Articolo metodologico

Maggiore Campione Multiplexing dei tessuti utilizzando combinata Precursore isotopica etichettatura e isobarica Tagging (CPilot)

DOI:

10.3791/55406

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1 maggio 2017

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1Department of Chemistry, University of Pittsburgh, 2SGS North America Inc., 3Large Molecule Analytical Development, Pharmaceutical Development & Manufacturing Science, Janssen Research and Development

In questo articolo

Sommario

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Combinato precursore etichettatura isotopica e tagging isobarica (CPilot) è una strategia proteomica quantitativa che migliora le capacità di multiplazione campione di tag isobariche. Questo protocollo descrive l'applicazione di CPilot ai tessuti dal modello murino della malattia e wild-type controlli di Alzheimer.

Abstract

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V'è una crescente domanda di analizzare molti campioni biologici per la malattia di comprensione e di scoperta di biomarcatori. proteomica strategie quantitative che consentono la misurazione simultanea di più campioni sono diffusi e ridurre notevolmente i costi ei tempi sperimentali. Il nostro laboratorio ha sviluppato una tecnica chiamata precursore combinato etichettatura isotopica e tagging isobarica (CPilot), che migliora campione multiplazione di etichettatura isotopica tradizionale o approcci di tagging isobariche. CPilot globale può essere applicato a campioni provenienti da cellule, tessuti, fluidi corporei, o organismi interi e fornisce informazioni sulla abbondanza relativa proteina attraverso diverse condizioni del campione. CPilot funziona 1) usando condizioni di bassa tampone pH selettivamente peptide dimethylate N-terminali e 2) utilizzando condizioni tampone pH elevato etichettare ammine primarie di residui di lisina con reagenti isobariche commercialmente disponibili (vedere Tabella dei materiali / reagenti). Il grado dimultiplexing campione disponibile dipende dal numero di etichette precursori utilizzati e il reagente di marcatura isobarica. Qui, presentiamo un'analisi 12-plex usando la luce e dimethylation pesante combinato con sei-plex reagenti isobariche per analizzare 12 campioni di tessuti di topo in una singola analisi. multiplazione avanzata è utile per ridurre il tempo sperimentale e costi e, soprattutto, permettendo un confronto in molte condizioni del campione (repliche biologiche, stadio della malattia, trattamenti farmacologici, genotipi, o longitudinali time-punti) con pregiudizi meno sperimentale e l'errore. In questo lavoro, l'approccio globale CPilot viene utilizzato per analizzare il cervello, cuore e tessuti del fegato attraverso repliche biologiche dal modello murino della malattia e wild-type controlli di Alzheimer. Globale CPilot può essere applicato per studiare altri processi biologici e atta ad aumentare campione multiplexing a più di 20 campioni.

Introduzione

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Proteomica spesso comporta l'analisi di molti campioni utilizzati per comprendere meglio i processi patologici, cinetica enzimatica, modificazioni post-traduzionali, risposta a stimoli ambientali, risposta ai trattamenti terapeutici, scoperta biomarker, o meccanismi di droga. metodi quantitativi possono essere impiegati per misurare differenze relative dei livelli delle proteine ​​nei campioni di e può essere privo di etichetta o coinvolgere etichettatura isotopica (metabolica, chimica o enzimatica). Stabili metodi di etichettatura isotopo sono cresciuti in popolarità perché consentono molti campioni da analizzare simultaneamente e sono adatti per i campioni da cellule, tessuti, fluidi corporei, o organismi interi. Metodi 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, aumentare la produttività sperimentale, marcatura isotopicariducendo il tempo di acquisizione, i costi, e l'errore sperimentale. Questi metodi utilizzano spettri di massa precursore per misurare abbondanze relative delle proteine ​​da picchi peptide. Al contrario, i reagenti codifica isobariche 8, 9, 10 generano ioni giornalista che sono o rilevati in MS / MS o MS 3 11 spettri e questi picchi sono utilizzate per rilevare l'abbondanze relative di proteine.

