Un protocollo per caratterizzare i cambiamenti morfologici di Clostridium difficile In risposta al trattamento antibiotico

Summary

L'efficacia degli antibiotici è più comunemente determinata conducendo studi cinetici di uccisione e misurando le unità formanti colonie (CFU). Integrando la microscopia elettronica a scansione (SEM) con questi metodi standard, possiamo distinguere gli effetti farmacologici del trattamento tra i diversi antibiotici.

Abstract

La valutazione dell'azione antibiotica con il nuovo sviluppo di farmaci verso batteri anaerobici è difficile e tecnicamente esigente. Per ottenere una visione di possibili MOA, i cambiamenti morfologici associati all'esposizione agli antibiotici possono essere visualizzati utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM). L'integrazione dell'immagine SEM con le curve di uccisione tradizionali può migliorare la nostra comprensione nell'azione dei farmaci e promuovere il processo di sviluppo del farmaco. Per testare questa premessa, le curve di uccisione e gli studi SEM sono stati condotti utilizzando farmaci con noti ma diversi MOA (vancomicina e metronidazolo). Le cellule C. difficile (R20291) sono state coltivate con o senza la presenza di antibiotico fino a 48 ore. Durante l'intervallo di 48 ore, le cellule sono state raccolte in più punti temporali per determinare l'efficacia antibiotica e per l'imaging sul SEM. In linea con le precedenti relazioni, la vankomicina e il metronidazolo avevano un'attività battericida significativa dopo 24 h di trattamento misurata con unità di colonia-formatore (CFU)ting. Utilizzando l'imaging SEM abbiamo determinato che metronidazolo avesse effetti significativi sulla lunghezza delle cellule (> 50% di riduzione della lunghezza cellulare per ogni antibiotico, P <0,05) rispetto ai controlli e alla vankomicina. Mentre la risposta fenotipica al trattamento farmacologico non è stata documentata in precedenza in questo modo, essi sono coerenti con la MOA del farmaco che dimostra la versatilità e l'affidabilità dell'immagine e delle misurazioni e l'applicazione di questa tecnica per altri composti sperimentali.

Introduction

Clostridium difficile è un batterio gram-positivo, che forma spore, causando circa 500.000 infezioni annuali negli Stati Uniti e viene considerato un livello di rischio pericoloso da parte dei centri per la prevenzione e la prevenzione delle malattie (CDC), il livello più elevato di rischio. La decade passata ha visto notevoli sviluppi di farmaci in antimicrobici con attività contro C. difficile . ^{2 , 3} Studi in vitro sono una componente necessaria del processo di sviluppo del farmaco. ⁴ Tradizionalmente, in vitro suscettibilità e studi sul tempo sono stati utilizzati per convalidare futuri studi sugli animali e altri in vivo .

Mentre questi metodi servono un ruolo importante per valutare l'azione di uccisione, non catturano la risposta fenotipica delle cellule al trattamento farmacologico. Incorporando la scansione microscopia elettronica (SEM) con standardGli studi cinetici di uccisione, è possibile una caratterizzazione più approfondita degli effetti diretti antibiotici. ^{5 , 6 , 7} Ecco qui un metodo in cui SEM viene utilizzato come un mezzo per profilare l'efficacia del trattamento antibiotico.

Protocol

1. Isolamento di C. difficile da diverse fonti ambientali o cliniche

1. Isolati ambientali: Utilizzando un calibro di cotone pre-sterilizzato (leggermente bagnato con 0,85% NaCl), tamponare la superficie di qualsiasi area di interesse (pavimento, porta, maniglia, mensola, ecc. ). ⁸ Assicurati di indossare guanti sterili e posizionare il tampone in un tubo sterilizzato dopo il completamento.
2. Isolati clinici (sgabello): Piastra da 10 a 100 mg di campioni clinici di sgabello su cefoxitin-cicloserina-fruttosio agar (CCFA) utilizzando un ciclo di inoculazione e incubare in condizioni anaerobiche rigorose per 48-72 h. Conservare le colonie isolate di C. difficile in crisiali a -80 ° C per ulteriori analisi. ^{7 , 9 , 10}
3. Arricchire i campioni di tampone ambientale nel brodo di infusione del cuore del cervello (BHI) con il taurocholato di sodio allo 0,05% e collocare in una camera anaerobica a 37 ° CPer 5 giorni. Centrifugare 1 ml della coltura a 10.000 xg e risospendere il pellet in 100 μL di etanolo.
4. Piattare le cellule risospese (50 μL) sulle piastre di cicloserinecefossiin fruttosio agar (CCFA) e incubare in una camera anaerobica a 37 ° C per 40-48 h. Conservare le colonie isolate di C. difficile in crisiali a -80 ° C per ulteriori analisi.
5. Testare sospette colonie C. difficile utilizzando il reagente di agglutinazione del lattice o PCR.

