Articolo metodologico

Isolamento, caratterizzazione e purificazione dei macrofagi dai tessuti colpiti da infiammazione obesità

DOI:

10.3791/55445

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3 aprile 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, 2Microscopy and Cytometry Facility, The Huck Institutes of Life Sciences, Pennsylvania State University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo consente un ricercatore di isolare e caratterizzare residente in tessuto hallmark macrofagi in vari tessuti infiammati estratte dai modelli indotta da dieta di disordini metabolici.

Abstract

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L'obesità favorisce uno stato infiammatorio cronico che è in gran parte mediato dai macrofagi residenti in tessuto così come macrofagi monocito-derivati. L'obesità indotta da dieta (DIO) è un modello importante nello studio del ruolo di eterogeneità dei macrofagi; Tuttavia, gli isolamenti del macrofago adeguata sono difficili da acquisire da tessuti infiammati. In questo protocollo, vengono delineati i passaggi di isolamento e le necessarie linee guida sulla risoluzione dei problemi derivate dai nostri studi per l'ottenimento di una popolazione adatta dei macrofagi residenti in tessuto da topi dopo 18 settimane di grassi (HFD) o alto-grasso/colesterolo ( Intervento di dieta HFHCD). Questo protocollo si concentra su tre hallmark tessuti studiati nell'obesità e aterosclerosi compreso il fegato, tessuto adiposo bianco (WAT) e l'aorta. Evidenziamo l'utilizzo come dualistica di flusso cytometry può raggiungere una nuova dimensione di isolamento e caratterizzazione dei macrofagi residenti in tessuto. Una sezione fondamentale del presente protocollo risolve la complessità sottostante digestioni enzimatiche tessuto-specifici e isolamento del macrofago e successiva anticorpo cellula-superficie che macchia per analisi cytometric di flusso. Questo protocollo consente di risolvere complessità esistente alla base fluorescente-attivata delle cellule ordinano (FACS) e presenta chiarimenti a queste complessità in modo da ottenere la caratterizzazione di vasta gamma da popolazioni cellulari adeguatamente ordinato. Metodi di arricchimento alternativo sono inclusi per l'ordinamento di cellule, quali il fegato denso, consentendo per la gestione di tempo e flessibilità quando si lavora con FACS. In breve, questo protocollo aiuti al ricercatore di valutare l'eterogeneità dei macrofagi da una moltitudine di tessuti infiammati in un dato studio e fornisce penetranti suggerimenti sulla risoluzione dei problemi che hanno avuto successo per la caratterizzazione e isolamento cellulare favorevole delle cellule immuni in DIO-ha mediato l'infiammazione.

Introduzione

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Modelli murini sono stati ampiamente utilizzati per studiare la dinamica delle malattie umane. Adeguato isolamento delle cellule residenti del tessuto da topi in uno stato malato può fornire una piattaforma per comprendere i contributi molecolari e cellulari alla patogenesi di una malattia1. Un disordine che è di fondamentale importanza è l'obesità. L'incidenza dell'obesità continua ad aumentare in tutto il mondo in parallelo con l'insulino-resistenza e di tipo 2 mellitus del diabete, malattia cardiovascolare e steatosi epatica2,3. Eccessivo consumo di nutrienti è ulteriormente inclinato da riduzione dell'attività fisica innescando segnali alterati provenienti dal tessuto adiposo, che può alterare l'ambiente cellulare degli altri tessuti periferici quali l'aorta e fegato4. Tale perturbazione dell'omeostasi metabolica si traduce in un di infiammazione sistemica cronica di basso grado5.