L'attuale stato-of-the-art in proteomica multiplazione o è un 10-plex 12 o 12-plex analisi tag isobarica 13. Multiplexing campione maggiore (cioè> 10 campioni) metodi sono stati sviluppati dal nostro laboratorio per tessuti 14, 15, 16, 17, e da altri per l'analisi di cellule 18 sup>, 19, 20, 21 tessuti, o peptidi mirati 22. Abbiamo sviluppato una tecnica di multiplexing migliorato chiamato combinato precursore etichettatura isotopica con marcatura isobarica (CPilot). CPilot globale è utile per ottenere informazioni sulle concentrazioni relative di tutte le proteine attraverso differenti condizioni del campione (≥12) 14. La figura 1 mostra una schema generale CPilot. Triptici o Lys-C peptidi sono selettivamente etichettati all'estremità N-terminale con dimethylation con bassi pH 2 ed a residui di lisina con 6-plex reagenti utilizzando pH elevato. Questa strategia raddoppia il numero di campioni che possono essere analizzati con reagenti isobariche che aiuta a ridurre i costi sperimentali e, inoltre, riduce i passaggi e il tempo sperimentali.

CPilot è flessibile abbiamo sviluppato altri metodi per studiare modi ossidativo post-traduzionalefiche, comprese le proteine 3-nitrotirosina modificati 14 e cisteina contenenti peptidi con S-nitrosylation (oxcyscPILOT) 23. Abbiamo anche sviluppato un aminoacido approccio selettivo, cisteina CPilot (cyscPILOT) 17. MS 3 acquisizione con un top-ione 11 o selettiva-y 1 ione metodo 15 può contribuire a ridurre l'interferenza degli ioni reporter e migliorare la precisione quantitativa di CPilot. L'uso di MS 3 nel metodo di acquisizione richiede uno strumento ad alta risoluzione con un analizzatore di massa Orbitrap sebbene bassa risoluzione strumenti trappola ionica possono anche funzionare 24.

In precedenza, CPilot è stato utilizzato per studiare le proteine del fegato 16 dal modello murino della malattia di Alzheimer. Qui, descriviamo come eseguire l'analisi CPilot globale utilizzando cervello, cuore, fegato e omogenati per studiare il ruolo del periphery nella malattia di Alzheimer. Questo esperimento incorpora replica biologica. A causa della versatilità di CPilot, gli utenti interessati possono utilizzare la tecnica per studiare altri tessuti per una serie di problemi e sistemi biologici.

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Protocollo

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Etica dichiarazione: I topi sono stati acquistati da un non-profit di ricerca biomedica istituzione indipendente e alloggiati presso la Divisione di laboratorio risorse animali presso l'Università di Pittsburgh. Tutti i protocolli di animali sono stati approvati dal Comitato di cura ed uso degli animali Istituzionale presso l'Università di Pittsburgh.

1. Proteine ​​Estrazione e Generazione di peptidi per Chemical-tagging

  1. Estrarre proteine da tessuti, cellule, o fluidi corporei.
    1. Omogeneizzare 60-90 mg di tessuto (per esempio cervello, cuore, fegato e) in tampone fosfato salino (PBS 1x) con 8 M urea (500 mL) usando un omogeneizzatore meccanico. Proteasi o fosfatasi inibitori possono essere aggiunti al buffer, se necessario. In questo progetto, che non sono stati utilizzati. Utilizzare i seguenti parametri per l'omogeneizzatore: lisi perline una matrice, 4 m / s, 20 s. tessuto cardiaco può richiedere fino a 9 cicli di omogeneizzazione.
      NOTA: proteasi o di inibitori della fosfatasi s può essere aggiunto al buffer, se necessario. Essi non sono stati utilizzati in questo studio.
      1. Rimuovere tessuto omogenato dal tubo lisi e trasferire in una provetta da micro-centrifuga. Risciacquare lisi tubi con 100-500 ml di PBS con 8 M urea e combinare la soluzione di risciacquo con omogenato tissutale.
    2. Centrifugare i tessuti omogeneizzati (9.447 xg, a 4 ° C, 15 min) e raccogliere il surnatante.
  2. Determinare la concentrazione di proteine usando un test di acido bicinconinico (BCA) secondo le istruzioni del produttore.
    NOTA: ulteriore diluizione con tampone può essere necessario se la concentrazione di proteina è troppo alta. Le concentrazioni risultanti per campioni da questi tessuti erano tra 6-13 mg / mL.
    1. Opzionale: Aggiungere uno standard di controllo della qualità interna (ad esempio bovini alfa caseina o altra proteina esogena) alla norma ug rapporto 1: campione di proteine 100 ug.
jove_title "> 2. Digestione del campione

