsina-EDTA.
- Triturare per garantire che tutta la cells sono staccati.
- Dopo triturazione, passare le cellule attraverso un colino cella 70 um a farne una singola coltura cellulare, eseguire una conta cellulare, e poi centrifugare le cellule a 0,4 xg per 5 min.
- Per ogni 100 x 10 6 cellule (circa 15 x T-75 beute), usare 1 mL di media positiva (2% FBS, DPBS (calcio e magnesio libero-cloruro), 1 mM EDTA) per risospendere il pellet cellulare.
NOTA: Tutte le seguenti operazioni sono su misura per una separazione 1 ml. - Prendere una provetta 5 polistirene, aggiungere 1 ml di supporti consigliati, e segnare il menisco. Aggiungi media consigliato fino a 2,5 mL e segnare anche questo. Eliminare la media positiva e trasferire le cellule risospese al tubo di polistirene da 5 ml.
- Aggiungere 50 microlitri di siero di ratto per ogni 1 ml di cellule sospese. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Preparare cocktail selezione mescolando 25 microlitri del componente A e 25 ml di componente B. Questi componenti sono proprietari.
- Aggiungere 501; L del cocktail di selezione per le cellule. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: per le culture più puri, ripetere il punto 2.9 (raccomandato ma non obbligatorio). - microsfere vortex per 45 s. Aggiungere 80 ml di microsfere per 1 ml di campione. Incubare per 3 minuti a temperatura ambiente.
- Portare il volume a 2,5 ml nel tubo di polistirene aggiungendo i supporti consigliati.
- Inserire il tubo nel magnete per 3 minuti a temperatura ambiente. Regolare l'incubazione per aumentare la purezza. Versare lentamente fuori i supporti consigliati in un tubo da 15 ml con il magnete ancora nel tubo di polistirene.
- Ripetere il punto 2.12 tre volte di più. incubazioni magnetici addizionali possono essere eseguite per aumentare la purezza.
- Aggiungere 3 ml di terreni di crescita e di contare il numero di cellule utilizzando un contatore di cellule.
- cellule piastra di conseguenza in Poly-D-lisina (PDL) piastre Rivestiti per trattamenti. Trattare le cellule 48 ore dopo la semina piastre inPDL rivestite. Questo permette alle cellule di recuperare dallo stress della separazione.
NOTA: Check la purezza della coltura utilizzando immunocitochimica come descritto in precedenza 15. - Piatto frazione negativo (raccolti in una provetta da 15 ml), che contiene principalmente astrociti, in T-75 palloni in mezzo di crescita.
- Dopo almeno 6 ore di incubazione a 37 ° C incubatore, cambiare il supporto e lasciarlo crescere O / N. Dividere gli astrociti il giorno successivo per i trattamenti.
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Risultati
Microglia isolato utilizzando il kit CD11b selezione positiva II hanno elevata purezza
microglia primarie di topo sono stati isolati utilizzando il protocollo sopra indicata e piastrate su vetrini poli-D-lisina rivestite controllare la purezza di isolamento. Diecimila cellule sono state piastrate per pozzetto e analisi immunocitochimica è stata effettuata utilizzando ionizzato adattatore molecola legante il calcio 1 (Iba1) come u...
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Discussione
Vecchi metodi di isolamento della microglia hanno recuperi limitate che non sono appropriati per varie proteine analisi mediante Western blot e RNA analisi da qRT-PCR. L'adesione differenziale e metodi tripsinizzazione miti sono due approcci comuni con basse rese microgliali 13, 14, 15. L'approccio CD11b basata su colonne ha anche bassa recupero, ma raggiunge una maggiore purezza del seguire differenziale e tripsinizz...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH) Sovvenzioni: NS088206 e ES026892. L'W. Eugene e Linda Lloyd sedia dotata di AGK e Deans cattedra di AK sono anche riconosciuti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| EasySep CD11b Kit di Separazione II | StemCell Technologies | 18970 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Piruvato di Sodio | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Aminoacidi non essenziali (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutammina (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Sigma | 13H469 | |
| 0,25% tripsina-EDTA | Gibco di Life Technologies | 25200 | |
| Dulbecco's PBS (DPBS) | Gibco di Life Technologies | 14190250 |
Riferimenti
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