Classica attivazione dei macrofagi residenti per l'aorta e fegato, nonché il loro reclutamento al tessuto adiposo bianco (WAT) ha dimostrato di non solo avviare il dysregulation di segnali metabolici, ma anche sostenere l'infiammazione6,7. L'eterogeneità fenotipica e funzionale dei macrofagi è fortemente associato con la patogenesi dell'obesità correlate a co-morbidità7. La plasticità dinamica nella polarizzazione del macrofago consente queste cellule ad esporre una gamma di fenotipi attivati che coordinano la progressione e la risoluzione di infiammazione8. Mentre i macrofagi (M1) classicamente attivati sono implicati nella propagazione dell'infiammazione, i macrofagi (M2) in alternativa attivati sono stati associati con risoluzione e tessuto riparazione9,10.

Come il corpo subisce stress metabolico, tessuto adiposo bianco si accumula in modo anomalo. Il tessuto adiposo espanso attira e trattiene le cellule infiammatorie che profondo alterano la normale funzione degli adipociti per promuovere l'insulino-resistenza, iperglicemia e diabete mellito di tipo 2 in ultima analisi, l'insulino-resistenza o iperglicemia11, 12. In parallelo, tessuto adiposo bianco rimodella in risposta a segnali infiammatori rilasciato da infiltrato classicamente attivati (M1) tessuto adiposo macrofagi (ATMs)13,14. Questo organo multi-cellulare esercita una cascata di segnali che deraglia la normale funzione di altri organi del corpo come l'aorta e fegato4.

Il fegato è un concentrato di metabolico che si adatta in risposta a stimoli provenienti da vicine dysregulated WAT15. Epatici macrofagi o cellule di Kupffer, in risposta a cambiamenti metabolici, secernono citochine infiammatorie che trasformano entrambi parenchimatica e fenotipo delle cellule non parenchimali e promuovono il rimodellamento tissutale. Accumulo di lipidi epatici, infiammazione, depositi eccessivi di matrice extracellulare, necrosi e funzione eventuale perdita segue gli insulti infiammatori contribuendo ad ampio spettro di danni al fegato associati con epatopatia steatosica non alcolica 16,17,18.

In parallelo al compromesso WAT e funzione epatica, grandi arterie si accumulano i lipidi all'interno della parete arteriosa come il corpo subisce lo stress metabolico cronico19. Accumulazione del lipido arteriosa innesca la secrezione di chemochine dalle cellule endoteliali attivate e successiva assunzione di monociti20. Una volta reclutate, monociti proliferano, differenziano, ingeriscono lipoproteine e diventano cellule della gomma piuma. Atherogenesis è avviata e sostenuta da attività pro-infiammatoria di reclutati e macrofagi lipido-carichi residente in tessuto. Soccombere ai segnali extracellulari ed intracellulari stress inoltrati in questo microambiente atherogenic, questi macrofagi quindi impegnano in una cascata di segnalazione di apoptotic. Come queste cellule schiumose muoiono, essi contribuiscono loro contenuto lipidico riempito al nucleo necrotico della lesione, che poi conduce alla rottura della placca, infarto miocardico e ictus.

Collettivamente, l'eterogeneità fenotipica del macrofago orchestra in parte l'obesità indotta da cambiamenti infiammatori osservati in tessuti dysregulated come WAT, fegato e dell'aorta8,21. Caratterizzazione di reclutati e macrofagi residenti tessuto potrebbero fornire la comprensione nei potenziali bersagli molecolari che manipolano macrofago fenotipo1. Per caratterizzare in modo efficace i macrofagi dai tessuti infiammati obesità-indotta, una sospensione di singola cellula può essere ottenuta tramite digestione enzimatica. Tali protocolli di dissociazione devono essere efficace nel sufficientemente degradante tessuto connettivo riducendo la morte delle cellule immuni e fornendo resa cellulare ottimale. La miscela di enzimi dipende dal tipo di tessuto e suo strutturale compongono. Tessuti resistenti, come l'aorta richiede più forte attività enzimatica, rispetto al fegato e WAT, per raggiungere la dissociazione dei tessuti. Dalla sospensione unicellulare, macrofagi residenti del tessuto possono essere inequivocabilmente caratterizzati o isolati per ulteriore analisi, a valle quali profiling trascrizionale.

