Articolo metodologico

Identificazione di un Epitopo Lineare B-cell monoclonale riconosciuto Peptide scansione-assistito

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DOI:

10.3791/55417

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24 marzo 2017

 , 
1Institute of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica

In questo articolo

Sommario

Qui, gli autori presentano un protocollo semplice ed efficiente per definire un epitopo antigenico lineare utilizzando un anticorpo monoclonale purificato e la scansione dei peptidi attraverso l'ibridazione dot-blot. L'epitopo identificato può quindi essere utilizzato in applicazioni terapeutiche e diagnostiche.

Abstract

L'identificazione di un epitopo antigenico da parte del sistema immunitario permette la comprensione del meccanismo di protezione di anticorpi neutralizzanti che possono facilitare lo sviluppo di vaccini e farmaci peptidici. scansione Peptide è un metodo semplice ed efficace che mappa semplicemente l'epitopo lineare riconosciuto da un anticorpo monoclonale (mAb). Qui, gli autori presentano una metodologia di determinazione epitopi che coinvolge le proteine ​​ricombinanti in serie tronche, design peptide sintetico, e dot-blot ibridazione per il riconoscimento antigenico di proteina di rivestimento del virus della necrosi nervoso utilizzando un anticorpo monoclonale neutralizzante. Questa tecnica si basa sulla ibridazione dot-blot di peptidi sintetici e mAbs su una membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF). La regione minima antigenica di una proteina di rivestimento virale riconosciuta dalla RG-M56 mAb può essere ridotto passo-passo guarniti mappatura peptide su un peptide epitopo 6-mer. Inoltre, la scansione alanina mutagenesi e residui subsostituzioni con può essere effettuata per caratterizzare il significato di legame di ogni residuo di amminoacido costituente l'epitopo. I residui che fiancheggiano il sito epitopi sono stati trovati a svolgere un ruolo critico nella regolazione del peptide conformazione. Il peptide epitopo identificata può essere usato per formare cristalli di epitopi complessi peptide-anticorpo per uno studio x-ray diffrazione e la concorrenza funzionali, o terapeutica.

Introduzione

Nel sistema immunitario, la ricombinazione di segmenti V, D, J e permette agli anticorpi di creare enormi variazioni di complementarietà determinazione regioni (CDR) per il legame ai vari antigeni per proteggere l'host da infezione patogena. La difesa di neutralizzazione degli anticorpi contro gli antigeni dipende dalla complementarità spaziale tra i CDR degli anticorpi e gli epitopi degli antigeni. Pertanto, la comprensione di questa interazione molecolare aiuterà disegno vaccino profilattico e terapeutico sviluppo peptide farmaci. Tuttavia, questa interazione neutralizzazione può essere influenzato sia dalla più domini antigenici da un singolo antigene e da più CDR di anticorpi, che di conseguenza rendono il processo determinazione epitopo più complesso. Fortunatamente, lo sviluppo della tecnologia degli ibridomi, che fonde singole cellule produttrici di anticorpi con cellule di mieloma, consente un lotto costantemente dividendo di cellule secrete un anticorpo specifico, noto come un anticorpo monoclonale (mAb) 1. cellule di ibridoma producono questi puri, ad alta affinità anticorpi monoclonali di legarsi a un singolo dominio antigenica di un antigene specifico. Con il rapporto di antigene-anticorpo stabilito, diversi approcci, tra cui la scansione peptide, può essere utilizzato per determinare l'epitopo di un antigene utilizzando il mAb corrispondente. I recenti sviluppi nella tecnologia peptide sintetico hanno reso la tecnica di scansione peptide più accessibile e più conveniente per effettuare. Brevemente, un insieme di sovrapposizione peptidi sintetici sono prodotti secondo una sequenza antigene bersaglio e sono associate ad una membrana solido supportato per mAb ibridazione. scansione Peptide non solo offre un modo semplice per mappare la regione di legame dell'anticorpo, ma facilita anche aminoacidi (aa) mutagenesi tramite scansione residuo o di sostituzione per valutare l'interazione vincolante tra ciascun residuo aa del peptide epitopo e REC dell'anticorpo.