  1. Aggiungere 100 mg (100 x 10 -6 g) di proteine di ogni campione a etichettati individualmente provette micro-centrifuga. Il volume dipende dalla concentrazione di proteina (vedi punto 1.2).
  2. Aggiungere ditiotreitolo (DTT) (40: 1 reagente per campionare rapporto molare) per ogni campione. Incubare a 37 ° C per 2 h. Il calcolo per il rapporto molare è basato massa proteica di albumina di siero bovino (BSA), che è 66,5 x 10 3 g / mol.
  3. Aggiungere iodoacetamide (IAM) (80: 1 reagente per campionare rapporto molare) per ogni campione. Incubare in ghiaccio al buio per 2 ore. Questa reazione è eseguita in ghiaccio per 2 ore per evitare reazioni collaterali.
  4. Aggiungere L-cisteina (40: 1 reagente per campionare rapporto molare) per ogni campione. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
  5. Aggiungere 20 mM tampone Tris con 10 mM CaCl 2 (pH 8,2) per diluire urea ad una concentrazione finale di 2 M.
  6. Aggiungere L-1-tosylamido-2 phenylethyl clorometil chetone (TPCK) -treated tripsina (50: 1 substrato enzimatico rapporto molare) di ciascun campione e incubare a 37 ° C per 24 h.
  7. Estinguere la digestione delle proteine ​​dal flash-congelamento del campione in azoto liquido e conservare a -80 ° C fino ad ulteriore lavorazione.

Desalting 3. Il campione

  1. Re-acidificare i campioni con l'aggiunta di acido formico (FA). Aggiungere abbastanza FA per ottenere una concentrazione finale di 0,1%. Se i campioni sono in origine a -80 ° C, scongelare i campioni sul ghiaccio prima di ri-acidificazione.
  2. De-sale peptidi utilizzando C 18 lipofilo idrofilo ottenuta (HLB) cartucce 10 mg come descritto in precedenza 16.
  3. Asciugare i campioni mediante centrifugazione sotto vuoto (5 Torr, 45 ° C, 77 xg) per un volume di ~ 10 microlitri.

4. dimethylation etichettatura (N-terminale)

  1. Ricostituire peptidi in acido acetico 1% (0,25 mg / mL) disciolti in cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) o acqua di grado nano-pura. Rimuovere a 50 μ; G porzione in un tubo a micro-centrifuga (1,5 mL) e memorizzare il resto a -80 ° C.
  2. Aggiungere 8 ml di 60 mM (4%) CH 2 O (37% p / v) o 60 mM (4%) 13 CD 2 O (20% p / v) per i campioni di etichettatura con luce o dimethylation pesante, rispettivamente . Tipicamente, si aggiungono 4 ml di reagente per 25 pg di peptidi (Procedura 4.2, 4.3, 4.6).
  3. Aggiungere 8 ml di 24 mM NaBH 3 CN o 24 mM NaBD 3 CN ai campioni marcati rispettivamente con leggera o pesante dimethylation,.
  4. Vortex e agitare su un agitatore tubo per circa 10 minuti a temperatura ambiente.
  5. Placare le reazioni con l'aggiunta di 16 ml di 1% di ammoniaca (~ 28-30% v / v) per 5 min. In genere, si aggiungono 8 ml di reagente per 25 mg di peptidi.
  6. Re-acidificare miscele di reazione aggiungendo 8 ml di 5% FA (98% v / v).
  7. Combinare la luce e peptidi dimetilato pesanti (Figura 1) per generare un totale di sei campioni. Vedi Tabella 1 per una descrizione di codifica campione e messa in comune utilizzato per questo studio.
  8. Eseguire dissalazione campione secondo passi 3.2 e 3.3.

5. isobarica Tagging (residui Lys)

  1. Ricostituire 100 pg di peptidi dimetilato (1 mg / mL) in 100 mM di bicarbonato di ammonio tri-etil (Teab) tampone (pH ~ 8,5).
  2. Preparare i reagenti isobariche, come indicato nel protocollo del produttore (vedi Tabella dei materiali / reagenti).
  3. Aggiungere i reagenti isobariche solubilizzati (41 mL) a peptidi e vortex per ~ 10 s. Agitare i campioni su un tubo agitatore micro-centrifuga per ~ 1 h. Placare le reazioni con 8 ml idrossilammina (10% w / v) e incubare i campioni per 15 minuti a temperatura ambiente.
  4. Raggruppare le sei campioni etichettati in un'unica miscela e desalt (Procedura 3.1-3.3) o conservare a -80 ° C fino all'utilizzo.
    NOTA: Per migliorare la copertura proteoma e profondità, una strategia di separazione multidimensionale è suggeritocome forte scambio cationico (SCX).

