Qui, presentiamo un protocollo per eseguire un test di migrazione cellulare semi-high throughput su una piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti. Questo protocollo è un metodo rapido, semplice ed economico per creare ferite scratch coerenti su un monostrato di cellule.
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Articolo metodologico
Un dispositivo per realizzare la migrazione delle cellule / Wound Healing in una piastra a 96 pozzetti
In questo articolo
Sommario
Abstract
La migrazione delle cellule / ferendo test è un metodo comunemente utilizzato per studiare la migrazione delle cellule e altri processi biologici, come l'angiogenesi e metastasi tumorali. In questo saggio, le cellule sono coltivate per formare un monostrato confluente e una ferita meccanica viene creato graffiando con un dispositivo. Allora il tasso di migrazione delle cellule verso la zona denudato può essere monitorato mediante imaging. Il nostro wounder meccanica 8 canali è progettato per affrontare la maggior parte dei problemi associati con il test migrazione cellulare. In primo luogo, la nostra wounder può essere facilmente sterilizzato in autoclave o con comuni disinfettanti. In secondo luogo, i singoli pin regolabili permettono anche contatto con la piastra di coltura cellulare in modo che possono essere creati ferite taglienti e riproducibili. In terzo luogo, le barre di guida su entrambi i lati del wounder assicurano posizione ferimento consistente in ciascun pozzetto. L'uso di puntali di plastica per il ferimento può fornire ulteriori migliore gestione del feritore e minimizzare le contaminationico. In conclusione, il nostro wounder cella può fornire ai ricercatori un dispositivo facile e riproducibile utente per l'esecuzione del test migrazione cellulare utilizzando la piastra standard coltura a 96 pozzetti.
Introduzione
La migrazione cellulare gioca un ruolo importante nei processi cellulari, come ad esempio l'embriogenesi, la neurogenesi, l'angiogenesi, la guarigione delle ferite, delle mucose riparazione, epiteliali-mesenchimali-transizioni in fase di sviluppo normale e la situazione della malattia 1. Si tratta di un processo complicato, che richiede un coordinamento delle numerose manifestazioni inter- e intra-cellulari, compresi segnalazione interazioni molecola, la polarizzazione delle cellule, la riorganizzazione del citoscheletro, rimodellamento della matrice, protrusione della membrana e dinamica cellula-cellula adesione modulazione 2. Studiando la migrazione delle cellule, la scoperta e la convalida delle sostanze chimiche o biomolecole che conducono al movimento delle cellule e le relative vie biochimiche possono essere determinati. Questo processo fondamentale può essere utilizzato vantaggiosamente come proxy per varie applicazioni, come il trattamento di malattia e drug targeting.
Il saggio ferendo è uno dei saggi di migrazione cellulare 3. Qui, unsingolo campione di cellule viene parzialmente rimosso dai mezzi meccanici per produrre una zona denudata cui le cellule migreranno per coprire l'area. La percentuale di recupero in un particolare momento sarà monitorato. Quando si maneggiano gran numero di campioni, questioni come il costo sperimentale e la contaminazione incrociata all'interno di campioni possono essere problematico. Anche se molti strumenti commerciali e saggi sono disponibili per lo studio migrazione delle cellule 4, 5, 6, molti di loro richiesto attrezzature costose e sofisticate e miglioramenti sono ancora necessari. Per queste ragioni, un wounder cellule meccanico 8 canali (Figura 1) è sviluppato.
Il nostro wounder cellule meccanica 8 canali ha incorporato diverse caratteristiche uniche nel risolvere i suddetti problemi. Esso fornisce la flessibilità necessaria per eseguire la migrazione delle cellule / ferendo saggi nel formato piastra di coltura a 96 pozzetti. La regolazione guprogettazione bar Iding assicura che la zona zero è in posizione centrale di ogni bene. Inoltre, l'altezza delle barre di guida può essere regolato in modo che il feritore è applicabile per varie marche di piastre di coltura. Infine, il design pin ferimento regolabile consente un ancora di contatto delle punte delle pipette con la superficie della piastra di coltura per ottenere simultaneamente e riproducibile ferimento 7, 8.
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Protocollo
1. Introduzione alle parti del feritore (Figura 1)
- Preparare il supporto del perno fissando i perni ferimento a distanze uguali. Tenere i puntali e regolare l'altezza della punta spostando i perni ferimento regolabili su e giù.
