Estrazione del sale sequenziale delle proteine della cromatina associata è uno strumento utile per determinare le proprietà di associazione dei complessi della proteina grande. Questo metodo può essere impiegato per valutare il ruolo delle singole subunità o domini dell'affinità complessiva di una proteina complessa di massa della cromatina.
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Articolo metodologico
Estrazioni sequenziale sale per l'analisi di massa di cromatina associazione proprietà di complessi di rimodellamento della cromatina
In questo articolo
Sommario
Abstract
Delucidazione delle proprietà dell'associazione di proteine della cromatina-targeting può essere molto impegnativa a causa della natura complessa della cromatina e la natura eterogenea dei mammiferi più complessi modificante la cromatina. Per superare questi ostacoli, abbiamo adattato un'analisi sequenziale estrazione del sale (SSE) per valutare le affinità relativa di legame dei complessi cromatina associato. Questo test semplice e può essere utilizzato da non esperti per valutare la differenza relativa affinità di due complessi correlati, i cambiamenti nell'affinità di un complesso quando una subunità viene persa o un singolo dominio è inattivato e il cambiamento in obbligatoria affinità di legame dopo alterazioni al paesaggio della cromatina. Sospendendo in sequenza nuovamente alla rinfusa della cromatina in quantità crescenti di sale, siamo in grado di profilare l'eluizione di una particolare proteina dalla cromatina. Utilizza questi profili, siamo in grado di determinare come le alterazioni in un complesso modificante la cromatina o alterazioni all'ambiente della cromatina influenzano interazione di legame. SSE di accoppiamento con altri saggi in vitro e in vivo , possiamo determinare i ruoli dei singoli domini e delle proteine sulla funzionalità di un complesso in una varietà di ambienti di cromatina.
Introduzione
Regolamento del DNA in cellule eucariotiche è un sistema complesso e sofisticato che è strettamente controllato da un assortimento di proteine che coordinano le risposte agli stimoli intracellulari ed extracellulari. DNA è avvolto intorno octamers dell'istone di nucleosomi forma, che possono essere liberamente distribuiti lungo DNA o compattati in bobine stretto1. Questo arrangiamento strutturale del DNA e gli istoni è detta cromatina, che è regolata da una rete di proteine che leggere, scrivere e cancellare le modifiche post traduzionale (PTM) su istoni2. Alcune istone PTMs, quali acetilazione, cambiare la carica dell'a....
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Protocollo
1. preparazioni
- preparare 100 mL di soluzione ipotonica Buffer a: 0,3 M saccarosio, 60 mM KCl, 60 mM Tris-HCl pH 8.0, 2mm EDTA e 0,5% NP-40. Conservare a 4 ° c.
Nota: Alcune linee cellulari, ad esempio di HEK293T, richiedono condizioni meno rigorose di lisante. Se i nuclei lisare facilmente, usare modifica Buffer a: 25 mM HEPES pH 7,6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl 2, EDTA 0,05 mM, 0,1% NP-40 e 10% glicerolo. - Preparare una soluzione madre di 250 mL di soluzione di x mRIPA 2: 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 2% NP-40 e 0,5% sodio desossicolato.
- Preparare una soluzione stock di 100 mL di 5 M NaCl.
- Con i 2 x mRIPA e 5m NaCl soluzi....
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Risultati
In questa carta, si dimostrano i vantaggi e le applicazioni del metodo di estrazione del sale comunemente usato sequenziale (SSE) che abbiamo adattato dalla letteratura6. Nella Figura 1, mettiamo a confronto la riproducibilità di SSE all'estrazione delle proteine non sequenziale rilevando i modelli di eluizione di ARID1a e PBRM1. Osserviamo costantemente che ARID1a, una subunità BAF, eluisce principalmente a 200mm NaCl e PBRM1, un'escl.......
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Discussione
Caratterizzazione delle interazioni della proteina e della cromatina attraverso estrazioni sale è un metodo comune che è stato impiegato per decenni14,15; Tuttavia, esso non è stato sistematicamente ottimizzato prima di rivelare la sua utilità completo. Dimostriamo come questo metodo sequenza consente di distinguere le modifiche nell'associazione della cromatina quando la proteina o per l'ambiente è alterata in modo rapido e poco costoso. SSE è altamente adattabi.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nessun concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da un premio di studioso di V (V2014-004) e un erudito V plus award (D2016-030) dalla Fondazione V for Cancer Research e un American Cancer Society istituzionale Research Grant (ACS IRG Grant 58-006-53) al centro di Università di Purdue per cancro Ricerca. E. g. P. è stato sostenuto dal Borch Graduate Endowment Award al reparto di farmacologia molecolare e chimica farmaceutica di Purdue University.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cloruro di sodio, cristallo 2,5 kg AR (ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| saccarosio, cristallo 500 g AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| Cloruro di potassio, granulare 500 g AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base, standard primario e tampone, >=99,9% (titolazione), cristallino | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA (etilenedinitrilo) acido tetraacetico, sale disodico, diidrato 125 G AR (ACS) | avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES Buffer soluzione (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| cloruro di magnesio, 6-idrato, cristallo 500 g AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| GLYCEROL, 1L | Amresco | 0854-1L | |
| ACIDO DESOSSICOLICO SALE SODICO, 100g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus pipetta | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R microcentrifuga refrigerata | Eppendorf | 5424 R | |
| Proteina secondaria di topo IgG HRP-linked | Segnalazione cellulare | 7076 | |
| Segnalazione cellulare secondaria di coniglio IgG legata a HRP | 7074 | ||
| Anticorpo BMI-1 Anticorpo | Millipore | ||
| PBRM1 Anticorpo | Etilico | A301-591A | |
| Anticorpo ARID1a | Santa Cruz | sc-32761 | |
| Anticorpo BRD4 | Etile | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| Doxorubicina | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| Mini Gel Tank | ThermoFisher | A25977 | |
| Albumina, Bovina (BSA) | Amresco | 0332-100g | Utilizzato come soluzione al 5% in PBS-T come soluzione bloccante per Western blot |
| Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus Scala di proteine prestained Scale, da 10 a 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| Methyl Alcool, anidro | Macron | 3041-10 | |
| Tripsina kEDTA, 1X | Cellgro | 25-053-CI | |
| SODIO AZIDE, 250g UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| SODIO DODECIL SOLFATO (SDS)500g UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| Glicina, per elettroforesi, >=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop Provette per microcentrifuga, polipropilene | VWR | 20170-333 | |
| 1000 &; L Punte per pipette | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris Gel prefabbricati 4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| Leupeptin emisolfato, 5 MG | RPI Research Products | 22035-0.005 | Utilizzato per la soluzione di inibitore della proteasi. |
| APROTININA, 10 MG | RPI Research Products | 20550-0.01 | Utilizzato per la soluzione inibitore della proteasi. |
| PEPSTATINA A, 5 MG | RPI Research Products | 30100-0.005 | Utilizzato per la soluzione inibitore della proteasi. |
| OVCA429 celle | Dono di Karen Cowden Dahl. Ph.D. | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| Celle HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A media | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| Minimo Essenziale Mezzo (MEM), Polvere | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA (100X) aminoacido non essenziale | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11: Siero fetale bovino, U.S. Source | Omega Scientific | FB-11 | |
| Soluzione di penicillina-streptomicina | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| piruvato di sodio | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR Power Fonte | : VWR | 13-690-032 |
Riferimenti
- Ramakrishnan, V. Histone structure and the organization of the nucleosome. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).
- Musselm....
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Ristampe e permessi
