Estrazioni sequenziale sale per l'analisi di massa di cromatina associazione proprietà di complessi di rimodellamento della cromatina

Summary

Estrazione del sale sequenziale delle proteine della cromatina associata è uno strumento utile per determinare le proprietà di associazione dei complessi della proteina grande. Questo metodo può essere impiegato per valutare il ruolo delle singole subunità o domini dell'affinità complessiva di una proteina complessa di massa della cromatina.

Abstract

Delucidazione delle proprietà dell'associazione di proteine della cromatina-targeting può essere molto impegnativa a causa della natura complessa della cromatina e la natura eterogenea dei mammiferi più complessi modificante la cromatina. Per superare questi ostacoli, abbiamo adattato un'analisi sequenziale estrazione del sale (SSE) per valutare le affinità relativa di legame dei complessi cromatina associato. Questo test semplice e può essere utilizzato da non esperti per valutare la differenza relativa affinità di due complessi correlati, i cambiamenti nell'affinità di un complesso quando una subunità viene persa o un singolo dominio è inattivato e il cambiamento in obbligatoria affinità di legame dopo alterazioni al paesaggio della cromatina. Sospendendo in sequenza nuovamente alla rinfusa della cromatina in quantità crescenti di sale, siamo in grado di profilare l'eluizione di una particolare proteina dalla cromatina. Utilizza questi profili, siamo in grado di determinare come le alterazioni in un complesso modificante la cromatina o alterazioni all'ambiente della cromatina influenzano interazione di legame. SSE di accoppiamento con altri saggi in vitro e in vivo , possiamo determinare i ruoli dei singoli domini e delle proteine sulla funzionalità di un complesso in una varietà di ambienti di cromatina.

Introduction

Regolamento del DNA in cellule eucariotiche è un sistema complesso e sofisticato che è strettamente controllato da un assortimento di proteine che coordinano le risposte agli stimoli intracellulari ed extracellulari. DNA è avvolto intorno octamers dell'istone di nucleosomi forma, che possono essere liberamente distribuiti lungo DNA o compattati in bobine stretto¹. Questo arrangiamento strutturale del DNA e gli istoni è detta cromatina, che è regolata da una rete di proteine che leggere, scrivere e cancellare le modifiche post traduzionale (PTM) su istoni². Alcune istone PTMs, quali acetilazione, cambiare la carica dell'amminoacido sono depositati, alterando le interazioni tra gli istoni e il DNA². Istone PTMs servono anche a reclutare regolatori trascrizionali, remodelers della cromatina, apparato di riparazione di danni del DNA e replicazione del DNA a specifiche regioni del genoma³.

Maggior parte dei metodi per lo studio delle interazioni della cromatina o sonda interazioni su piccola scala o coinvolgere grandi analisi genoma. Studi di binding in vitro spesso utilizzano i singoli domini ricombinanti con istone peptidi o DNA in saggi quali analisi di spostamento di elettroforesi di mobilità (EMSA), calorimetria isotermica di titolazione, polarizzazione di fluorescenza e peptide trazioni alla lat machine. Perché queste analisi in genere concentrano su un dominio di singole proteine, essi facilitano la comprensione di un piccolo pezzo del puzzle, ma non ci permettono di capire la natura cooperativa di proteine multidominio, figuriamoci il loro ruolo in multi-proteina complessi. Dalla composizione eterogenea dei mammiferi più complessi modificante la cromatina è aggiunto un ulteriore livello di complessità. Questa eterogeneità di proteina, in combinazione con la natura dinamica del paesaggio della cromatina, rende difficile per ricapitolare l' in vivo collegamento interazioni di proteine cromatiniche a cromatina in vitro.