Qui un protocollo di tessuto-specifico è descritto che utilizza la digestione della collagenosi-dipendente del tessuto e citometria a flusso policromatici efficacemente isolare e caratterizzare i macrofagi residenti in tessuto ottenuti da obesità dieta tradizionale ha indotto, aterosclerosi, semplice steatosi e steatoepatite modelli murini. Simultanea di colorazione degli indicatori della superficie delle cellule con anticorpi contro del leucocita-(CD45 e/o CD11b) e del macrofago - antigeni specifici (F4/80) è spesso utilizzato per identificare il macrofago popolazioni22. Fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) sono una strategia potente utilizzata per ordinare queste popolazioni identificate a elevata purezza. La popolazione ordinata quindi possa essere valutata per profili di gene specifico fenotipo mediante analisi molecolare a valle (ad esempio, reazione a catena della polimerasi quantitativa real time)23. Sebbene la citometria a flusso standard e flusso cytometry-base cella ordinamento sono strumenti potenti nel distinguere i macrofagi all'interno di una sospensione cellulare notevolmente eterogenei, i protocolli ex devono essere ottimizzati per garantire successo uscita. In questo studio, protocolli che efficacemente isolare e caratterizzano i macrofagi specifico tessuto vitale sono descritti; ancora più importante, questo studio fornisce approfondimenti cruciali di questioni tecniche che spesso sorgono, così come le strategie proattive e Trouble-Shooting per prevenire e/o risolverli.

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Protocollo

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Tutti i protocolli sperimentali (sezioni 1, 1.2 e 1.3) sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) presso la Pennsylvania State University.

TessutoPreparazione di buffer di dissociazioneVolume finaleDeposito
Tessuto adiposo bianco (WAT) Buffer di dissociazione: 2,5% HEPES, 10 mg/mL albumina di siero bovino (BSA), 3 mg/mL (0,3%) Collagenasi tipo II in di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) con 4,5 g/L glucosio senza L-glutamina e sodio piruvato500 mLmeno 80° C (aliquote di 10 mL)
Fegato 25 x aspersione tampone concentrato (PBC): 3.55 M NaCl, 168 mM KCl, 240 mM HEPES, 150 mM NaOH in acqua distillata deionizzata H2O500 mLmeno 20° C (aliquote 40 mL)
Buffer di conservazione (PRB): 1% BSA in 1x Buffer di perfusione1 L4 ° C
Buffer di dissociazione: 1 x aspersione Buffer completati con 4,76 mM CaCl2 e 72 U/mL collagenasi tipo IV50 mL (per topo)Preparare immediatamente prima dell'uso
Aorta Buffer di dissociazione: 125 U/mL collagenasi tipo XI, 60 U/mL ialuronidasi tipo I, 60 U/mL dnasi I, 450 U/mL collagenasi di tipo I, 20 mM HEPES in 1x tampone fosfato salino (PBS)500 mLmeno 80° C (aliquote di 10 mL)

Tabella 1: Ricette del buffer dell'aspersione specifici di tessuto.

