Un protocollo per caratterizzare i cambiamenti morfologici di Clostridium difficile In risposta al trattamento antibiotico

Summary

L'efficacia degli antibiotici è più comunemente determinata conducendo studi cinetici di uccisione e misurando le unità formanti colonie (CFU). Integrando la microscopia elettronica a scansione (SEM) con questi metodi standard, possiamo distinguere gli effetti farmacologici del trattamento tra i diversi antibiotici.

Abstract

La valutazione dell'azione antibiotica con il nuovo sviluppo di farmaci verso batteri anaerobici è difficile e tecnicamente esigente. Per ottenere una visione di possibili MOA, i cambiamenti morfologici associati all'esposizione agli antibiotici possono essere visualizzati utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM). L'integrazione dell'immagine SEM con le curve di uccisione tradizionali può migliorare la nostra comprensione nell'azione dei farmaci e promuovere il processo di sviluppo del farmaco. Per testare questa premessa, le curve di uccisione e gli studi SEM sono stati condotti utilizzando farmaci con noti ma diversi MOA (vancomicina e metronidazolo). Le cellule C. difficile (R20291) sono state coltivate con o senza la presenza di antibiotico fino a 48 ore. Durante l'intervallo di 48 ore, le cellule sono state raccolte in più punti temporali per determinare l'efficacia antibiotica e per l'imaging sul SEM. In linea con le precedenti relazioni, la vankomicina e il metronidazolo avevano un'attività battericida significativa dopo 24 h di trattamento misurata con unità di colonia-formatore (CFU)ting. Utilizzando l'imaging SEM abbiamo determinato che metronidazolo avesse effetti significativi sulla lunghezza delle cellule (> 50% di riduzione della lunghezza cellulare per ogni antibiotico, P <0,05) rispetto ai controlli e alla vankomicina. Mentre la risposta fenotipica al trattamento farmacologico non è stata documentata in precedenza in questo modo, essi sono coerenti con la MOA del farmaco che dimostra la versatilità e l'affidabilità dell'immagine e delle misurazioni e l'applicazione di questa tecnica per altri composti sperimentali.

Introduction

Clostridium difficile è un batterio gram-positivo, che forma spore, causando circa 500.000 infezioni annuali negli Stati Uniti e viene considerato un livello di rischio pericoloso da parte dei centri per la prevenzione e la prevenzione delle malattie (CDC), il livello più elevato di rischio. La decade passata ha visto notevoli sviluppi di farmaci in antimicrobici con attività contro C. difficile . ^{2 , 3} Studi in vitro sono una componente necessaria del processo di sviluppo del farmaco. ⁴ Tradizionalmente, in vitro suscettibilità e studi sul ....

Protocol

1. Isolamento di C. difficile da diverse fonti ambientali o cliniche

1. Isolati ambientali: Utilizzando un calibro di cotone pre-sterilizzato (leggermente bagnato con 0,85% NaCl), tamponare la superficie di qualsiasi area di interesse (pavimento, porta, maniglia, mensola, ecc. ). ⁸ Assicurati di indossare guanti sterili e posizionare il tampone in un tubo sterilizzato dopo il completamento.
2. Isolati clinici (sgabello): Piastra da 10 a 100 mg di campioni clinici di sgabello su cefoxitin-cicloserina-fruttosio agar (CCFA) utilizzando un ciclo di inoculazione e incubare in condizioni anaerobiche rigorose per 48-7....

Results

Clostridium difficile è un batterio che forma spore e quindi è essenziale determinare le differenze morfologiche tra cellule vegetative e spore prima di qualsiasi analisi funzionale. La Figura 1 mostra immagini rappresentative di cellule vegetative che sono state catturate durante la fase esponenziale della curva di crescita e delle cellule di spore. Come descritto, le cellule vegetative sono strutture lunghe e lisce, mentre le spore sono piccole strutture ovali.......

Discussion

L'obiettivo dello studio è stato quello di creare un metodo ad alto throughput per l'isolamento di C. difficile e la prova di suscettibilità antibiotica utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM) come mezzo per una caratterizzazione più approfondita dell'azione farmacologica dell'antibiotico. Utilizzando i protocolli descritti qui, abbiamo dimostrato che l'imaging della risposta fenotipica della cellula al trattamento antibiotico può rivelare una visione dell'azione farmaco.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
garza di cotone	Caring	PRM21408C
NaCl	Macron	7532
provette da 50 mL	Falcon	352098
Brain Heart Infusion (BHI)	Criterio:	C5141
L-cisteina	Alfa Aesar	A10389
estratto di lievito	Criterio:	C741
taurocolato di sodio,	Alfa Aesar	A18346
camera anaerobica, camera anaerobica	vinilica	Coy
, cicloserinecefoxitin, fruttosio, agar (CCFA), piastre	Anaerobe Systems	AS-213
piastre per agar sanguigno	Hardy diagnostics	A-10
reagente per agglutinazione al lattice	Oxoid	DR1107A	C. diff kit per test
microcentrifuga	Eppendorf	222363204
PBS	Gibco	10010-031
4% paraformaldeide	Fisher Scientific	50-259-98
vetrini per microscopio	J. Melvin freed marca	7525M	75 x 25mm
cappa di flusso	Labconco	Classe II tipo A2	armadio di biosicurezza
macchina sputtering da tavolo	Denton Vacuum	Desk II
nastro	Nucleo in plastica	05072-AB	SPI Nastro biadesivo in carbonio
oro	Denton Vacuum	TAR001-0158	2.375 " Diametro x .002" Microscopio elettronico a scansione con lamina d'oro spessa
	FEI	XL-30