Metodi in vivo hanno fatto progressi significativi; Tuttavia, sono spesso costoso, richiede tempo e tecnicamente impegnativo. Immunoprecipitazione della cromatina seguita da sequenziamento (ChIP-seq) è molto utile per determinare la localizzazione delle proteine e modificazioni istoniche in tutto il genoma, ma richiede notevole ottimizzazione⁴. Le proteine sono spesso reticolato di cromatina per preservare interazioni; Tuttavia, questo può produrre interazioni artificiale e potrebbe causare epitopo⁵di mascheramento. Inoltre, l'immunoprecipitazione (IP) richiedono anticorpi altamente specifici e vasta ottimizzazione di taglio del DNA e condizioni IP da ChIP-qPCR utilizzando un sito di legame noto, che spesso non è disponibile a priori. Dopo l'ottimizzazione delle condizioni di ChIP, elaborazione dei campioni è costosa e richiede parecchie settimane ai mesi di sequenza e analizzare. Anche se questo metodo ha un valore inestimabile per identificare la localizzazione della cromatina associata proteine in tutto il genoma, il costo e impegno di tempo rendono proibitivo per utilizzare questo metodo per generare le ipotesi su come piccole modifiche possono influenzare le proprietà di associazione globale .

In questo articolo, descriviamo come un'analisi sequenziale estrazione del sale (SSE) può essere usata per esaminare i profili di associazione globale di cromatina-proteine e distinguere come cambi in un profilo proteico, complesso, o globale PTM possono alterare le interazioni. Anche se le estrazioni sale sono una tecnica comunemente e ampiamente utilizzata, dimostriamo come questo metodo sequenza è altamente riproducibile e versatile. SSE permette di caratterizzare come una singola subunità di un complesso o anche un singolo dominio contribuisce l'affinità complessiva del complesso per cromatina alla rinfusa. SSE può essere utilizzata anche per determinare se l'associazione di una proteina è influenzato dai cambiamenti nel paesaggio della cromatina, fornendo interessanti ipotesi per istone mark targeting che possono essere confermate mediante ChIP-seq e altri studi di ampia del genoma.

Abbiamo adattato originariamente questo metodo da Wu et al., per esaminare la funzione di Polybromo1 (PBRM1) nell'associazione del PBAF della cromatina remodeler^6,7. Utilizzando questa tecnica, abbiamo determinato il ruolo di PBRM1 per l'associazione di cromatina all'interno del complesso di rimodellamento della cromatina PBAF e quindi determinato il contributo relativo della sei bromodomains singoli per questa funzione⁷.

Qui descriviamo come ottimizzare questo metodo per esplorare associazione della cromatina in diversi tipi cellulari, per valutare l'affinità obbligatoria relativa della cromatina simile modifica complessi, per esaminare lo spostamento di una proteina dalla cromatina da un inibitore chimico, e per determinare gli effetti dell'associazione di cromatina dopo alterazioni al paesaggio della cromatina.

Protocol

1. preparazioni

1. preparare 100 mL di soluzione ipotonica Buffer a: 0,3 M saccarosio, 60 mM KCl, 60 mM Tris-HCl pH 8.0, 2mm EDTA e 0,5% NP-40. Conservare a 4 ° c.
   Nota: Alcune linee cellulari, ad esempio di HEK293T, richiedono condizioni meno rigorose di lisante. Se i nuclei lisare facilmente, usare modifica Buffer a: 25 mM HEPES pH 7,6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl ₂, EDTA 0,05 mM, 0,1% NP-40 e 10% glicerolo.
2. Preparare una soluzione madre di 250 mL di soluzione di x mRIPA 2: 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 2% NP-40 e 0,5% sodio desossicolato.
3. Preparare una soluzione stock di 100 mL di 5 M NaCl.
4. Con i 2 x mRIPA e 5m NaCl soluzioni, preparare 50 mL di soluzione di x mRIPA 1 per ciascuno dei sei concentrazioni saline: 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM e 500 mM NaCl. Prima di iniziare l'esperimento, raffreddare tutte le soluzioni su Ice.
5. Grow linee sotto condizioni desiderate cellulari.
   Nota: Per determinare gli effetti di abbattere una proteina, SSE per la linea di colpo deve essere confrontata con le cellule wildtype. Questi SSE deve essere eseguita fianco a fianco. Per esempi di utilizzo di inibitori chimici o stimoli, fare riferimento alle sezioni 3-5.

