L'incubazione prolungata di acuta neuronale tessuto per Elettrofisiologia e Calcio imaging

Sommario

Una volta rimosso dal corpo, tessuto neuronale è fortemente influenzata dalle condizioni ambientali, con conseguente eventuale degradazione del tessuto dopo 6 - 8 h. Utilizzando un metodo incubazione unica, che monitora e regola l'ambiente extracellulare del tessuto, vitalità del tessuto può essere significativamente prolungata per> 24 h.

Abstract

Acuta preparati tessuto neuronale, fettine di cervello e della retina wholemount, di solito può essere mantenuta solo per 6-8 ore dopo la dissezione. Ciò limita il tempo sperimentale, e aumenta il numero di animali che sono utilizzate per studio. Questa limitazione in particolare gli impatti protocolli come l'imaging di calcio che richiedono una prolungata pre-incubazione con coloranti vasca da applicare. crescita batterica esponenziale entro 3 - 4 h dopo il taglio è strettamente correlata con una diminuzione della salute dei tessuti. Questo studio descrive un metodo per limitare la proliferazione di batteri preparati acute per mantenere il tessuto neuronale vitale per periodi prolungati di tempo (> 24 h) senza la necessità di antibiotici, procedure sterili o terreni di coltura contenenti fattori di crescita. Con ciclismo liquido extracellulare tramite irradiazione UV e mantenendo il tessuto in una camera di contenimento personalizzati 15 - 16 ° C, il tessuto non mostra differenze nelle proprietà elettrofisiologiche, o si calciognaling attraverso coloranti intracellulari di calcio a> 24 h postdissection. Questi metodi non solo estendere il tempo di sperimentazione per coloro che utilizzano il tessuto neuronale acuta, ma ridurrà il numero di animali necessari per completare gli obiettivi sperimentali, e stabiliscono un gold standard per l'incubazione del tessuto neuronale acuta.

Introduzione

Elettrofisiologia e di imaging funzionale (calcio, tensione di coloranti sensibili) sono due delle tecniche sperimentali più comunemente utilizzati nel campo delle neuroscienze. preparati fetta del cervello e della retina wholemount, che sarà esaminato qui, forniscono un mezzo per esaminare le proprietà elettrofisiologiche e connettività sinaptica senza contaminazione da anestetici o miorilassanti. Fettine di cervello e della retina wholemount mantenere la loro integrità strutturale, a differenza di culture o omogenati cellulari, permettendo lo studio di circuiti specifici e reti del cervello ^1. Le registrazioni dal tessuto isolato presentano vantaggi rispetto vivo registrazioni i movimenti connessi con il battito cardiaco e la respirazione sono eliminati. Inoltre, la visualizzazione diretta permette specifiche classi di celle da mirati, e l'applicazione locale di strumenti farmacologici ^{2, 3.}

registrazioni patch-clamp e calcIUM Dye-carico in wholemount retina è complicato dalla presenza di Inner Limitazione membrana (ILM), che copre lo strato di cellule gangliari della retina (RGC) e impedisce l'accesso diretto alle cellule. Tipicamente, questa membrana è raschiato via con una pipetta di vetro per consentire l'applicazione diretta di una pipetta di patch e la formazione di un sigillo gigaohm su una singola cella. Inoltre, coloranti calcio bagno-applicata non attraversano la ILM e devono o essere iniettato sotto questa membrana ^4, retrograda trasportato dopo l'iniezione al nervo ottico o ⁵ elettroporate attraverso il tessuto ^6. Inoltre, quando si utilizza un modello di roditore di retinite pigmentosa, il mouse rd / rd, la ILM è più spessa e più impenetrabile. Qui, si usa una tecnica per rimuovere il ILM con digestione enzimatica ^7, per consentire sia onnipresente calcio dye-carico e l'accesso diretto alle cellule gangliari della retina per recordi patch-clampngs ^8.