Qui, il presente studio descrive un protocollo per l'identificazione efficiente della epitopo lineare della proteina di rivestimento giallo cernie virus della necrosi nervosa (YGNNV) utilizzando un neutralizzante mAb 2, 3, 4. Il protocollo include mAb la preparazione, la costruzione e l'espressione di proteine ​​ricombinanti in serie tronche, sintetico disegno peptide sovrapposizione, dot-blot ibridazione, la scansione alanina, e la sostituzione mutagenesi. Considerando il costo elevato di sintesi peptidica, la fase di troncare serialmente le proteine ​​ricombinanti di una proteina bersaglio desiderato è stato modificato, e la regione antigenica è stata ridotta a circa 100 a 200 residui aa prima dell'esecuzione del sintetico matrice peptide analisi dot-blot.

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Protocollo

1. Preparazione di anticorpo monoclonale

  1. Cultura i monoclonali murini cellule di ibridoma RG-M56 2 in terreno privo di siero in fiaschi 175T a 37 ° C con 5% di CO 2 supplemento. Raccogliere il surnatante quando il colore del mezzo diventa giallo dopo cinque giorni di incubazione.
    NOTA: cellule di ibridoma sono state coltivate in terreno privo di siero per evitare la contaminazione di anticorpi da siero bovino fetale.
  2. Centrifugare il surnatante a 4.500 xg per 30 minuti a 4 ° C e scartare il pellet residui cellulari.
  3. Aggiungere 2 ml di agarosio proteina G (fornito come un impasto 50%) per una colonna di 5 ml ed equilibrare con 10 volumi di resina (10 ml) di PBS ghiacciato.
  4. Carico 200 mL del supernatante anticorpi (passo 1.2) sulla colonna e scartare il pass-through.
  5. Aggiungere 10 ml di PBS ghiacciato alla colonna di lavarlo. Ripetere due volte.
  6. Aggiungere 10 ml di 50 mM glicina, pH 2.7 alla colonna per eluire l'anticorpo proteina G-associata. Colnare 900 microlitri frazioni in una provetta contenente 100 ml di 10x tampone di neutralizzazione (1 M Tris, 1,5 M di NaCl, e 1 mM EDTA, pH 8,0).
  7. Conservare l'anticorpo purificato nel 50% glicerolo con 0,03% NaN 3 a -20 ° C.