- Montare la guida barra regolabile su diverse marche di piastre di coltura a 96 pozzetti e assicurarsi che l'area ferimento è in una posizione fissa.
- Fissare il perno ferimento regolabile stringendo la vite esagonale. Fissare la guida bar in posizione stringendo i tappi a testa esagonale incassata su entrambe le estremità.
2. Impostare la larghezza del supporto del perno (Figura 2)
- Allentare i tappi a testa esagonale incassata con la chiave esagonale M5.
- Inserire un numero adeguato di regolazione anelli ad entrambi i lati del supporto del perno in modo che le barre di guida si adattano perfettamente con la larghezza della piastra di coltura a 96 pozzetti.
NOTA: Corning e piastre Iwaki richiede 1 paio di grandi anelli e 1 paio di piccoli anelli. Falcon e Nunc plAtes bisogno 1 paio di grandi anelli. - Serrare la brugola esagonale tappi per fissare la barra di guida.
3. Regolare le barre di guida (Figura 3)
- Montare i perni ferendo con sterili punte di pipette di plastica da 10 microlitri.
- Allentare i tappi a testa esagonale incassata con la chiave esagonale M5.
- Tenere il feritore e immergere i perni ferimento in una colonna di una piastra di coltura a 96 pozzetti.
- Regolare l'altezza delle barre di guida fino a quando tutti i suggerimenti toccare appena il fondo dei pozzetti.
- Serrare i tappi a brugola esagonale. Assicurarsi che il feritore ora si adatta perfettamente al piastra di coltura e che i perni sono ben posizionate nel mezzo dei pozzi.
4. La calibrazione dei perni
- Tenere il feritore perpendicolare ad una superficie sterile piatta (cioè Petri) e allentare tutte le viti a testa esagonale con la chiave esagonale M3.
- Toccare il feritore fino a quando tutti i suggerimenti in modo uniforme toccare la superficie sterile piatta.
- Serrare di nuovo le viti esagonali per bloccare i perni in posizione.
- Controllare la regolarità di ogni punta toccando il feritore delicatamente sulla superficie sterile piatta.
5. Scratching cellulare monostrato (figura 4)
- Seme umano ombelicale cellule endoteliali vascolari su un 96-pozzetti di coltura cellulare di gelatina rivestite 0,1%. cellule di coltura in media 199 integrate con il 20% di siero di calore-inattivato fetale bovino, 1% di penicillina / streptomicina e 0,09 g / L di eparina. Mantenere le cellule in un incubatore umidificato con 5% di anidride carbonica a 37 ° C durante la notte prima di essere utilizzato. Le cellule devono raggiungere il 100% di confluenza prima ferimento.
- Collocare le punte ferimento alla sinistra (o destra) lato di ciascun pozzetto nella stessa colonna della piastra di coltura. Far scorrere il feritore verso l'altro lato del pozzo; assicurarsi che le punte ferimento tocchino il fondo del pozzo.
- Ripetere la graffiare (Passo 5.2) per tutte le colonne.
- Dopo il ferimento, scarti tegli media in ciascun pozzetto e sostituirlo con terreno contenente composti di test freschi.
6. Acquisizione dati e Image Analysis
- Immagine tutto bene con la ferita meccanica sul monostrato cellulare utilizzando un microscopio a bassa potenza con fotocamera digitale (es obiettivo 10X) immediatamente dopo ferimento (t = 0 h).
- Aggiungere composti di prova se desiderato e incubare per il tempo desiderato. Immagine tutto bene con l'area della ferita dopo il tempo di incubazione desiderato (t = Dh).
- L'utilizzo di immagini software di analisi come ad esempio ImageJ ( https://imagej.nih.gov/ij/ ), misurare l'area ferito l'immagine utilizzando lo strumento a mano libera.
- Calcolare la percentuale di chiusura della ferita:
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Risultati
Questo wounder meccanico 8 canali è costruito graffiare un monostrato di cellule al fine di eseguire il saggio migrazione cellulare. Si tratta di un dispositivo di facile utilizzo in grado di svolgere cellulari graffiare test in piastre da 96 pozzetti in meno di un minuto senza formazione specifica. Questo wounder può introdurre aree avvolte su monostrati di cellule con una larghezza uniforme di circa 600 micron e con spigoli vivi (figure 5 e 6). La larg...