registrazioni di successo da entrambi fettine di cervello o wholemount retina dipendono da dissezione e l'incubazione del tessuto neuronale vitali. Tipicamente, il tessuto viene estratto il mattino dell'esperimento ed incubato nel liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) fino al suo utilizzo per le registrazioni. Di solito, il tessuto rimane vitale per 6 - 8 ore, con notevole degrado in seguito questa finestra temporale. Tuttavia, entrambe le fettine di cervello e preparati RETINÆ wholemount solito producono più tessuto che può essere registrata all'interno di questo breve periodo di tempo. Di conseguenza, il tessuto è spesso scartata alla fine della giornata e la dissezione è completata nuovamente nei giorni successivi. Questo significa che un altro animale è utilizzato e ~ 2 ore di messa a punto e la dissezione / colorazione ripetuto. Il protocollo che segue descrive un metodo per prolungare la durata del tessuto neuronale per più di 24 ore, il che significa meno animali vengono utilizzati, e il tempo più sperimentale è disponibile. Tissue vitalità wvalutata attraverso la registrazione di proprietà elettrofisiologiche e le dinamiche del calcio, e queste proprietà erano indistinguibili tra <4 ore e> 24 ore postdissection.

Questi risultati indicano che non solo sono proprietà delle celle singole intatte e funzionali dopo incubazione prolungata, ma l'attività di rete, come valutato dal calcio-imaging e registrazioni elettrofisiologiche, è invariato> 24 h postdissection. Inoltre, dimostriamo che coloranti calcio possono rimanere nelle cellule per periodi prolungati senza provocare effetti dannosi. L'applicazione di questo protocollo dimostra che l'attività funzionale dei neuroni nel tessuto neuronale acuta può essere mantenuta per lunghi periodi, una volta che l'ambiente esterno è altamente regolata. Inoltre, come la vitalità del tessuto varia notevolmente tra i laboratori a causa di diversi protocolli di incubazione, questo metodo stabilisce un gold standard per i parametri ideali che dovrebbero essere applicati per ridurre la variabilità nella salute di Neu acutatessuto Ronal.

Protocollo

Il protocollo seguente descrive la preparazione di C57BL / 6 e C3H / He (retinally degeneri) tessuto neuronale mouse, ma le tecniche simili possono essere applicati ad altre specie. Tutti gli animali erano sani e maneggiato con condizioni standard di temperatura, umidità, 12 ore di luce / buio ciclo, libero accesso a cibo e acqua, e senza stimoli di stress previsti. Tutti gli esperimenti sono stati approvati ed eseguiti in accordo con il comitato Occidentale Sydney University cura degli animali e etica e secondo l'uso animale e le linee guida per la cura degli animali (Research Autorità # A9452, # A10396 e # A8967).

1. Cervello Fetta Preparazione

1. Anestetizzare l'animale per inalazione di isoflurano (5%) e decapitare utilizzando una ghigliottina roditore. Rimuovere il cervello rapidamente, come descritto in precedenza ⁹ e posizionarlo nella soluzione ghiacciata fisiologica (aCSF) contenente (in mM): 125 NaCl, KCl 2,5, 1 MgCl _2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 2 CaCl _2, 25NaHCO _3, 25 destrosio, e saturata con CarboGen (95% O _2/5% della miscela di CO _2; 310 mOsm; pH 7,4).
2. Tagliare sezioni di cervello, nella regione di interesse, 300 micron di spessore con un microtomo vibrante.
3. Trasferire le fette di un sistema di incubazione su misura che monitora e controlla i livelli di pH (pH 7,2-7,4) da vicino, il flusso di CarboGen, e la temperatura come descritto in precedenza ^{10, 11.}
4. Impostare temperatura iniziale della camera a 35 ° C per 15 - 30 min, e poi lentamente ridurre a 15 - 16 ° C, come mostrato nella Figura 1C. Incubare fette nel sistema di incubazione fino a quando necessario, sia per elettrofisiologia o imaging.
   NOTA: se devono essere utilizzati per il calcio fette imaging, seguire i passi di seguito prima di raffreddamento del tessuto sotto RT.