2. Costruzione ed espressione di serie troncati proteine ​​ricombinanti

  1. Preparare una miscela di reazione di PCR: 5 ml di 10x tampone Pfu, 0,2 mM di ogni dNTP, 0,2 micron primer forward 3, 0,2 micron inverso Primer 3, 2 mM MgSO 4, 1 ng di pET20b-1A59 DNA 3 plasmide, e 2,5 U ( unità) di polimerasi Pfu DNA; aggiungere DDH 2 O per un volume finale di 50 microlitri.
    1. campioni eseguito in un termociclatore automatica utilizzando i seguenti parametri: Ciclo 1 (94 ° C per 5 min); cicli di 2-36 (94 ° C per 30 s, 63 ° C per 30 s, e 72 ° C per 60 s); e il ciclo di 37 (72 ° C per 7 min).
  2. Estrarre la reazione a catena della polimerasi (PCR) prodotti utilizzando un kit di purificazione PCR 5 per facilitare la seguente digestione enzima di restrizione.
  3. Digerire i frammenti di DNA PCR-amplificato con Nde I e Xho I enzimi di restrizione e legare ciascuno di questi frammenti di DNA in Nde I e Xho I enzima-spaccati PET-20b (+) vettoriale. Trasformare i costrutti in cellule di Escherichia coli DH-5alfa-competente 6.
    1. Preparare la miscela di digestione in un tampone di digestione (20 mM Tris-acetato, 10 mM Mg (CH 3 COO) 2, 50 mm KCH 3 COO, e 1 mM DTT, pH 7.9) con 1 mg di DNA PCR-amplificato o PET-20b (+) DNA vettoriale e 2 U di Nde I e Xho I di restrizione enzimi in un volume finale di 20 microlitri.
    2. Mescolare la miscela di digestione delicatamente e far girare rapidamente verso il basso. Incubare a 37 ° C per 2 ore in un bagno asciutto per garantire il taglio completo della restrizione sedersies.
    3. Estrarre i frammenti di DNA con enzimi di restrizione digerito usando un kit di purificazione PCR 5 per facilitare la seguente costruzione plasmide.
    4. Preparare l'impasto legatura in tampone legatura (66 mM Tris, 5 mM MgCl 2, 1 mM ATP, e 5 mm DTT, pH 7,5) con 100 ng di predigerito, DNA PCR-amplificato, 10 ng di predigerito PET-20b (+) DNA vettore, e 5 U di T4 DNA ligasi in un volume finale di 10 microlitri.
    5. Mescolare il composto legatura delicatamente e girare rapidamente verso il basso. Incubare a 16 ° C per 18 ore in un bagno d'acqua.
    6. Mettere 10 ml di campioni legatura in 100 ml di cellule DH-5α-competenti e mescolare delicatamente prima di mettere la provetta in ghiaccio per 30 min. Mettere la provetta in un bagno asciutto a 42 ° C per 90 s per indurre shock termico 7. trasferire immediatamente il tubo sul ghiaccio per 2 minuti.
    7. Aggiungere 900 ml di Luria-Bertani (LB) brodo (1% Bacto triptone, 0,5% Bacto lievito estrat, e 0,5% NaCl, pH 7,0) al tubo. Incubare a 37 ° C con 150 rpm agitazione per 45 min. Agglomerare le cellule per centrifugazione a 4.000 x g per 10 minuti e scartare il surnatante.
    8. Risospendere il pellet con 50 ml di brodo LB e diffondere ogni trasformazione su piastre LB pre-riscaldato contenenti 100 mg ampicillina / mL. Incubare le piastre a 37 ° C per 16 h.
    9. Prendete una singola colonia utilizzando una punta di 200 microlitri e metterlo in 3 ml di brodo LB contenente 100 mg ampicillina / ml in un tubo 15 ml vagamente innevate. Incubare a 37 ° C con 150 rpm agitazione per 12 ore.
    10. Estrarre il DNA plasmide 8 da ogni cultura e la sequenza usando promotore T7 e primer terminator T7 per confermare la sequenza di 9.
  4. Dopo la conferma di sequenza, di trasformare 10 ng di DNA da questi PET-20b (+) plasmidi con diverse lunghezze del gene della proteina di rivestimento YGNNV nel ceppo BL-21 (DE3) di E. coli da noiing il metodo shock termico 7. Seguire i passaggi 2.3.6-2.3.8 per eseguire la trasformazione.
  5. Trasferire una singola colonia da ogni trasformata E. coli BL-21 cellule in 3 ml di brodo LB contenente 100 mg ampicillina / ml in un tubo 15 ml vagamente innevate. Incubare la cultura a 37 ° C con agitazione 150 rpm.
  6. Raffreddare la coltura a 25 ° C quando la OD 600 della coltura è di circa 0,6 e aggiungere IPTG ad una concentrazione finale di 0,4 mM di indurre l'espressione della proteina ricombinante. Incubare la cultura per un extra di 4 ore a 25 ° C con 200 giri al minuto agitazione.
  7. Trasferire 1 ml di coltura in una provetta. Agglomerare le cellule per centrifugazione a 12.000 xg per 1 min e scartare il surnatante.
  8. Risospendere il pellet cellulare in 100 ml di tampone di denaturazione (8 M urea, 20 mM sodio fosfato, e 0,5 M NaCl, pH 7,4) pipettando su e giù con una micropipetta. Mescolare nel vortex vigorosa.
    NOTA: Il sol campioneutions dovrebbero ora essere semi-trasparente, un po 'appiccicoso, e pronto per il saggio di ibridazione dot-blot.

