La modellazione dello sviluppo del cervello umano è stata ostacolata a causa della complessità senza precedenti del tessuto epiteliale neurale. Qui viene descritto un metodo per la generazione robusta di organoidi cerebrali per delineare gli eventi precoci dello sviluppo del cervello umano e per modellare la microcefalia in vitro.
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Articolo metodologico
Generazione di IPSC-derivati cervello umano organoidi per creare un modello disturbi dello sviluppo neurologico precoce
In questo articolo
Sommario
Abstract
La limitata disponibilità di modelli in vitro adatti che possano rappresentare in modo affidabile lo sviluppo complesso del cervello umano è un collo di bottiglia significativo che limita la traduzione della ricerca di base sul cervello in applicazioni cliniche. Mentre le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) hanno sostituito le cellule staminali embrionali umane eticamente discutibili, gli studi di differenziazione neuronale basati su iPSC rimangono descrittivi a livello cellulare, ma non riescono a fornire adeguatamente i dettagli che potrebbero essere derivati da un complesso tessuto cerebrale umano 3D.
Questa lacuna è ora colmata attraverso l'applicazione di organoidi cerebrali 3D derivati da iPSC, "Brains in a dish", che modellano molte caratteristiche del complesso sviluppo del cervello umano. Qui viene descritto un metodo per generare organoidi cerebrali 3D derivati da iPSC. Gli organoidi possono aiutare a modellare la microcefalia primaria autosomica recessiva (MCPH), un raro disturbo dello sviluppo neurologico umano. Una spiegazione ampiamente accettata per la malformazione cerebrale nella MCPH è un esaurimento del pool di cellule staminali neurali durante le prime fasi dello sviluppo del cervello umano, un difetto di sviluppo difficile da ricreare o dimostrare in vitro.
Per studiare l'MCPH, abbiamo generato iPSC da fibroblasti derivati da pazienti portatori di una mutazione nella proteina centrosomica CPAP. Analizzando la zona ventricolare degli organoidi cerebrali 3D della microcefalia, abbiamo dimostrato la differenziazione prematura dei progenitori neurali. Questi organoidi cerebrali 3D sono un potente sistema in vitro che sarà determinante nella modellazione di disturbi cerebrali congeniti indotti da sostanze chimiche neurotossiche, infezioni virali neurotrofiche o mutazioni genetiche ereditarie.
Introduzione
disturbi dello sviluppo neurologico umana, come la microcefalia, possono essere studiate solo male in modelli animali a causa del fatto che il cervello umano ha una superficie corticale estesa, una caratteristica unica diversa da animali non umani.
Questo aspetto rende lo sviluppo del cervello umano un processo complesso che non può essere studiato sufficientemente in 2D, nel sistema di coltura cellulare in vitro. Emergenti tecniche di coltura 3D consentono la generazione di organoidi tessuto simile da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs). La differenziazione in vitro di cellule staminali pluripotenti ....
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Protocollo
1. Generazione di Brain organoidi (23 giorni)
- Avvio di neuroectoderma (5 giorni)
Nota: I seguenti punti dovrebbero essere considerati prima dell'inizio della differenziazione. Il metodo riprogrammazione (ecc lentiviral-, basata microRNA Sendai-virus-, episomal-, o) per ottenere iPSCs umani dovrebbe essere idealmente la stessa per tutti i pazienti e controllare linee IPSC. Vari kit e le istruzioni sulla base di protocolli pubblicati riprogrammazione sono disponibili 15, 16, 17, 18. La qualità d....
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Risultati
La generazione di organoidi cerebrali richiede almeno tre settimane di coltura continua (Figura 1A). Per ottenere risultati riproducibili, è consigliabile che il ricercatore documenta ogni passo e, soprattutto, evita alcuna modifica per quanto riguarda i componenti di media, punti di tempo, e la manipolazione delle cellule. Qui, diamo una sintesi di come valutare se le tappe critiche sono raggiunti al fine di ottenere organoidi di qualità sufficiente alla fine dell'e.......