1. tessuto isolamento e dissociazione

  1. Dissociazione e WAT isolamento
    1. Preparare i buffer di tessuto-specifici come da tabella 1e memorizzarli come descritto.
    2. Preparare i seguenti reagenti.
      1. Preparare il tampone di digestione di scongelamento il volume appropriato di WAT dissociazione tampone e conservare a 4 ° C fino all'utilizzo. Immediatamente prima dell'uso, caldo tampone a 37 ° C. Preparare il tampone di FACS preparando 1x tampone fosfato salino (PBS) contenente 2% siero bovino fetale (FBS).
    3. Isolamento di WAT
      1. Una camera del mouse in un anidride carbonica (CO2) riempito di eutanasia. Verificare l'efficacia prima di procedere alla fase di dissezione.
      2. Immergere il mouse eutanasizzato brevemente in un becher contenente etanolo al 70% fino a quando completamente imbevuto e rivestito con etanolo. Inserire la superficie ventrale del mouse verso l'alto sul palco di dissezione e fissare il mouse indietro e zampe posteriori alla scheda di dissezione usando gli aghi 21G.
      3. Utilizzare pinze punta punto medio per afferrare la pelle addominale anteriore l'apertura uretrale, quindi utilizzare forbici per dissezione per fare un nick nella pelle addominale afferrata.
      4. Inserire la lama inferiore delle forbici nell'incisione piccola tra la pelle e il peritoneo e fare un'incisione laterale dall'addome per la gabbia toracica.
      5. Tirare delicatamente la pelle per esporre la cavità peritoneale intatta ed effettuare un'incisione laterale attraverso il peritoneo e piegare indietro la membrana trasparente o asportare il tessuto per esporre il WAT addominale.
      6. Raccogliere i cuscinetti di grasso perigonadal, come descritto in Mann et al. 24
        1. I cuscinetti di grasso perigonadal in di topo maschio senza bloccare sono tenuti all'epididimo e testicoli. In primo luogo individuare i testicoli e poi con mezzo punto di pinze, afferrate la testa dell'epididimo e tirare delicatamente.
        2. Utilizzando delle forbici affilate per dissezione, asportare ogni grasso epididimario tagliando lungo la superficie dell'epididimo (testa, corpo e coda) e i testicoli.
        3. Con il forcipe, tirare delicatamente il cuscinetto di grasso mentre taglio attraverso il tessuto connettivo è direttamente legata alla struttura dell'epididimo.
        4. Utilizzando le pinze, afferrare saldamente la fine del rilievo grasso prossimale all'epididimo e Sbucci delicatamente il cuscinetto di grasso dalle gonadi
        5. Nei topi femmina, i cuscinetti di grasso perigonadal sono vagamente legame al corpo dell'utero e corno uterino.
        6. Usando il punto medio forcipe, afferrare il tessuto grasso perigonadal e tirare delicatamente il tessuto lontano dal corpo dell'utero e il corno uterino.
        7. Asportare ogni rilievo grasso tagliando lungo il corpo dell'utero e il corno uterino utilizzando delle forbici affilate per dissezione.
      7. Posizionare il grasso pastiglie in una capsula di Petri-riempito con PBS e tenere il ghiaccio per mantenere il tessuto umido.
    4. Dissociazione di WAT nelle sospensioni singola cella
      1. Togliere l'eccesso di PBS di Petri e utilizzare un'unico bordo rasoio lama per tritare il WAT addominale in piccoli pezzi.
      2. Con il bordo tagliente della lama di rasoio, raschiare delicatamente il WAT addominale macinato in una provetta di raccolta in polipropilene con etichetta 15 mL contenente 2 mL di tampone di dissociazione WAT.
      3. Incubare la miscela di buffer tessuto-digestione sotto lenta rotazione continua a 37 ° C per 45 min.
      4. Filtrare il tessuto digerito attraverso un colino di cella di 70 µm in una provetta di raccolta 50 mL mentre si muove il pistone di gomma di un stantuffo della siringa con un movimento circolare e continuare a setacciare la sospensione cellulare attraverso il filtro.