3. Progettazione e sintesi di peptidi sovrapposti

  1. Progettazione e sintesi di 3 seriali peptidi 20-mer che ogni sovrapposizione con il suo successore da 10 residui aa dalla regione 195-338 aa della proteina di rivestimento YGNNV per restringere la regione epitopo di RG-M56 mAb da dot blotting.
  2. Progettazione e sintetizzare peptidi 3 tre 8-Mer (195 VNVSVLCR 202, 197 VSVLCRWS 204, e 199 VLCRWSVR 206) con una sovrapposizione di 6 residui aa sul prossimo peptide sintetico per ridurre l'epitopo regione di 195-206 aa dal dot blotting.
  3. Progettazione e sintetizzare 3 7-mer (196 NVSVLCR 202 e 195 VNVSVLC 201), 6-mer (195 VNVSVL 200, 196 NVSVLC 201, e 197 VSVLCR 202), e 5-mer peptidi (195 VNVSV 199, 196 NVSVL 200, 197 VSVLC 201, e 198 SVLCR 202), con una sovrapposizione di 6, 5 e 4 residui aa rispettivamente, sui loro peptidi vicini per minimizzare la regione epitopo dal dot blotting.

4. Dot-blot ibridazione

  1. Sciogliere ciascun peptide sintetizzato in dimetilsolfossido (DMSO) ad una concentrazione finale di 10 mg / mL.
    NOTA: Per superare varie solubilità di peptidi sintetici, tutti i peptidi sintetici deve essere sciolto in DMSO. DMSO è un buon solvente per sciogliere completamente peptidi idrofobi o idrofili.
  2. Immergere la membrana di polivinilidene fluoruro (PVDF) con metanolo per 2 min.
    NOTA: membrana PVDF è fino a resistente a DMSO 100%; altri possono non essere così.
  3. Equilibrare la membrana PVDF con buffer modificato Towbin (25 mM Tris, 192 mM glicina, e 0,1% SDS, pH 8,3) per2 min.
    NOTA: 10-20% (v / v) di metanolo può essere aggiunto al buffer Towbin modificato per migliorare i risultati di trasferimento.
  4. Risciacquare un pezzo di carta cromatografica con tampone Towbin modificato. Posizionare la membrana PVDF sulla carta cromatografia. Attendere fino a quando il buffer Towbin modificato è scomparsa dalla superficie della membrana PVDF prima di procedere alla fase successiva.
  5. Aggiungere 2 ml di ogni campione peptide alla membrana con una punta di 10 microlitri. Far asciugare la membrana PVDF sulla carta cromatografia per 10 min. Aggiungere ciascun campione peptide lentamente e gradualmente sulla membrana per evitare troppa diffusione.
  6. Bloccare la membrana in tampone TBST (0,05% (v / v) Tween-20, 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4) con 5% di latte scremato per 30 minuti a temperatura ambiente agitando delicatamente.
  7. Aggiungere RG-M56 mAb a una diluizione finale di 1: 1.000 in tampone TBST con 5% di latte scremato alla membrana. Incubare la membrana a 37 ° C per 1 ora agitando delicatamente.
  8. Rimuovere l'anticorpo cosìluzione. Lavare la membrana in tampone TBST per 5 minuti agitando delicatamente. Ripetere due volte.
  9. Aggiungere l'anticorpo secondario (capra anti-IgG di topo, Fc, fosfatasi alcalina coniugata) a una diluizione finale di 1: 5.000 in tampone TBST con 5% di latte scremato alla membrana. Incubare la membrana a 37 ° C per 1 ora agitando delicatamente.
  10. Scartare la soluzione di anticorpi. Lavare la membrana in tampone TBST per 5 minuti agitando delicatamente. Ripetere la fase di lavaggio due volte.
  11. Sviluppare la membrana con soluzione di substrato BCIP / NBT a temperatura ambiente per 15 minuti al buio. Arrestare lo sviluppo lavando la membrana con DDH 2 O quando appare il segnale.
  12. Asciugare la membrana e catturare l'immagine dot-blot utilizzando un sistema di immagini.
  13. Misurare l'intensità di ogni macchia di punti utilizzando immagine software di analisi 3.