2. Estrazione del sale sequenziale base

1. raccolto 8 milioni di cellule di ogni condizione e lavare due volte con 5 mL di PBS freddo ghiaccio.
   Nota: È fondamentale disporre di ugual numero di cellule ad avere concentrazioni di proteine equivalente. Il numero esatto delle cellule potrebbe essere necessario essere ottimizzato per linee cellulari individuali o particolari proteine. È importante non avere troppi, come l'aumento nelle concentrazioni di proteina impedirà osservazione della curva eluizione, che dipende dall'associazione di equilibrio. Tuttavia, con troppo poche cellule potrebbe non esserci abbastanza proteine per rilevare la curva e il pellet di cromatina è più difficile da isolare e possono essere persi tra frazioni.
2. Risospendere le cellule in 1 mL di tampone A + inibitori della proteasi, trasferimento in provette da 1,5 mL Centrifuga micro e ruota superiore sopra la parte inferiore a 4 ° c per 10 min.
3. Isolare nuclei mediante centrifugazione a 6000 x g per 5 min a 4 ° c.
   Nota: Dopo questo passaggio la busta nucleare dovrebbe essere ancora intatta. Se l'involucro nucleare è intatta, il pellet sarà risospendere completamente; Tuttavia, quando la busta viene lisata e la cromatina è rilasciata, il pellet non verrà nuovamente sospeso. Se la busta nucleare non è intatta dopo incubazione di tampone A, utilizzare per volta A. Buffer
4. Aggiungere 200 µ l di mRIPA 0 mM NaCl + proteasi inibitori ad ogni pellet di nuclei prima di ri-sospendere pellet. Omogeneizzare ogni campione pipettando 15 volte con una pipetta da 1 mL. Il pellet dovrebbe risospendere facilmente, tuttavia, i nuclei saranno lisare come esso è dispensato e il campione diventerà denso e appiccicoso e difficile da dispensare.
   1. Al fine di redigere il pellet nella punta, tocca alla fine della punta della pipetta contro il fondo della provetta centrifugo. Il pellet non si dissolva completamente una volta che il DNA viene rilasciato dai nuclei, ma pipettaggio romperà up.
5. Quando tutti i campioni sono stati omogeneizzati, incubare tutti i campioni sul ghiaccio per 3 min.
   Nota: Il tempo di incubazione potrebbe essere necessario essere ottimizzati a seconda della proteina di interesse.
6. Pellet di cromatina isolare mediante centrifugazione dei campioni per 3 min a 6500 x g a 4 ° c.
Tubo
7. surnatante di trasferimento ad una centrifuga pulito 1,5 mL. Questa sarà la frazione di 0 mM. Questa soluzione di mRIPA di 0 mM può agire come un passaggio di lavaggio alla lisi i nuclei e rimuovere eventuali proteine sciolti non associate con cromatina.
8. Aggiungere 200 µ l di mRIPA 100 mM NaCl + proteasi inibitori per ogni pallina di cromatina prima di ri-sospendere pellet. Rompere il pellet di cromatina pipettando il pellet su e giù per 15 volte.
   Nota: È fondamentale per essere coerente con il numero di volte il pellet in pipettato.
9. Incubare in ghiaccio per 3 min. Questa fase di incubazione consente di raggiungere uno stato di equilibrio, che è particolarmente importante quando ci sono più campioni tutti i campioni.
10. Centrifuga a 6500 x g per 3 min a 4 ° c e trasferirlo surnatante in una provetta pulita da 1,5 mL.
11. Ripetere 2.6-2.10 per le restanti concentrazioni saline.
    Nota: Dopo 400 mM NaCl, mRIPA il pellet dovrebbe essere chiaro e salse brodose e non rimarrà nella parte inferiore del tubo. Il pellet può essere posizionato nel coperchio della provetta da centrifuga mentre il surnatante isolato.
12. Aggiungere 70 µ l di 4 x carico di proteine tingere di ciascuna frazione e caricare 30 µ l di ciascuna frazione su un gel di acrilammide SDS per l'analisi western blot.
    Nota: Per determinare il profilo di associazione della proteina, è fondamentale per caricare volumi equivalenti delle concentrazioni di proteina uguale lisato, piuttosto che carico.
13. Eseguire una macchia occidentale standard trasferendo su una membrana e utilizzare gli anticorpi primari per le proteine di interesse.
14. Per quantificare le proteine eluite dalla cromatina, incubare la macchia in anticorpi secondari di fluorescenza a raggi infrarossi IRDye e immagine della macchia con un imager. Mentre possono essere utilizzati altri metodi di sviluppo, si consiglia di fluorescenza o imaging a raggi infrarossi, come è più quantitativa in natura.
15. Uso ImageJ o software simili per calcolare l'intensità per la proteina eluita a ciascuna concentrazione salina. Rappresentando graficamente l'intensità di banda contro la concentrazione di sale, il modello di eluizione della vostra proteina di interesse può essere determinato.