      5. Pipettare 2 mL di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) in una provetta da 15 mL, pipettare delicatamente su e giù e lavare il filtro con la sospensione unicellulare.
      6. Lavare il filtro altre due volte con DMEM freddo e la sospensione singola cella sul ghiaccio.
      7. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g a 4 ° C per 8 min.
      8. Utilizzare un aspiratore per rimuovere con cautela il galleggiante adipociti (prima) e il rimanente surnatante. Assicurarsi di non disturbare la frazione vascolare stromal pellettata (SVF).
      9. Con una pipetta di 1.000 µ l, delicatamente risospendere il pellet in tampone di cloruro di ammonio e potassio (ACK) a lisare gli eritrociti secondo le istruzioni del produttore.
      10. Diluire la sospensione cellulare sopra con DMEM e centrifugare la sospensione cellulare a 300 g a 4 ° C per 8 min.
      11. Risospendere le cellule in PBS freddo contenente il 2% FBS (FACS Buffer) e contare le celle in una camera di Burker/emocitometro.
      12. Trasferimento o 1 x 106 cellule (per citometria a flusso di base) o la sospensione di intera cella (per FACS) per provette da 5 mL turno-fondo in polistirolo. Continuare alla sezione 2 per citometria a flusso protocollo di colorazione.
  2. Dissociazione e l'isolamento del tessuto del fegato
    Nota: Questo protocollo è stato adattato da Smedsrød25.
    1. Preparare i buffer di tessuto-specifici come da tabella 1 e memorizzarli come descritto.
    2. Preparare i seguenti reagenti.
      1. Preparare 1 x aspersione Buffer (PB), da diluire 40 mL di PBC in 960 mL ultrapura H2O. pre-caldo una siringa riempita con 50 mL di PB a 37 ° C, poco prima che inizi l'aspersione. Eliminare eventuali bolle d'aria presenti.
        1. Per eliminare le bolle d'aria, invertire la siringa dove la punta di blocco leur è rivolta verso l'alto. Sfiorare o toccare la siringa fino a quando bolle d'aria sono per il pf superiore la siringa. Spingere lentamente lo stantuffo per espellere l'aria
      2. Preparare il tampone di digestione diluendo 0,5 mL di soluzione di CaCl2 di 476 mMa 49,5 mL 1 x buffer di aspersione. Aggiungere 3600U di collagenasi tipo IV al 4,76 mM CaCl2 – soluzione di PB. Pre-riscaldare una siringa riempita con 50 mL di tampone di digestione a 37 ° C, poco prima che inizi l'aspersione. Eliminare eventuali bolle d'aria presenti come descritto nel passaggio 1.2.2.1.1.
      3. Preparate la conservazione Buffer (PRB) sciogliendo g 2,5 albumina di siero bovino (BSA) in 250 mL di tampone per aspersione 1x. Conservare a 4 ° C o conservare il ghiaccio fino all'utilizzo.
      4. Preparare il tampone di FACS con 1x PBS e 2% FBS.
    3. Isolamento del tessuto del fegato
      1. Eutanasia di un mouse per CO2 asfissia, saturare mouse con etanolo al 70% per prevenire la contaminazione degli organi intra-addominali con pelliccia.
      2. Posizione lato ventrale del mouse fino su un polistirene espanso bordo di dissezione e fissare il mouse anteriore e posteriore zampe alla scheda di dissezione usando gli aghi 21G.
      3. Per esporre la parete toracica e la cavità peritoneale, afferrare la pelle addominale vicino all'apertura uretra usando una pinzetta punta punto medio. Quindi utilizzare un paio di forbici per dissezione tagliente per creare una piccola incisione sulla pelle addominale afferrato.
      4. Inserire la lama inferiore delle forbici nell'incisione piccola tra la pelle e il peritoneo e fare un'incisione laterale dall'inguine al mento.
      5. Tirare delicatamente la pelle per esporre la cavità peritoneale intatto e la parete toracica, fare un'incisione laterale attraverso il peritoneo e asportare la membrana.