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Discussione
MCPH è un disordine dello sviluppo neurologico umana complessa che non può essere ricapitolato in modelli animali in vivo o in cultura semplici cellule umane in vitro si avvicina. La manifestazione clinica della MCPH comincia ad apparire durante il primo trimestre, quando comincia presto neurogenesi. Così, organoidi cerebrali in 3D rappresentano un sistema sperimentale affidabile per modellare lo sviluppo MCPH. Inoltre, 3D organoidi cervello umano sono un approccio ideale in quanto i) che consentono l&.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Fritz Thyssen (Az.10.14.2.152). Siamo grati alla struttura del tessuto embedding e la struttura di base del microscopio di CMMC. Siamo grati per le discussioni e il supporto tecnico forniti dai membri del Laboratorio per Centrosome e citoscheletro Biology. Ringraziamo Li Ming Gooi per la correzione delle bozze del manoscritto.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anticorpo secondario anti-topo 488 | Invitrogen | A-11001 | anticorpo secondario anti-topo di capra (H + L), Alexa Fluor 488 |
| Anti-coniglio 647 | Invitrogen | A-21245 | anticorpo secondario IgG (H+L) anti-coniglio di capra, Alexa Fluor 647 |
| Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B anticorpo policlonale di coniglio. |
| Sistema CELLSPIN | IBS Integra Bioscience | 183001 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, US | 32670 | 4′,6-Diamidino-2-fenilindolo dicloridrato; fornitori multipli |
| DMEM/F-12 | Gibco, US | 31331093 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Miscela di nutrienti F-12 |
| Dorsomorphin | Sigma-Aldrich, US | P5499 | Composto C; fornitori multipli |
| Terreno di inclusione | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol; terreno di inclusione; fornitori multipli |
| Matrice Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Matrice | Corning | 354277 | Matrigel hESC-qualificata; importante: gelatina |
| di pesce qualificata hESC | Sigma-Aldrich, US | G7765-250ML | Gelatina da pelle di pesce d'acqua fredda; fornitori multipli; autoclave dopo l'aggiunta a PBS per sciogliere e sterilizzare, conservare a 4 ° C |
| Glycine | AppliChem | A1067,1000 | Glicina per la biologia molecolare; fornitori multipli |
| Ansa di inoculazione con ago, monouso (1 & micro; L) | Sigma Aldrich, Stati Uniti | BR452201-1000EA | fornitori multipli |
| Insulina | Sigma-Aldrich, US | I3536-100MG | fornitori multipli |
| L-glutammina | Gibco, US | 25030081 | L-glutammina (200 mM) |
| Tecnologie delle cellule staminali | del mezzo A | #05850 | mTeSR1 (hiPSC medium) |
| Medium B | cell technologies | #05835 | Medium induction medium (NIM); mezzo di differenziazione neurale |
| Medium C | Gibco, US | 21103049 | Neural Basal Medium |
| MEM | Gibco, US | 11140035 | MEM soluzione di aminoacidi non essenziali (100x) |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza, Svizzera | #LT07-218 | Kit di rilevamento del micoplasma; fornitori multipli |
| Nestin | Novus biologicals | NBP1-92717 | Nestin anticorpo monoclonale di topo (4D11) |
| Paraformaldeide (PFA) | AppliChem | A3813, 0500 | 4% in PBS, soluzione di stoccaggio a -20 gradi C; Attenzione: indossare protezioni per la pelle e gli occhi e lavorare sotto il cappuccio |
| PBS compresse | Gibco, Stati Uniti | 18912014 | Vedere produttore istruzioni; fornitori multipli |
| Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL) | Gibco, US | 15140122 | Fornitori multipli |
| Soluzione di poli-L-lisina (PLL) | Sigma-Aldrich, US | P8920-100ML | Fornitori multipli |
| pVim | MBL | D076-3S | Fosfo-Vimentina (Ser55) |
| mAb Reagente A | Tecnologie delle cellule staminali | # 05872 | Nota al protocollo 1.1.1.2; ReLSR (reagente per la selezione e il passaggio di cellule ES e iPS umane prive di enzimi); Si prega di seguire manufactorer´ s protocollo; prodotti alternativi da più fornitori disponibili |
| Reagente B | Sigma-Aldrich, US | A6964-100ML | La soluzione Accutase è una soluzione enzimatica per la dissociazione di singole cellule; fornitori multipli; protocollo 1.1.2 "soluzione di dissociazione cellulare enzimatica" |
| Ricerca Criostato Leica CM3050 S Leica | biosystems | CM3050 S | Fornitori multipli |
| SB431542 Selleckchem.com | S1067 | Fornitori multipli | |
| Pallone rotante 250 mL | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
| Sucrose | AppliChem | A4734, 1000 | Fornitori multipli |
| Superfrost ultra plus vetrini per microscopio | Thermo scientific, US | J3800AMNZ | I vetrini devono essere etichettati con un "+" e caricati positivamente |
| Integratore 1 | Gibco, US | 17502048 | Integratore N-2 (100x) |
| Integratore 2 senza vitamina A | Gibco, US | 12587010 | integratore B-27 (50x), meno vitamina A; fornitori multipli |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | Fornitori multipli |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura, NL | 4583 | Fornitori multipli |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | Fornitori multipli |
| TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | β-Tubulin III (policlonale di coniglio) |
| TUNEL assay | Promega, US | G3250 | DeadEnd Fluorometric TUNEL system; fornitori multipli |
| Tween 20 per biologia molecolare | AppliChem | A4974,0500 | Fornitori multipli |
| foglio impermeabile | BEMIS company, inc. | PM996 | Parafilm " M”; fornitori multipli |
| Y-27632 | Selleckchem.com | S1049 | ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); fornitori multipli |
| β-mercaptoetanolo | Gibco, US | 31350010 | 2-mercaptoetanolo (50 mM); fornitori multipli |
Riferimenti
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2013).
- Eiraku, M., Sasai, Y. Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues. Na....
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Ristampe e permessi
