Qui, descriviamo un modello di barriera emato-encefalica umana che consente di studiare la trasmigrazione dei linfociti nel sistema nervoso centrale in vitro.
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Articolo metodologico
L'analisi dei linfociti stravaso utilizzo di un
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Linfociti stravaso nel sistema nervoso centrale (CNS) è fondamentale per la sorveglianza immunitaria. alterazioni correlati alla malattia di linfociti stravaso possono provocare alterazioni fisiopatologiche nel SNC. Così, l'indagine della migrazione dei linfociti nel sistema nervoso centrale è importante per capire le malattie infiammatorie del sistema nervoso centrale e di sviluppare nuovi approcci di terapia. Qui vi presentiamo un modello in vitro della barriera emato-encefalica umana per studiare linfociti stravaso. cellule endoteliali microvascolari cerebrali umano (HBMEC) sono confluently coltivate su un tereftalato di polietilene poroso Transwell inserire per imitare l'endotelio della barriera emato-encefalica. funzione di barriera è convalidato dal zonula occludere immunoistochimica, transendoteliale resistenza elettrica (TEER) misurazioni così come l'analisi di Evans blue permeazione. Questo modello permette di indagine della diapedesi delle sottopopolazioni linfocitarie rari come CD56 CD16 luminoso dim / - cellule NK. Furthermminerale, gli effetti di altre cellule, citochine e chemochine, alterazioni legati alla malattia e distinti regimi di trattamento sulla capacità migratoria dei linfociti può essere studiato. Infine, l'impatto degli stimoli infiammatori oltre a diversi regimi di trattamento sulla barriera endoteliale possono essere analizzati.
Introduzione
migrazione dei linfociti dal sangue nei tessuti è cruciale per la sorveglianza immunitaria. Una sequenza di interazioni molecolari specifici assicura portale di stravaso specifico in piccolo intestino, pelle, linfonodi, il sistema nervoso centrale (SNC), e altri tessuti 1. Alterazioni nella migrazione dei linfociti sono coinvolti nella fisiopatologia di diverse malattie larghe diffusione 2. Migrazione nel CNS immuno-privilegiato è strettamente regolato e di conseguenza alterazioni di questo processo sono coinvolti nelle patologie del SNC sono collegati come encefalomielite 3, neuromielite ottica,....
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Protocollo
1. Colture Cellulari del cervello umano cellule endoteliali microvascolari (HBMEC)
- Rivestimento di fiaschi di coltura cellulare
- Per preparare la soluzione di fibronectina, aggiungere 10 ml di PBS in una provetta da centrifuga 15. Aggiungere 150 microlitri fibronectina e mescolare bene.
- Per coprire il fondo un pallone di coltura di cellule T-25 aggiungere 2 mL della soluzione fibronectina. Incubare la beuta di coltura cellulare per almeno 3 ore a 37 ° C in incubatore. Rivestito fibronectina flaconi possono essere conservati per 2 settimane a 37 ° C / 5% di CO 2.
- Semina e coltura cellulare di HBMEC
- s....
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Risultati
Risultati rappresentativi mostrano trasmigrazione di cellule NK e sottoinsiemi di cellule T usando il sangue-cervello modello barriera umana (Figura 1A) sono mostrate. L'integrità del monostrato HBMEC stato convalidato dalla colorazione della molecola giunzioni strette ZO-1, misurazioni transendoteliale resistenza elettrica (Teer), ed Evans blu permeazione (Figura 1B). Dopo 3 - 4 giorni cultura HBMEC espresso molecola giunzioni strette ZO-1 (.......
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Discussione
Qui vi presentiamo una tecnica per indagare la trasmigrazione dei linfociti attraverso la barriera emato-encefalica umana. In vitro analisi della migrazione dei linfociti al sistema nervoso centrale è importante per studiare i processi fondamentali di linfociti stravaso, potenziali alterazioni correlati alla malattia, e nuovi approcci terapeutici.
Diverse modifiche del modello di barriera emato-encefalica sono possibili. Ad esempio, le cellule del compartimento superiore potrebbero .......
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Dichiarazioni
L'autore (o gli autori) ha dichiarato i seguenti potenziali conflitti di interesse in relazione alla ricerca, alla paternità e/o alla pubblicazione di questo articolo: A.S.-M. e U.B. non hanno divulgazioni finanziarie. T. S.-H. ha ricevuto le spese di viaggio e di conferenza da Biogen. N.S. ha ricevuto onorari di relatore e comitato consultivo da Biogen e Novartis Pharma, nonché le spese di viaggio da Biogen. H.W. ha ricevuto un compenso per aver fatto parte di comitati consultivi scientifici/comitati direttivi di Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis e Sanofi-Genzyme. Ha inoltre ricevuto onorari e supporto per il viaggio da Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis e Sanofi-Genzyme. Ha ricevuto un compenso come consulente da Biogen, Merck Serono, Novartis e Sanofi-Genzyme. H.W. ha ricevuto supporto per la ricerca da Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Germania e Sanofi US. C.C.G. ha ricevuto onorari e spese di viaggio per la partecipazione alle riunioni da Genzyme, Novartis Pharma GmbH e Bayer Health Care.
Ringraziamenti
Questo studio è stato supportato dal Centro di Ricerca Collaborativa CRC TR128 "Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease" (Progetto A9 a H.W. e C.C.G., progetto B1 a N.S.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| PBS | Gibco | 14190-094 | senza CaCl2 o MgCl2 |
| Fibronectina 1 mg/mL | Sigma | F1141-5MG | da pallone per |
| coltura cellulare T-25 | Greiner BioOne | 690160 | |
| HBMEC | ScienCell | 1000 | |
| Pelobiotech | PB-H-6023 | ||
| Accutase | Sigma | A6964-100ML | |
| ECM-b | ScienCell | 1001-b | |
| FBS | ScienCell | 1001-b | |
| Penicillina/Streptomicina | ScienCell | 1001-b | |
| Integratore per la crescita delle cellule endoteliali | ScienCell | 1001-b | |
| Transwell | Corning | 3472 | trasparente, diametro 6,5 mm, 3,0 e micro; m dimensione dei pori |
| Piastra a fondo piatto a 96 pozzetti | Corning | 3596 | |
| Evans blue | Sigma | E2129-10G | soluzione madre: 1 g/50 mL PBS |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50x concentrato |
| Infinite M200Pro | Tecan | ||
| Piastra a fondo piatto nera a 96 pozzetti | Greiner BioOne | 675086 | |
| piastra a 48 pozzetti | Corning | 3526 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 61870-010 | |
| Fluorosfere per il conteggio del flusso | Beckman Coulter | 7547053 | |
| Na-EDTA | Sigma | E5134 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Citometro a flusso a 10 colori | Gallios Beckman Coulter | ||
| Kaluza 1.5a | Beckman Coulter | ||
| TNF-&alfa; | Peprotech | 300-01A | |
| IFN-γ | Peprotech | 300-02 | |
| CD3-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 300430 | clone UCHT1 |
| CD56-PC7 | Beckman Coulter | A21692 | clone N901 |
| CD16-A750 | Beckman Coulter | A66330 | clone 3G8 |
| CD4-FITC | Biolegend | 300506 | clone RPA-T4 |
| CD8-A700 | Beckman Coulter | A66332 | clone B9.11 |
Riferimenti
- Ransohoff, R. M., Kivisakk, P., Kidd, G. Three or more routes for leukocyte migration into the central nervous system. Nat Rev Immunol. 3 (7), 569-581 (2003).
- Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-1....
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