      6. Sollevare lo sterno e accuratamente incise il diaframma, essere sicuri di non disturbare la vena cava inferiore (IVC). Spostare gli organi gastrointestinali al lato e individuare il IVC subhepatic. Utilizzare pinze emostatiche per serrare il suprahepatic IVC per mantenere la perfusione localizzata.
        Nota: Eccessivo accumulo di tessuto adiposo bianco viscerale spesso può mascherare il IVC. Per visualizzare meglio questo vaso, una piccola area di tessuto adiposo accanto l'IVC può essere asportata. La finestra incisa all'interno del tessuto grasso flessibile quindi può essere posizionata sopra l'IVC per esporre il vaso per inserimento di una canula.
      7. Collegare la siringa riempita con PB pre-riscaldato per il set di accumulazione e di infusione di sangue 23 G. Spingere delicatamente lo stantuffo fino a quando la tubazione e l'ago sono pieni di PB.
      8. Inserire l'ago 23G, parallelo al livello del subhepatic IVC. Fissare l'ago con una pinza emostatica di 4 cm.
        Nota: Inserimento di una canula di subhepatic che IVC è preferito nei topi di dieta-federazione in quanto l'IVC può essere meglio visualizzata e cannulate all'interno della cavità piene di grasso.
      9. Spingere lentamente lo stantuffo per iniziare la perfusione, colore svuoterà rapidamente dal fegato (lobo di destra prima) se l'ago viene posizionato in modo appropriato nel vaso. Allargamento dei lobi è anche visibile se l'ago è inserito correttamente nell'IVC subhepatic.
      10. Prontamente tagliare la vena portale per consentire il PB di fluire liberamente attraverso il fegato.
      11. Irrorare il fegato fino a quando il sangue non è più visibile. In occasione, massaggiare i lobi del fegato tra ribalta-dito e il pollice per facilitare l'aspersione.
        Nota: È importante utilizzare strumenti taglio smussati non seghettata per gestire il fegato per evitare danni ai tessuti.
      12. Quando 5 mL di PB rimane all'interno della siringa, cambiare la siringa riempita con buffer di dissociazione pre-riscaldato. Non disturbare la posizione dell'ago protetto durante questo tempo.
        Attenzione: Allargata fegati significativamente superiore a 1,5 g devono essere irrorati con un maggiore volume di tampone di digestione pre-riscaldato per garantire successo dissociazione del fegato.
      13. Irrorare il fegato fino a quando non completamente digerito. Massaggiare delicatamente i lobi del fegato per facilitare la perfusione.
        Nota: Separazione della capsula di Glisson dal parenchima è osservabile in un fegato digerito correttamente. Per valutare questo, utilizzare il bordo non tagliente di un paio di pinze, premere delicatamente il lobo laterale di sinistra. Un'impressione dovrebbe apparire sulla superficie e il rientro dovrebbe riempire lentamente una volta rimosso il forcipe.
      14. Rimuovere l'ago dalla subhepatic IVC. Non rimuovere le pinze emostatiche suprahepatic IVC di bloccaggio.
      15. Asportare l'intero fegato tagliando con attenzione attraverso la connessione utilizzando una lama dritta corta forbici di dissezione di legamenti e per rimuovere la cistifellea.
      16. Posizionare l'intero fegato in 10 cm di Petri contenente 10 mL ghiacciata Buffer di conservazione e conservare a 4 оC fino al pronto a liberare le cellule.
    4. Dissociazione delle cellule di fegato
      1. Trasferire il fegato a un piatto di 10 cm contenente 10 mL DMEM ghiacciata.
      2. Afferrare la mozzata suprahepatic che IVC attaccato al fegato asportato utilizzando una pinza dentata. Utilizzare pinze punta media per rilasciare le cellule dalla capsula di Glisson applicando il rapido movimento di carezze per ogni lobo.
      3. Passare il DMEM saturi attraverso un colino di cella µm 70 collegata ad un tubo di raccolta di 50 mL.
      4. Pipettare 10 mL ghiacciata DMEM al 10 cm di Petri e ripetere i passaggi da 1.2.4.1 a 1.2.4.3 fino a saturazione dei media non è osservata. Posizionare la sospensione cellulare in ghiaccio o a 4 ° C.