2. retina Wholemount Preparazione e interna rimozione membrana limitante

1. Preparare wholemounts retina in entrambi i normalicondizioni di illuminazione di laboratorio o fioca luce rossa / infrarossi.
2. L'eutanasia degli animali da dislocazione cervicale e immediatamente gli occhi enucleare. Fare un piccolo taglio lungo la serrata, e il luogo in entrambe le Ames dei media, o aCSF contenente (mm): 125 NaCl, 25 NaHCO _3, 3 KCl, 2 CaCl _2, 1 MgCl _2, 10 di glucosio, 0.5 L-glutammina, e saturare con CarboGen (95% O _2/5% CO ₂ miscela; ~ 300 mOsm; pH 7,4), a temperatura ambiente.
3. Rimuovere immediatamente la cornea, cristallino e vitreo tagliando lungo la serrata con piccole forbici e la rimozione del cristallino e corpo vitreo con una pinza. Posizionare il tessuto nel sistema di incubazione a RT.
   NOTA: tessuto retinico può essere mantenuta nell'occhio coppa, dopo la riduzione di temperatura lento a 15 - 16 ° C, per> 24 ore nel sistema di incubazione fino a quando necessario.
4. Per rimuovere la ILM, trasferire l'occhio-tazza contenente la retina un vasetto di vetro contenente papaina 30 U / mL, 1 mM L-cistina, 0,5 mM EDTA e 0,005% in DNasi Earl's-Soluzione salina bilanciata (BSS) a 37 ° C per 20 min. Applicare 95% O _2/5% di CO ₂ alla soluzione attraverso il coperchio ma non fare bolle. Se si utilizza il tessuto da animali giovani (<6 settimane), diluire la soluzione a mezza forza.
   1. Arrestare digestione enzimatica, posizionando il tessuto in una soluzione ovomucoid (10 mg / mL) e BSA (10 mg / ml) per 10 min in BSS Earl. tessuto Lavare accuratamente con aCSF prima del trasferimento al sistema di incubazione e ridurre la temperatura a 15 - 16 ° C.
5. Mantenere tessuto retinico in un occhio-tazza fino a quando necessario. Per il trasferimento al microscopio, isolare la retina dall'occhio-tazza e tagliato in 4 pezzi con una lametta. Se è richiesta l'intera retina, fare quattro piccoli tagli nella periferia della retina per permettere di distendersi.
   NOTA: Per gli esperimenti di imaging, carico con calcio-coloranti prima del trasferimento al sistema di incubazione, vedere di seguito.

3. Il mantenimento dei tessuti nell'incubatrice

1. Posizionare tessuto nella camera principale contenente sonde per misure di pH e temperatura (Figura 1A, B).
2. Circolare aCSF attraverso una seconda camera (camera UVC, costruito come descritto in precedenza ¹²⁾ isolata dalla camera principale ed esposti a 1,1 W luce UVC (254 nm, 5W / 2P sterilizzatrice lampada UV) per eradiate batteri galleggiano nella soluzione (Figura 1A). temporizzazione luce controllo UVC tramite un timer programmabile tramite una funzione casuale che si attiva in tempi variabili tra 15 e 26 min ogni 15 - 30 min per evitare eccessivo riscaldamento del aCSF.
3. Impostare la portata nella camera UVC a 12 ml / min come riportato in precedenza ^12. Coprire la camera UVC con un foglio di alluminio per evitare l'illuminazione UVC di fuori della camera, che può danneggiare il tessuto neuronale.
   NOTA: per tessuto retinico adattata al buio, applicare una copertura su misura per la camera principale per escludere la luce.
4. Utilizzare una pompa peristaltica a circulate la soluzione (aCSF) attraverso le due camere e una piastra termoelettrico Peltier cooler per raffreddarsi o riscaldare la camera principale alle temperature desiderate nell'intervallo 0 - 50 ° C. Per incubazione del tessuto ottimale, utilizzare 15 - 16 ° C per la redditività a lungo termine.

