Maggiore Campione Multiplexing dei tessuti utilizzando combinata Precursore isotopica etichettatura e isobarica Tagging (CPilot)

Summary

Combinato precursore etichettatura isotopica e tagging isobarica (CPilot) è una strategia proteomica quantitativa che migliora le capacità di multiplazione campione di tag isobariche. Questo protocollo descrive l'applicazione di CPilot ai tessuti dal modello murino della malattia e wild-type controlli di Alzheimer.

Abstract

V'è una crescente domanda di analizzare molti campioni biologici per la malattia di comprensione e di scoperta di biomarcatori. proteomica strategie quantitative che consentono la misurazione simultanea di più campioni sono diffusi e ridurre notevolmente i costi ei tempi sperimentali. Il nostro laboratorio ha sviluppato una tecnica chiamata precursore combinato etichettatura isotopica e tagging isobarica (CPilot), che migliora campione multiplazione di etichettatura isotopica tradizionale o approcci di tagging isobariche. CPilot globale può essere applicato a campioni provenienti da cellule, tessuti, fluidi corporei, o organismi interi e fornisce informazioni sulla abbondanza relativa proteina attraverso diverse condizioni del campione. CPilot funziona 1) usando condizioni di bassa tampone pH selettivamente peptide dimethylate N-terminali e 2) utilizzando condizioni tampone pH elevato etichettare ammine primarie di residui di lisina con reagenti isobariche commercialmente disponibili (vedere Tabella dei materiali / reagenti). Il grado dimultiplexing campione disponibile dipende dal numero di etichette precursori utilizzati e il reagente di marcatura isobarica. Qui, presentiamo un'analisi 12-plex usando la luce e dimethylation pesante combinato con sei-plex reagenti isobariche per analizzare 12 campioni di tessuti di topo in una singola analisi. multiplazione avanzata è utile per ridurre il tempo sperimentale e costi e, soprattutto, permettendo un confronto in molte condizioni del campione (repliche biologiche, stadio della malattia, trattamenti farmacologici, genotipi, o longitudinali time-punti) con pregiudizi meno sperimentale e l'errore. In questo lavoro, l'approccio globale CPilot viene utilizzato per analizzare il cervello, cuore e tessuti del fegato attraverso repliche biologiche dal modello murino della malattia e wild-type controlli di Alzheimer. Globale CPilot può essere applicato per studiare altri processi biologici e atta ad aumentare campione multiplexing a più di 20 campioni.

Introduction

Proteomica spesso comporta l'analisi di molti campioni utilizzati per comprendere meglio i processi patologici, cinetica enzimatica, modificazioni post-traduzionali, risposta a stimoli ambientali, risposta ai trattamenti terapeutici, scoperta biomarker, o meccanismi di droga. metodi quantitativi possono essere impiegati per misurare differenze relative dei livelli delle proteine ​​nei campioni di e può essere privo di etichetta o coinvolgere etichettatura isotopica (metabolica, chimica o enzimatica). Stabili metodi di etichettatura isotopo sono cresciuti in popolarità perché consentono molti campioni da analizzare simultaneamente e sono adatti per i campioni da c....

Protocol

Etica dichiarazione: I topi sono stati acquistati da un non-profit di ricerca biomedica istituzione indipendente e alloggiati presso la Divisione di laboratorio risorse animali presso l'Università di Pittsburgh. Tutti i protocolli di animali sono stati approvati dal Comitato di cura ed uso degli animali Istituzionale presso l'Università di Pittsburgh.

1. Proteine ​​Estrazione e Generazione di peptidi per Chemical-tagging

1. Estrarre proteine da tessuti, cellule, o fluidi corporei.
   1. Omogeneizzare 60-90 mg di tessuto (per esempio cervello, cuore, fegato e) in tampone fosfato salino (PBS 1x) ....

Results

CPilot utilizza la chimica ammina-based per chimicamente peptidi dell'etichetta lungo la N-terminale e residui di lisina e migliora le capacità multiplexing campione. La figura 2 mostra dati rappresentativi MS che si ottiene da un 12-plex analisi CPilot di cervello, cuore, fegato e tessuti da topo modello di malattia e di tipo selvatico controlli di Alzheimer. Come indicato nella tabella 1, due repliche biologiche per topi malattia e wild-type di Alzheim.......