2. Coltura delle procedure cinetiche di C. difficile e di uccisione

1. Crescere ceppi purificati ambientali o clinici di C. difficile sulle piastre di agarico in una camera anaerobica a 37 ° C per 48 ore.
2. Prendere una colonia isolata con un anello di inoculazione, trasferirlo in 5 ml di media BHI in un tubo da 15 ml e crescere per 24 ore in una camera anaerobica a 37 ° C.
3. Diluire le pre-colture da 1: 100 a circa 10 ⁶ unità di formazione della coloniaS (CFU) / ml in BHIS fresco pre-ridotto (BHI plus estratto di lievito da 5 g / L e 1% di L-cisteina) integrato con taurocolato sodico 0,1% e la concentrazione appropriata di antibiotico (T0).
4. Raccogliere un campione da 1 ml con una pipetta ad ogni punto temporale (T0, T6, T24, T48) e piastrellare / spargere una piccola aliquota (100 μL in diluizioni seriali) su una piastra di agar sangue. Lasciare che le cellule crescano sulla piastra agarica per 48 ore in una camera anaerobica a 37 ° C e contano il numero risultante di colonie per determinare CFU.

3. Preparazione di campioni per la scansione della microscopia elettronica

1. Raccogliere 1 mL di cellule da ogni punto di tempo nei tubi di microcentrifuga e centrifugare a 10.000 xg per 10 minuti. Scartare il surnatante e lavare le cellule in PBS.
2. Centrifugare i campioni a 10.000 xg per 10 min e scartare il surnatante. Diluire le cellule in 1 ml di 4% di paraformaldeide e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
3. Ripetere nuovamente campioni per 10 minuti a 10,000 xg e scartare il supernatante. Lavare le cellule due volte con acqua distillata e ridilizzare in 100 μL di acqua distillata. Regolare il volume in base alla torbidità della soluzione.
   NOTA: fare una serie di diluizioni multiple è una buona idea.
4. Il coperchio dell'etichetta copre e aggiunge 40 μL del campione. Incubare per 15 minuti in un cappuccio di flusso per evaporare il liquido e permettere alle cellule di aderire alla copertura. Se il liquido è ancora presente, utilizzare un soffiatore per rimuovere il liquido.
5. Posizionare le copertine contrassegnate con le celle in una macchina di sputtering della tavola e il nastro in giù. Salva l'oro puro nella macchina di sputtering. Accendere la macchina e avviare sputtering a bassa pressione (50 mTorr). Le cellule di coat per 30 s a 80 mA, che si traduce in 20 nm di rivestimento in oro.
6. Trasferire le cellule rivestite al microscopio elettronico di scansione.

4. Imaging C. difficile Cells su un microscopio elettronico di scansione

1. Sfiatare correttamente il microscopio elettronico di scansione (SEM) per prIl pulsante di sfioramento sul software del computer.
2. Utilizzando nastro in carbonio, fissare le copertine rivestite sul piano metallico. Una volta che il SEM viene sfiato, la porta dovrebbe aprire facilmente. Bloccare la fase metallica nella camera SEM avvitandola.
3. Fare clic sul pulsante PUMP sul software del computer. Il SEM sarà utile quando il sistema legge "Vac OK".
4. Fare clic sul rivelatore SE sotto la linguetta dei rilevatori. Accendere il fascio facendo clic sul pulsante che visualizza la tensione. Avviare l'imaging ad una tensione inferiore (5 kV) prima di aumentare la tensione (fino a 15 kV). Una volta che il fascio è acceso, apparirà un'immagine.
5. Utilizzando la funzione di tracciamento, individuare un'area sulle copertine rivestite per l'immagine. Ingrandire la regione e trovare strutture a forma di bacchetta; Questi sono clostridium difficile .
6. Ingrandire e focalizzare l'immagine per calibrare il sistema. Questo deve essere fatto a più distanze di lavoro: 15, 9 e 5 mm. Immagine a una distanza di lavoro di 5 mm.
7. Accendere l'uLtra ad alta risoluzione e comincia a focalizzare e ottimizzare l'astigmatismo.
8. Iniziare a concentrarsi ad alta ingrandimento. Utilizzare il fuoco grossolano e fine per questo. Regolare anche l'astigmatismo per ottenere un'immagine più chiara.
   1. Regolare l'astigmatismo ad alta ingrandimento. A tal fine, regolare i cambi di astigmatismo (assomigliano alle finestre di messa a fuoco sottile / grossolana) e controllare l'immagine per la chiarezza ingrandendo digitalmente sul software del computer.
9. Se la funzione di scansione lenta per raccogliere un'immagine di alta qualità. Salvare l'immagine raccolta come file .TIFF, che verrà utilizzato per l'analisi. Assicurarsi che la barra dati sia selezionata se le misurazioni saranno effettuate durante l'analisi.
10. Raccogli le immagini ad angoli diversi (fino a 52 ° ruotando manualmente l'angolo direttamente sul SEM. Le immagini angolate tendono a rivelare informazioni più approfondite.
11. Cambiare la tensione del fascio in base alle celle in fase di acquisizione. Tenere questo per la maggior parte tra 5 - 15 kV per tutti gli esperimenti.
12. Al termine dell'immagine, spegnere il fascio e sollevare la distanza di lavoro a 20 mm. La camera può quindi essere scaricata e lo stadio può essere rimosso. Copiare tutte le immagini su un'unità per ulteriori analisi.