4. Il calcio Dye Caricamento

1. Selezionare coloranti di calcio in base alla preferenza del singolo ricercatore. Qui usiamo Fura-02:00, Fluo-08:00 o Fluo-4 del mattino. Tuttavia, questo metodo può essere applicato ad altri coloranti così: sciogliere coloranti calcio in DMSO ad una soluzione 1 mM e 1% di copolimeri a blocchi (es, acido-127 Pluronic) ad un volume finale di 50 microlitri e ultrasuoni per 10 min.
2. Aggiungere la soluzione al aCSF ad una concentrazione finale di 10 mM, 0,01% copolimeri a blocchi di fettine cerebrali, e 20 pM (retina), 0,02% copolimeri a blocchi per la retina. In retinae (papaina trattato) e sezioni di cervello da animali giovani, carico al bagno per 45 min a 37 ° C (Fura-2 AM) o RT (Fluo-4 del mattino; Fluo-08:00).
   1. Per gli animali adulti, (> 12 settimane) pipettare i coloranti (50 ml) direttamente sui sezioni di cervello, e mantenere per 75 minuti per consentire una migliore penetrazione del colorante negli strati profondi.
   2. Per assicurare un'adeguata ossigenazione della fetta sommersa durante l'incubazione colorante, preparare un vetro camera di carico con coperchio chiuso (barattolo circolare del diametro di 2,5 cm, 3,5 cm di altezza) con coloranti calcio diluito in 2,5 mL di aCSF. Ossigenare continuamente con il 95% O _2/5% di CO _2. Non farlo bolla.
3. Dopo dye carico, lavare il tessuto con aCSF e trasferimento al sistema di incubazione, ridurre lentamente la temperatura a 15 - 16 ° C fino al momento dell'uso sperimentale.

5. elettrofisiologiche Recordings e Imaging

1. Posizionare il tessuto in una camera di registrazione sommerso sotto un microscopio, e profumato con ossigenato aCSF ad una portata di 4 - 5 mL / min sia a RT (~ 22 ° C) o temperatura fisiologica (~ 35 ° C). Hold il tessuto in luogo utilizzando un custom made '' arpa '', realizzato in nylon o in oro le discussioni tese e incollate su un pezzo a forma di U di oro o filo di platino.
2. Per elettrofisiologia:
   1. Preparare pipette di registrazione da 1,5 mm (1,19 millimetri ID) in vetro borosilicato con un estrattore micropipetta per ottenere una resistenza finale di 5-6 MW.
   2. Riempire la pipetta con 3-4 ml di soluzione interna come descritto in precedenza ¹³ e visualizzare le cellule sotto infrarossi interferenza differenziale contrasto (IR-DIC) utilizzando una telecamera CCD. La soluzione intracellulare deve essere attentamente su misura per ogni esperimento per ottenere risultati sperimentali.
   3. Posizione pipetta, mantenendo una pressione positiva applicata attraverso una porta di aspirazione sul supporto pipetta, sulla membrana di una cellula con un micromanipolatore. Poiché la ILM è stato rimosso dalla retina, non è richiesta alcuna raschiare membrana prima. Una volta che la pipetta è sulla cella, applicare delicato negativopressione alla pipetta per ottenere una tenuta gigaohm. Poi rompere la membrana cellulare con una breve quantità di pressione negativa.
   4. Effettuare registrazioni current- o tensione-clamp cellule intere utilizzando tecniche standard a seconda dei casi.
3. Calcio-immagini:
   1. Per l'imaging raziometrico di Fura-2, utilizzare un ultra-alta lunghezza d'onda switcher velocità per offrire lunghezze d'onda di eccitazione di 340 nm e 380 nm. Far passare la luce emessa da singole cellule attraverso un filtro di emissione di 510 ± 20 nm, e catturare con un'elevata sensibilità, fotocamera digitale ad alta velocità.
   2. Per una singola lunghezza d'onda di eccitazione di Fluo-4, la luce filtro di eccitazione attraverso un 460 - filtro passa banda nm 490 e la luce emessa attraverso un 515 - filtro passa banda nm 550. Per la registrazione più veloce e sensibile utilizzare una fotocamera digitale ad alta velocità tale. Acquisire immagini come richiesto.
   3. Misurare alterazioni di fluorescenza in funzione del tempo sia ad una sola lunghezza d'onda (Fluo-4) o utilizzando il rapporto di lunghezza d'ondaMetodo (Fura-2), come precedentemente descritto ^{8, 14.}