6. Forte scambio cationico

  1. Eseguire SCX come da protocollo del produttore (vedi Materiali Tavolo).
    1. Preparare ~ 1 mL di soluzione di ammonio formiato (20 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM, e 500 mM) con 10% acetonitrile (ACN), 0,1% FA (pH 3).
    2. Rimuovere il tappo rosso dalla parte superiore del puntale e toccare la punta della pipetta con l'imballaggio slurry per garantire che il materiale di imballaggio è verso la parte inferiore del puntale.
      NOTA: Critical: Non buttare via la punta della pipetta fino alla fine del protocollo.
    3. Posizionare l'adattatore centrifuga sulla parte superiore di un tubo micro-centrifuga (2 mL) e fissare la punta della pipetta all'interno.
    4. Aggiungere 150 ml di tampone di ricostituzione SCX alle punte per pipette.
    5. Centrifugare le punte di pipette per 6 minuti a temperatura ambiente (4.000 xg). Ripetere questo passaggio altre due volte e gettare i rifiuti.
    6. Sciogliere il peptides in 150 microlitri di tampone di ricostituzione SCX. Assicurarsi che il pH è 3.
    7. Aggiungere peptidi alle punte per pipette, centrifuga (vedi 6.1.5), e mantenere l'eluente.
    8. Trasferire il filtro e pipetta in un tubo a micro-centrifuga (2 mL) e aggiungere 150 ml di 20 mM di soluzione di ammonio formiato. Centrifugare per 6 minuti a temperatura ambiente (4.000 xg) e mantenere l'eluente.
    9. Ripetere il punto 6.1.8 altre sette volte, usando concentrazioni successive (cioè 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM e 500 mM) di formiato di ammonio.
  2. Trasferire le otto frazioni SCX ai tubi micro-centrifuga (1,5 mL) e concentrato mediante evaporazione centrifuga (vedi punto 3.3).

7. cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS / MS) e MS 3

  1. Ricostituire i peptidi in acqua di massa grado spettrometria con 0,1% FA, filtro, e posto in una fiala di auto-campionatore. Filtra peptidi come follOWS:
    1. Aggiungi peptidi ricostituiti ad un tubo a micro-centrifuga contenente un filtro di 0,65 micron (vedi Materiali Tabella).
    2. peptidi centrifugare a 12.000 xg per 1 min. Rimuovere il filtro, eliminare e aggiungere peptidi filtrati in una fiala di auto-campionatore.
  2. Preparare i buffer di fase mobile come segue: 3% (v / v) con 0,1% ACN FA (A) e 100% ACN con 0,1% FA (B).
  3. Iniettare 6 microlitri di ciascun campione frazione SCX su una colonna trappola impaccata a 2 cm con C 18 materiale (5 um, 200 Å dimensione dei pori).
    NOTA: pulizia campioni sulla trappola è la seguente: 3 min, 0% B; 3 ml / min utilizzando un sistema di cromatografia liquida 2D (vedi materiali Tabella).
  4. Eseguire il metodo analitico di separazione. Utilizzare una silice fusa colonna capillare 75 um id x 13,2 centimetri laser tirato-tip ricco di C 18 materiale (5 um, 100 Å). Il gradiente è: 0-5 min, 10% B; 5-40 min, 10-15% B; 40-90 min, 15-25% B; 90-115 min, 25-30% B; 115-130 min, 30-60% B; 130-135 min, 60-80% B; 135-145 min, 80% B, 145-150 min, 80-10% B; 150-180 min, 10% B; 300 Nl / min, 180 min.
  5. Eseguire la raccolta dei dati per lo spettrometro di massa, mentre il metodo di separazione analitica è in esecuzione.
    NOTA: I parametri per la scansione di analisi MS sono i seguenti: 400-1,600 m / z, risoluzione 60.000, controllo automatico del guadagno (AGC) bersaglio 1 x 10 6 ioni, tempo massimo di iniezione 500 ms. Parametri per CID-MS / MS sono i seguenti: Top 1-7 o superiore dati 8-14 acquisizione dipendente (DDA), 3 m / z larghezza isolamento, 500 segnale minimo, il 35% di energia normalizzata di collisione (NCE), 0,25 attivazione q , 10 ms tempo di attivazione, 3 x 10 4 AGC, 50 ms massimo tempo di iniezione. Parametri per HCD-MS 3 sono le seguenti: 200 segnale minimo, 4 m / z larghezza isolamento, 60% NCE, il tempo di attivazione 0,1, 3 x 10 5 AGC, 250 ms IT, 300-1,300 m / z intervallo di selezione MS / MS , escludere ioni genitore non-frammentato.
  6. ad effettuare ogni analisi in duplicato sia per la parte superiore e superiore 1-7 8-14 piste.
    NOTA: Per i campioni eseguito su un nuovo modello di uno strumento contenente un Orbitrap o uno spettrometro di massa tribrid, parametri DDA varieranno e possono essere ottimizzati per includere più MS / MS e MS 3 scansioni. Inoltre, per gli strumenti tribrid, selezione precursore sincrono (SPS) -MS 3 deve essere impiegato.