      5. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare capovolgendo la provetta di raccolta e poi Centrifugare a 54 x g per 2 min a 4 ° C.
      6. Raccogliere il surnatante in un tubo di raccolta pulita da 50 mL. Poi Centrifugare la sospensione cellulare a 54 x g per 2 min a 4 ° C.
      7. Ripetere il passaggio 1.2.4.6 altre due volte prima di procedere al passaggio 1.2.4.8.
      8. Trasferire il surnatante in una provetta pulita 50 mL-collezione e centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 10 min a 4 ° C.
      9. Risospendere il pellet di cellule non parenchimali nel buffer di FACS e contarli in un camera di Burker/emocitometro.
      10. Trasferire 1 x 106 cellule (per citometria a flusso di base) o 15 x 106 - 20 x 106 cellule (per FACS) a sfondo sferico polistirolo provette 5 mL. Continuare alla sezione 2 per citometria a flusso protocollo di colorazione.
  3. Dissociazione e l'isolamento dell'aorta
    Nota: Questo protocollo è stato adattato dal macellaioet al.26
    1. Preparare i buffer di tessuto-specifica basati sulle ricette fornite nella tabella 1 e memorizzarli come descritto.
    2. Preparare i seguenti reagenti.
      1. Preparare il tampone di digestione di scongelamento il volume appropriato di WAT dissociazione tampone e conservare a 4 ° C fino all'utilizzo. Immediatamente prima dell'uso, caldo tampone a 37 ° C.
      2. Preparare una soluzione di eparina 10x sciogliendo eparina sale sodico in 1X PBS a una concentrazione di 200 U/mL. Diluire la soluzione di riserva di eparina con PBS 1X per preparare una soluzione di eparina di 1x 10x. Memorizzare il 10x e 1 x soluzioni eparina a 4 ° C fino all'utilizzo.
      3. Preparare il tampone di FACS con 1x PBS contenente il 2% FBS.
    3. Dissezione dell'aorta
      1. Eutanasia di un topo in una camera di biossido di carbonio riempito e risciacquarlo con etanolo al 70%.
      2. Posizionare il lato ventrale del mouse fino sul palco di dissezione, diffondere il mouse indietro e le zampe posteriori e fissarli alla scheda di dissezione usando gli aghi 21G.
      3. Immediatamente dopo l'eutanasia il mouse, eseguire la puntura cardiaca. Fare riferimento ai passaggi 1.3.3.4 a 1.3.3.9, se necessario.
      4. Individuare il processo xifoideo all'estremità inferiore dello sterno
      5. A tale scopo, posizionare un punto medio dito lungo la larghezza del collo dell'animale. Risalire lungo la linea mediana ventrale dal collo all'estremità caudale dello sterno finché non si avverte un'estensione cartilaginosa.
      6. Utilizzare pinze punto medio per afferrare l'estensione cartilaginosa e se necessario contrassegnare la posizione del processo xifoideo rimuovendo la patch dei capelli o della pelle nella zona.
      7. Parzialmente inserire un ago 26 G sotto il processo xifoideo angolazione di 20-30°.
      8. Delicatamente applicare una pressione negativa alla siringa ritirando lentamente lo stantuffo, quindi inserire l'ago più ulteriormente nella cavità fino a quando il sangue scorre.
      9. Se si interrompe il flusso sanguigno, ruotare l'ago lentamente o spostare leggermente in e fuori.
      10. Uso il paio di pinze per afferrare tenere della pelle addominale anteriore uretrale aprendo e usare un paio di forbici per dissezione tagliente per tagliare lungo la linea mediana ventrale attraverso il peritoneo dall'inguine al mento.
      11. Tirare indietro la pelle per esporre gli organi addominali e gabbia toracica con le dita o forcipe smussato spostare delicatamente gli organi addominali al lato.
      12. Utilizzare le pinze per afferrare tenere del processo xifoideo, sollevare lo sterno e incise il diaframma.
      13. Usando le forbici per dissezione, tagliare attraverso le costole laterali su entrambi i lati. Presa dello sterno, capovolgere la gabbia toracica verso l'alto e tagliare la base di collegamento. Rimuovere la gabbia toracica esponendo i sottostanti organi toracici.