Risultati

stretta regolazione della carica batterica e la temperatura del aCSF durante l'incubazione è essenziale per mantenere la vitalità del tessuto neuronale. Questo può essere ottimizzato mediante irraggiamento con luce UVC e mantenendo la temperatura della aCSF a 15 - 16 ° C (Figura 1). Inoltre, il aCSF parametri di bollo (APS; Figura 1C) fornisce lo sperimentatore con un record delle condizioni ambientali (pH e temperatura.), Offrendo così un gold stand...

Discussione

Questo articolo descrive un metodo di incubazione per estendere la vitalità del tessuto neuronale acuta per immagini ed elettrofisiologici esperimenti, riducendo così il numero di animali necessari per completare obiettivi sperimentali. Due processi principali governano il deterioramento del tessuto neuronale nel tempo: i) un aumento dei livelli di batteri, e il conseguente aumento endotossina batterica rilasciato, e ii) eccitotossicità che segue la procedura affettamento traumatica ^10. Come tess...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cloruro di sodio	Sigma Aldrich VETEC	V800372
Cloruro di potassio	Sigma Aldrich	P9333
N-metil-D-glucamina	Sigma Aldrich	M2004
D-glucosio	Sigma Aldrich	G5767
Bicarbonato di sodio	Sigma Aldrich	S6014
Fosfato di sodio monobasico	Sigma Aldrich	S2554
Cloruro di magnesio	Sigma Aldrich	M9272
Cloruro di calcio	Sigma Aldrich	223506
Sistema di dissociazione della papaina	Worthington
Dimetil solfossido anidro	Sigma Aldrich	276855
Pluronic F-127 Bassa assorbanza UV*	Life technologies	P-6867	Soluzione al 20% in DMSO
Fura-2 AM	Anaspec	84017
Fluo-4 AM	Life Technologies	F23917
Fluo-8 AM	Abcam	Ab142773
Microtomo a lama vibrante	Leica Biosystem	VT1200 S	equipaggiato con Leica' s Vibrocheck™ dispositivo di misurazione
Tavolo antivibrante	Kinetic Systems Vibraplane	Piano vibrante 9100/9200
microscopio verticale a tavolino fisso	Olympus	BX51WI
Obiettivo per microscopio	Olympus	XLUMPlanFLN 20x/1.00w	20X
Obiettivo per microscopio	Olympus	LUMPlanFLN 60x/1.00w	60X
CCD Camera	Andor	Ixon +
Commutatore di lunghezza d'onda ad alta velocità	Strumento	Sutter Lambda DG-4
Amplificatore patch clamp	Molecular Devices	MultiClamp 700B
Sistema di acquisizione dati	Molecular Devices	Digidata 1440A	Axon Digidata® Sistema
Capillari in vetro borosilicato	Sutter Instrument Co	BF150-86-10
Estrattore per microelettrodi	Sutter Instrument Co	P-97	Estrattore per micropipette di tipo fiammante/marrone
Camera di registrazione/perfusione	Warner	Instruments RC-40LP	Camere da bagno aperte a basso profilo
Software	Molecular Devices	pClamp 10.2
Software di imaging di cellule vive Andor iQ	Andor	Andor iQ3
Braincubator	Payo Scientific	BR26021976	www.braincubator.com.au
Peltier-Raffreddatore termoelettrico a piastra fredda	Tecnologia TE Regolatore di	CP-121
	Tecnologia TE	TC-36-25 RS232

LK003150 temperatura