3. Estrazione del sale sequenziale in presenza di un " lettore " inibitore

1. raccolto due insiemi di celle (4 milioni) e isolare i nuclei come un standard SSE.
2. Risospendere entrambi i set in 200 µ l di mRIPA 0 mM NaCl e incubare per 3 min. Questo permetterà per la rimozione di qualsiasi proteina libera nei nuclei.
3. Aggiungere 200 µ l mRIPA 0 mM NaCl per ogni pallina. Aggiungere l'inibitore (2 µ l di 1 mM (+) JQ1) per un campione e DMSO al gruppo di controllo.
4. Agitare il pellet di pipettaggio 15 volte e incubare in ghiaccio per 5 min.
5. Centrifuga a 6500 x g per 3 min a 4 ° c e trasferirlo surnatante in una provetta pulita da 1,5 mL.
6. Ripetere 3.3-4 per tutte le concentrazioni saline ed eseguire una macchia occidentale standard.

4. Estrazione del sale sequenziale in presenza di un " scrittore " inibitore

1. trattare le cellule con l'inibitore (10 µM SAHA) o DMSO per 3 h.
2. Raccogliere 4 milioni di cellule per ogni trattamento.
3. Eseguire una standard SSE per i campioni con l'inibitore aggiunto a tutti i buffer.

5. Sequenziale sale estrazione seguente danno del DNA

1. trattare le cellule con 1 doxorubicina µM per 1 h.
2. Cambiare il supporto sulle cellule e consentire loro di recuperare per 3 h.
3. Raccogliere 8 milioni di cellule ed eseguire lo SSE base.

6. Estrazione del sale non-sequenziale

1. raccogliere le cellule 12 milioni e lavare con PBS.
2. Dividere celle in modo che ci sono 2 milioni di cellule per micro provetta.
3. Risospendere in 500 µ l di tampone A e incubare per 10 min.
4. Isolare i nuclei mediante centrifugazione a 6000 x g.
5. Risospendere pellet in un 200 µ l di ciascuno dei buffer di mRIPA + NaCl.
6. Omogeneizzare ogni campione pipettando 15 volte con una punta di Pipetta 1ml.
7. Incubare in ghiaccio per 3 min.
8. Isolare la cromatina mediante centrifugazione a 6500 x g e trasferire il surnatante per pulire i tubi. Aggiungere 70 µ l di colorante di carico ed eseguire 30 µ l su un gel di SDS-page per l'analisi western blot.

Results

In questa carta, si dimostrano i vantaggi e le applicazioni del metodo di estrazione del sale comunemente usato sequenziale (SSE) che abbiamo adattato dalla letteratura⁶. Nella Figura 1, mettiamo a confronto la riproducibilità di SSE all'estrazione delle proteine non sequenziale rilevando i modelli di eluizione di ARID1a e PBRM1. Osserviamo costantemente che ARID1a, una subunità BAF, eluisce principalmente a 200mm NaCl e PBRM1, un'escl...