Discussion

CPilot consente la misura simultanea di più di 12 campioni unici. Al fine di garantire il tagging di successo sia a N-terminale e lisina residui di peptidi, è indispensabile avere il pH corretto per ogni serie di reazioni e di eseguire la reazione dimethylation prima per l'etichettatura peptide. dimethylation selettivo del N-terminale è effettuata da avere un pH a ~ 2,5 (± 0,2). Questo risultato è ottenuto sfruttando le differenze dei PKA del dei gruppi amminici sulla lisina e N-terminale. A pH 2,5, la lisina è inat.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acqua - Grado MS Fisher Scientific		W6-4	4 L quantità non è necessaria
Acetonitrile - Grado MS Fisher	Scientific	A955-4	4 L quantità non è necessaria
Acido acetico	J.T. Baker	9508-01
Soluzione di idrossido di ammonio (28 - 30%)	Sigma Aldrich	320145-500ML
Formiato di ammonio	Acros Organics	208-753-9
Acido formico	Fluka Analytical	94318-250ML-F
Kit per il dosaggio delle proteine BCA	Pierce Thermo Fisher Scientific	23227
Urea	Biorad	161-0731
Tris	Biorad	161-0716
Ditiotreiotolo (DTT)	Fisher Scientific	BP172-5
Iodoacetamide (IAM)	Acros Organics	144-48-9
L-Cisteina	Sigma Aldrich, Chimica	168149-25G
Tripsina trattata con L-1-tosilomido-2 feniletilcoliconmetilchetone (TPCK) da pancreas bovino	Sigma Aldrich, Life Science	T1426-100MG
Soluzione di formaldeide (CH2O); 36,5 - 38% in H2O	Sigma Aldrich, Life Science	F8775-25ML
Soluzione di formaldeide (13CD2O); 20 % in peso in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C	Sigma Aldrich, Chimica	596388-1G
Cianoboroidruro di sodio; grado di reagente, 95%	Sigma Aldrich	156159-10G
Cianoborodeuteruro di sodio; 96 atomo % D, 98% CP	Sigma Aldrich, Chimica	190020-1G
Punte di spin a forte scambio cationico (SCX) kit di preparazione del campione	Protea BioSciences	SP-155-24kit
tampone bicarbonato di trietilammonio (TEAB)	Sigma Aldrich, Life Science	T7408-100ML
Kit di marcatura isobarica (TMT 6 plex) - 6 reazioni (1 x 0,8 mg)	Thermo Fisher Scientific	90061
Idrossilammina cloridrato	Sigma Aldrich, Chimica	255580-100G
Miscelatore a vortice standard	Fisher Scientific	2215365	qualsiasi miscelatore può essere utilizzato
Oasis HLB 1 cc (10 mg) Cartucce di estrazione	Acque	186000383	Si tratta di cartucce C18
Collettore per vuoto Visiprep SPE, DL (rivestimento monouso), modello a 24 porte	Sigma Aldrich	57265	È sufficiente anche un modello a 12 porte
Speed-vac	Thermo Scientific	SPD1010	è sufficiente qualsiasi marca di speed vac Camera a
bagno d'acqua	Thermo Scientific	2825/2826	È sufficiente qualsiasi marca di camera a bagno d'acqua a temperature controllate.
Omogeneizzatore meccanico (i.e. FastPrep-24 5G)	MP Biomedicals	116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D con autocampionatore Nano LC AS-2		Sciex-Questo	modello non è più disponibile. Qualsiasi nano LC con un autocampionatore è sufficiente.
LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer	Thermo	Scientific-Questo	modello non è più disponibile. Possono essere utilizzati altri strumenti ad alta risoluzione (es Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion o Orbitrap Fusion Lumos).
Software per le proteine (es. Proteome Discoverer)	Thermo Scientific	IQLAAEGABSFAKJMAUH
Bilancia analitica	Mettler Toledo	AL54
Piastra di agitazione	VWR	12365-382	Qualsiasi marca di piastre di agitazione è sufficiente
Misuratore di pH (compatibile con Tris)	Fisher Scientific (Accumet)	13-620-183	Qualsiasi marca di pHmetro è sufficiente
Tampone pH 10	Fisher Scientific	06-664-261	Qualsiasi marca di tampone pH 10 è sufficiente
pH 7 tampone	Fisher Scientific	06-664-260	Qualsiasi marca di tampone pH 7 è sufficiente
1,5 mL di provette Eppendorf, 500 confezioni	Fisher-Scientific	05-408-129	Qualsiasi marca di provette Eppendorf da 1,5 mL è sufficiente 0,6
mL di provette Eppendorf, 500 confezioni	Fisher Scientific	04-408-120	Qualsiasi marca di provette Eppendorf da 0,6 mL è sufficiente
0,65 &; micro; m Unità filtranti centrifughe Ultrafree MC DV	EMD Millipore	UFC30DV00
2 provette per microcentrifuga da 2 mL, 72 unità	Thermo Scientific	69720
C18 materiale di imballaggio (5  µ m, 100 Å)	Bruker	PM5/61100/000	Questo articolo non è più disponibile da Bruker. Il materiale di imballaggio alternativo con le specifiche elencate sarà sufficiente
C18 materiale di imballaggio (5  µ m, 200 Å)	Bruker	PM5/61200/000	Questo articolo non è più disponibile da Bruker. Sarà sufficiente materiale di imballaggio alternativo con le specifiche elencate