8. Data Analysis 16

  1. Cerca i file RAW utilizzando il software di analisi delle proteine ​​in un database appropriato, ad esempio il mouse UniProt.
    NOTA: E 'importante creare due flussi di lavoro per ogni file RAW per la ricerca per la luce e peptidi dimetilato pesanti.
  2. Cerca i file RAW utilizzando i seguenti parametri: tripsina con due scissioni perse, range di massa peptide 300-6,000 Da, 15 ppm genitore tolleranza di massa, 1 Da tolleranza frammentazione. modifiche statiche: dimethylation luce (28,031, peptide N-terminale) o heavy dimethylation (36,076 Da, peptide N-terminale), carbamidomethyl (57,021 Da, C).
    NOTA: A volte il picco dimetilato pesante è ~ 7 Da (35,069 Da, peptide N-terminale) è dal picco luce dimetilato e, quindi, dovrebbe essere incorporato nel flusso di lavoro di ricerca per i peptidi dimetilato pesanti. modifiche dinamiche: ossidazione (15,995 Da, M), 6-plex tag isobarico (229,163 Da, K). Include una ricerca di database un'esca per produrre false discovery rate (ad esempio 1 e il 5%) e un nodo di quantificazione per cercare il reporter intensità di ioni di tag isobariche.
  3. statistica
    1. Esportare i dati in un programma di foglio elettronico al fine di normalizzare i valori di ioni proteina reporter. Per ciascuna proteina, dividere sia i rapporti di ioni giornalista mediani o intensità di ioni greggio giornalista dal rapporto mediana dello standard interno o crude intensità giornalista ioni dello standard interno, rispettivamente. Utilizzare il software statistico appropriato come un programma di foglio elettronico, perseus, o R per determinare variazioni significative tra condizioni del campione.

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Risultati

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CPilot utilizza la chimica ammina-based per chimicamente peptidi dell'etichetta lungo la N-terminale e residui di lisina e migliora le capacità multiplexing campione. La figura 2 mostra dati rappresentativi MS che si ottiene da un 12-plex analisi CPilot di cervello, cuore, fegato e tessuti da topo modello di malattia e di tipo selvatico controlli di Alzheimer. Come indicato nella tabella 1, due repliche biologiche per topi malattia e wild-type di Alzheim...

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Discussione

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CPilot consente la misura simultanea di più di 12 campioni unici. Al fine di garantire il tagging di successo sia a N-terminale e lisina residui di peptidi, è indispensabile avere il pH corretto per ogni serie di reazioni e di eseguire la reazione dimethylation prima per l'etichettatura peptide. dimethylation selettivo del N-terminale è effettuata da avere un pH a ~ 2,5 (± 0,2). Questo risultato è ottenuto sfruttando le differenze dei PKA del dei gruppi amminici sulla lisina e N-terminale. A pH 2,5, la lisina è inat...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno interessi in competizione.