Discussion

Caratterizzazione delle interazioni della proteina e della cromatina attraverso estrazioni sale è un metodo comune che è stato impiegato per decenni^14,15; Tuttavia, esso non è stato sistematicamente ottimizzato prima di rivelare la sua utilità completo. Dimostriamo come questo metodo sequenza consente di distinguere le modifiche nell'associazione della cromatina quando la proteina o per l'ambiente è alterata in modo rapido e poco costoso. SSE è altamente adattabi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloruro di sodio, cristallo 2,5 kg AR (ACS)	Avantor/Macron	7581-06
saccarosio, cristallo 500 g AR¨ (ACS)	Avantor/Macron	8360-04
Cloruro di potassio, granulare 500 g AR¨ (ACS)	Avantor/Macron	6858-04
Trizma(R) base, standard primario e tampone, >=99,9% (titolazione), cristallino	Sigma-Aldrich	T1503-1kg
EDTA (etilenedinitrilo) acido tetraacetico, sale disodico, diidrato 125 G AR (ACS)	avantor/Macron	4931-02
NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082	Amresco	E109-100ML
HEPES Buffer soluzione (1M)	Gibco	15630-080
cloruro di magnesio, 6-idrato, cristallo 500 g AR¨ (ACS)	Avantor/Macron	5958-04
GLYCEROL, 1L	Amresco	0854-1L
ACIDO DESOSSICOLICO SALE SODICO, 100g	Amresco	0613-100G
Eppendorf Research plus pipetta	Fisher Scientific	13-690-032
Eppendorf 5424 R microcentrifuga refrigerata	Eppendorf	5424 R
Proteina secondaria di topo IgG HRP-linked	Segnalazione cellulare	7076
Segnalazione cellulare secondaria di coniglio IgG legata a HRP		7074
Anticorpo BMI-1 Anticorpo	Millipore
PBRM1 Anticorpo	Etilico	A301-591A
Anticorpo ARID1a	Santa Cruz	sc-32761
Anticorpo BRD4	Etile	A301-9852a
(+) JQ1	Cayman Chemical Company	11187
SAHA	Cayman Chemical Company	10009929
Doxorubicina	AK Scientific	25316-40-9
Dimetil solfossido (DMSO)	Macron	4948-02
Mini Trans-Blot Cell	BioRad	1703930
Mini Gel Tank	ThermoFisher	A25977
Albumina, Bovina (BSA)	Amresco	0332-100g	Utilizzato come soluzione al 5% in PBS-T come soluzione bloccante per Western blot
Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x)	Life Technologies	B0001
Bolt LDS Sample Buffer (4x)	Life Technologies	B0007
PageRuler Plus Scala di proteine prestained Scale, da 10 a 250 kDa	ThermoFisher	26619
Methyl Alcool, anidro	Macron	3041-10
Tripsina kEDTA, 1X	Cellgro	25-053-CI
SODIO AZIDE, 250g UN1687	Amresco	0639-250G
SODIO DODECIL SOLFATO (SDS)500g UN1325	Amresco	0227-500G
Glicina, per elettroforesi, >=99%	Sigma-Aldrich	G8898-1kg
BigTop Provette per microcentrifuga, polipropilene	VWR	20170-333
1000 &; L Punte per pipette	VWR	83007-382
NuPAGE Bis-Tris Gel prefabbricati 4-12%	Invitrogen	NW04125BOX
Leupeptin emisolfato, 5 MG	RPI Research Products	22035-0.005	Utilizzato per la soluzione di inibitore della proteasi.
APROTININA, 10 MG	RPI Research Products	20550-0.01	Utilizzato per la soluzione inibitore della proteasi.
PEPSTATINA A, 5 MG	RPI Research Products	30100-0.005	Utilizzato per la soluzione inibitore della proteasi.
OVCA429 celle	Dono di Karen Cowden Dahl. Ph.D.
HEK293T	ATCC	CRL-3216
Celle HeLa	ATCC	CCL-2
McCoy's 5A media	Corning Mediatech	10-050-CV
DMEM	Corning Mediatech	10-013-CV
Minimo Essenziale Mezzo (MEM), Polvere	Corning Mediatech	50-011-PC
MEM NEAA (100X) aminoacido non essenziale	Gibco	11140-050
FB-11: Siero fetale bovino, U.S. Source	Omega Scientific	FB-11
Soluzione di penicillina-streptomicina	Life Technologies	15140-122
Glutamax	Life Technologies	35050-061
piruvato di sodio	Life Technologies	11360070
VWR Power Fonte	: VWR	13-690-032