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Discussione
Il nostro feritore cella ha diverse caratteristiche uniche nel risolvere i problemi dei test di migrazione delle cellule tradizionali. Il feritore cellule meccanico a 8 canali è realizzato in acciaio inox di alta qualità (acciaio 304) con una lunga durata di vita che può essere sterilizzato in autoclave. Quasi tutti marchi commerciali di piastre di coltura a 96 pozzetti disponibili sul mercato possono essere utilizzati con questo wounder cellule meccanica causa della barra guida regolabile. Il disegno della barra guida ...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il Sig Tam Po Leung, Mr. Wong Chi Kin e lo staff tecnico della Facoltà di Scienze Workshop, Hong Kong Baptist University, per le loro competenze tecniche e consigli per rendere il prototipo di questo feritore.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra per colture cellulari a 96 pozzetti | Nunc | 167008 | Possono essere utilizzate anche altre marche di piastre per colture cellulari a 96 pozzetti |
| Punte per pipette P10 | Axygen | 301-03-051 | La punta corta per pipette P10 è più facile da creare una ferita chiara |
| Wounder | R& P Technology Limited | ||
| Medium 199 | Sigma | M2520-1L | Per la coltura cellulare di cellule endoteliali della vena ombelicale umana. Utilizzare un terreno di coltura appropriato e condizionare per altri tipi di cellule. |
| Siero fetale bovino | Gibco | 26140079 | Per la coltura cellulare di cellule endoteliali della vena ombelicale umana. Utilizzare un terreno di coltura appropriato e condizionare per altri tipi di cellule. |
| Penicillina/Streptomicina | Gibco | 15140122 | Per la coltura cellulare di cellule endoteliali della vena ombelicale umana. Utilizzare un terreno di coltura appropriato e condizionare per altri tipi di cellule. |
| Sale sodico di eparina dalla mucosa intestinale suina | Sigma | H3393 | Per la coltura cellulare di cellule endoteliali della vena ombelicale umana. Utilizzare un terreno di coltura appropriato e condizionare per altri tipi di cellule. |
| Gelatina da pelle bovina | Sigma | G9391 | Per la coltura cellulare di cellule endoteliali della vena ombelicale umana. Utilizzare un terreno di coltura appropriato e condizionare per altri tipi di cellule. |
Riferimenti
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Friedl, P. Prespecification and plasticity: shifting mechanisms of cell migration. Curr Opin Cell Biol. 16 (1), 14-23 (2004).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
- Sholley, M. M., Gimbrone, M. A. Jr, Cotran, R. S. Cellular migration and replication in endothelial regeneration: a study using irradiated endothelial cultures. Lab Invest. 36 (1), 18-25 (1977).
- Gotlieb, A. I., Spector, W. Migration into an in vitro experimental wound: a comparison of porcine aortic endothelial and smooth muscle cells and the effect of culture irradiation. Am J Pathol. 103 (2), 271-282 (1981).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations. Sci Rep. 18 (5), 9980(2015).
- Yarrow, J. C., Periman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparsion of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21(2004).
- Lauder, H., Frost, E. E., Hiley, C. R., Fan, T. P. Quantification of the repair process involved in the repair of a cell monolayer using an in vitro model of mechanical injury. Angiogenesis. 2 (1), 67-80 (1998).
- Yue, P. Y. K., Leung, E. P. Y., Mak, N. K., Wong, R. N. S. A simplified method for quantifying cell migration/ wound healing in 96-well plates. J. Biomol Screen. 15 (4), 427-433 (2010).
- Yue, P. Y., et al. Elucidation of the mechanisms underlying the angiogenic effects of ginsenoside Rg(1) in vivo and in vitro. Angiogenesis. 8 (3), 205-216 (2005).
- Kwok, H. H., Chan, L. S., Poon, P. Y., Yue, P. Y., Wong, R. N. Ginsenoside-Rg1 induces angiogenesis by the inverse regulation of MET tyrosine kinase receptor expression through miR-23a. Toxicol Appl Pharmacol. 287 (3), 276-283 (2015).
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Ristampe e permessi