Ringraziamenti

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Gli autori riconoscono l'Università di Pittsburgh start-up fondi e NIH, NIGMS R01 concessione (GM 117.191-01) per RASR.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acqua - Grado MS Fisher ScientificW6-44 L quantità non è necessaria
Acetonitrile - Grado MS FisherScientificA955-44 L quantità non è necessaria
Acido aceticoJ.T. Baker9508-01
Soluzione di idrossido di ammonio (28 - 30%)Sigma Aldrich320145-500ML
Formiato di ammonioAcros Organics208-753-9
Acido formicoFluka Analytical94318-250ML-F
Kit per il dosaggio delle proteine BCAPierce Thermo Fisher Scientific23227
UreaBiorad161-0731
TrisBiorad161-0716
Ditiotreiotolo (DTT)Fisher ScientificBP172-5
Iodoacetamide (IAM)Acros Organics144-48-9
L-CisteinaSigma Aldrich, Chimica168149-25G
Tripsina trattata con L-1-tosilomido-2 feniletilcoliconmetilchetone (TPCK) da pancreas bovinoSigma Aldrich, Life ScienceT1426-100MG
Soluzione di formaldeide (CH2O); 36,5 - 38% in H2OSigma Aldrich, Life ScienceF8775-25ML
Soluzione di formaldeide (13CD2O); 20 % in peso in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13CSigma Aldrich, Chimica596388-1G
Cianoboroidruro di sodio; grado di reagente, 95%Sigma Aldrich156159-10G
Cianoborodeuteruro di sodio; 96 atomo % D, 98% CPSigma Aldrich, Chimica190020-1G
Punte di spin a forte scambio cationico (SCX) kit di preparazione del campioneProtea BioSciencesSP-155-24kit
tampone bicarbonato di trietilammonio (TEAB)Sigma Aldrich, Life ScienceT7408-100ML
Kit di marcatura isobarica (TMT 6 plex) - 6 reazioni (1 x 0,8 mg)Thermo Fisher Scientific90061
Idrossilammina cloridratoSigma Aldrich, Chimica255580-100G
Miscelatore a vortice standardFisher Scientific2215365qualsiasi miscelatore può essere utilizzato
Oasis HLB 1 cc (10 mg) Cartucce di estrazioneAcque186000383Si tratta di cartucce C18
Collettore per vuoto Visiprep SPE, DL (rivestimento monouso), modello a 24 porteSigma Aldrich57265È sufficiente anche un modello a 12 porte
Speed-vacThermo ScientificSPD1010è sufficiente qualsiasi marca di speed vac Camera a
bagno d'acquaThermo Scientific2825/2826È sufficiente qualsiasi marca di camera a bagno d'acqua a temperature controllate.
Omogeneizzatore meccanico (i.e. FastPrep-24 5G)MP Biomedicals116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D con autocampionatore Nano LC AS-2Sciex-Questomodello non è più disponibile. Qualsiasi nano LC con un autocampionatore è sufficiente.
LTQ Orbitrap Velos Mass SpectrometerThermoScientific-Questomodello non è più disponibile. Possono essere utilizzati altri strumenti ad alta risoluzione (es Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion o Orbitrap Fusion Lumos).
Software per le proteine (es. Proteome Discoverer)Thermo ScientificIQLAAEGABSFAKJMAUH 
Bilancia analiticaMettler ToledoAL54
Piastra di agitazioneVWR12365-382Qualsiasi marca di piastre di agitazione è sufficiente
Misuratore di pH (compatibile con Tris)Fisher Scientific (Accumet)13-620-183Qualsiasi marca di pHmetro è sufficiente
Tampone pH 10Fisher Scientific06-664-261Qualsiasi marca di tampone pH 10 è sufficiente
pH 7 tamponeFisher Scientific06-664-260Qualsiasi marca di tampone pH 7 è sufficiente
1,5 mL di provette Eppendorf, 500 confezioniFisher-Scientific05-408-129Qualsiasi marca di provette Eppendorf da 1,5 mL è sufficiente 0,6
mL di provette Eppendorf, 500 confezioniFisher Scientific04-408-120Qualsiasi marca di provette Eppendorf da 0,6 mL è sufficiente
0,65 &; micro; m Unità filtranti centrifughe Ultrafree MC DVEMD MilliporeUFC30DV00
2 provette per microcentrifuga da 2 mL, 72 unitàThermo Scientific69720
C18 materiale di imballaggio (5  µ m, 100 Å)BrukerPM5/61100/000Questo articolo non è più disponibile da Bruker. Il materiale di imballaggio alternativo con le specifiche elencate sarà sufficiente
C18 materiale di imballaggio (5  µ m, 200 Å)BrukerPM5/61200/000Questo articolo non è più disponibile da Bruker. Sarà sufficiente materiale di imballaggio alternativo con le specifiche elencate

Riferimenti

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