5. Elaborazione e analisi delle immagini

1. Scaricare e installare il software libero FIJI (http://fiji.sc) sul computer.
2. Aprire il file immagine in FIJI.
3. Utilizzando la funzione di linea, tracciare con precisione la barra di scala.
4. Fare clic sulla scheda Analizza nel programma FIJI e infine selezionare la funzione Seleziona scala. Apparirà una finestra che richiederà l'impostazione della distanza nota basata sulla barra di scala. Modificare anche l'unità di lunghezza e fare clic su OK.
5. Ora che il programma è calibrato per la distanza, utilizzare la funzione di linea per misurare la lunghezza della cella. Per ottenere la lunghezza, utilizzare la funzione di linea per tracciare la cella nella sua interezza. Seleziona nuovamente la scheda Analizza, quindi fai clic su Misura. La lunghezza dovrebbe appOrecchio nelle unità indicate precedentemente.

Results

Clostridium difficile è un batterio che forma spore e quindi è essenziale determinare le differenze morfologiche tra cellule vegetative e spore prima di qualsiasi analisi funzionale. La Figura 1 mostra immagini rappresentative di cellule vegetative che sono state catturate durante la fase esponenziale della curva di crescita e delle cellule di spore. Come descritto, le cellule vegetative sono strutture lunghe e lisce, mentre le spore sono piccole strutture ovali...

Discussion

L'obiettivo dello studio è stato quello di creare un metodo ad alto throughput per l'isolamento di C. difficile e la prova di suscettibilità antibiotica utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM) come mezzo per una caratterizzazione più approfondita dell'azione farmacologica dell'antibiotico. Utilizzando i protocolli descritti qui, abbiamo dimostrato che l'imaging della risposta fenotipica della cellula al trattamento antibiotico può rivelare una visione dell'azione farmaco...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
garza di cotone	Caring	PRM21408C
NaCl	Macron	7532
provette da 50 mL	Falcon	352098
Brain Heart Infusion (BHI)	Criterio:	C5141
L-cisteina	Alfa Aesar	A10389
estratto di lievito	Criterio:	C741
taurocolato di sodio,	Alfa Aesar	A18346
camera anaerobica, camera anaerobica	vinilica	Coy
, cicloserinecefoxitin, fruttosio, agar (CCFA), piastre	Anaerobe Systems	AS-213
piastre per agar sanguigno	Hardy diagnostics	A-10
reagente per agglutinazione al lattice	Oxoid	DR1107A	C. diff kit per test
microcentrifuga	Eppendorf	222363204
PBS	Gibco	10010-031
4% paraformaldeide	Fisher Scientific	50-259-98
vetrini per microscopio	J. Melvin freed marca	7525M	75 x 25mm
cappa di flusso	Labconco	Classe II tipo A2	armadio di biosicurezza
macchina sputtering da tavolo	Denton Vacuum	Desk II
nastro	Nucleo in plastica	05072-AB	SPI Nastro biadesivo in carbonio
oro	Denton Vacuum	TAR001-0158	2.375 " Diametro x .002" Microscopio elettronico a scansione con lamina d'oro spessa
	FEI	XL-30