5. alanina scansione e Sostituzione

  1. Progettare e sintetizzare 3 alanina e methipeptidi sostituzione onine. Sostituire ogni residuo aa con alanina per la 8-mer peptide 195 VNVSVLCR 202 e sintetizzare peptidi 195 ANVSVLCR 202, 195 VAVSVLCR 202, 195 VNASVLCR 202, 195 VNVAVLCR 202, 195 VNVSALCR 202, 195 VNVSVACR 202, 195 VNVSVLAR 202, e 195 VNVSVLCA 202 . Sostituire leucina aa residuo 200 a metionina per creare la SJNNV genotipo epitopo peptide 195 VNVSVMCR 202.
  2. Seguire Sezione 4 per eseguire la scansione e alanina sostituzione mutagenesi puntino assorbente.

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Risultati

L'obiettivo di questo esperimento è stato quello di identificare un epitopo attraverso dot assorbente con anticorpo monoclonale. Per restringere rapidamente ed efficientemente giù regione antigenica riconosciuto dal mAb, l'intera lunghezza e proteine di rivestimento ricombinante YGNNV serialmente troncati con un tag di fusione 6xHis al C-terminale sono stati espressi da un sistema di espressione di E. coli PET 10 (Figura 1A). Le p...

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Discussione

Questo protocollo offre una tecnica rapida e semplice per identificare un epitopo lineare MAB-riconosciuto. Prendendo in considerazione il costo di sintesi peptidica e l'efficienza di produzione di peptidi sintetizzare, la regione antigenica della proteina di rivestimento del virus è stata ridotta di esprimere proteine ​​ricombinanti serialmente tronche prima dell'analisi scansione peptide. Come tale, il sistema affidabile ed efficiente espressione di E. coli pET stato usato per produrre queste proteine...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse relativi a questo rapporto.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano la signorina Ching-Chun Lin e la signorina Diana Lin della Core Facility dell'Istituto di Biologia Cellulare e Organismica (ICOB) dell'Academia Sinica per aver offerto la loro esperienza rispettivamente sulla sintesi dei peptidi e sul sequenziamento del DNA. Questo studio è stato sostenuto da Academia Sinica.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ibrido-SFM medioGibco12045-076
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbeccos (PBS)Gibco21600-069
Pfu DNA polimerasi Thermo Scientific EP0502 Compresi i buffer
T4 DNA ligasiRoche10799009001compresi i tamponi
NdeI New England BiolabsR0111SCompresi i tamponi
XhoI New England BiolabsR0146SCompresi i tamponi
pET-20b (+) vettoreNovagen, Merck Millipore69739<
em>E. coli DH-5α cellula competenteRBC BioscienceRH617
E. coli BL-21 (DE3) cellula competenteRBC BioscienceRH217
AmpicillinaAmresco0339-25G
Brodo LB Invitrongen12780-052
Isopropiltio-beta;-D-tiogalattoside (IPTG)MDBio, Inc.101-367-93-1
MetanoloMerck Millipore106009
Poliossietilene 20 Monolaurato di sorbitano (Tween-20)J.T.BakerX251-07
Dimetil solfossido (DMSO)SigmaD2650
GlicinaAmresco0167-5KG
TrisAffymetrix, USB75825
NaClAmresco0241-1KG
EDTAAmresco0105-1KG
GliceroloAmresco0854-1L
NaN3SigmaS2002-500G
BCIP/NBTPerkinElmerNEL937001PK
IgG anti-topo di capra, anticorpo frammento FcJackson ImmunoResearch115-055-008
Immobilon-P (fluoruro di polivinilidene, PVDF)Merck MilliporeIPVH00010
proteina G Agarosio Flusso rapidoMerck Millipore16-266
QIAquick PCR Kit di purificazioneQiagen28106
UVP BioSpectrum 600 Sistema di immaginiUVPn/a
Software di analisi VisionWorks LS Ver 6.8UVPn/a
Termociclatore MyCyclerBioRad1709713

Riferimenti

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