      14. Irrorare l'aorta con un ago 26-gauge attaccato ad un 10 mL-siringa riempita di soluzione di eparina: 1x iniettando 1-2 mL di soluzione nel ventricolo sinistro (LV) del cuore.
        Nota: Assicurarsi di irrorare ad un ritmo lento con poca pressione affinché intatte lesioni aterosclerotiche aortiche.
      15. Asportare il timo, i polmoni e tessuto connettivo. Fare riferimento ai punti 1.3.3.16 e 1.3.3.17, se necessario.
        1. Anteriore al cuore individuare il bianco bilobato (o a forma di farfalla) organo e saldamente afferrare del timo con le pinze. Allontanarsi verso l'alto entrambi i lobi della cavità e tagliare alla base con le forbici.
        2. Per rimuovere i polmoni, pizzicare un lobo del polmone con il forcipe, tirare il tessuto dalla cavità toracica e tagliare alla base. Ripetere per ogni lobo restante.
      16. Utilizzare un microscopio di dissezione e micro-dissezione strumenti e raccogliere che arco aortica (compreso l'arteria innominate, arteria carotide comune sinistra e dell'arteria succlavia sinistra), l'ascendente, discendente, aorta toracica e addominale.
        1. Individuare l'aorta ascendente al ventricolo sinistro del cuore.
        2. Con un paio di curve 0.07 x 0.04 mm-punta forcipe afferra delicatamente la parte dell'aorta ascendente, emergenti dal ventricolo sinistro.
          Nota: Rispetto al tessuto grasso circostante tinto di giallo, l'aorta sarà un vaso bianco brillante proveniente da LV quando sufficientemente scaricata con la soluzione di eparina.
          1. Se l'aorta non è stato correttamente scaricata tramite aspersione cardiaca, irrigare l'aorta nuovamente mentre l'aorta rimane connesso alla cavità. Per effettuare questa operazione, tagliare nei pressi dello svincolo di cuore-aorta, togliere il cuore e poi tagliare orizzontalmente attraverso l'estremità inferiore dell'aorta addominale. Inserire un ago 26 G nell'apertura dell'aorta ascendente e lavare delicatamente l'aorta con l'eparina soluzione 1x.
          2. Tirare delicatamente l'aorta ascendente di discriminare meglio tra il tessuto adiposo e l'aorta incorporato.
          3. Ancora delicatamente sull'aorta ascendente, usare la punta della primavera chiuso forbici di dissezione per eliminare il grasso che incapsulano l'aorta ascendente e l'arco aortico. A tale scopo, corsa il tessuto grasso con la punta delle lame a forbice chiusa a strappare via il grasso comunicante.
            Nota: Evitare di asportare qualsiasi tessuto grasso dal taglio fino a quando l'aorta ascendente e l'arco può essere chiaramente visibili. Questo serve a prevenire l'aorta di taglio.
          4. Se l'aorta ascendente e l'arco può essere chiaramente delineati dal tessuto grasso di surround, è possibile utilizzare la molla per dissezione Forbici per asportare il grasso in eccesso.
          5. Afferrare delicatamente dell'arco aortico con il forcipe. Utilizzando nuovamente il suggerimento di forbici di primavera, colpo presso il grasso lungo la lunghezza dell'aorta discendente, toracica e addominale all'estremità caudale dell'aorta addominale, farlo sul lato destro del manicotto di grasso.
          6. Continuare a cogliere lungo l'aorta quando strappare via il grasso. Essere sicuri di fare così delicatamente per evitare di danneggiare l'aorta.
          7. Tirare delicatamente l'aorta ascendente verso il microscopio in modo che il grasso è ora posizionato dietro l'aorta.
          8. Inserire le lame a forbice chiusa tra l'interfaccia di grasso-aorta vicino l'estremità anteriore dell'aorta discendente, grave allegato di tessuto grasso alla superficie di aorta senza mezzi termini con un movimento ampio.
            Nota: Accuratamente rimuovendo l'eccesso di grasso e tessuto di collegamento mentre l'aorta è ancora all'interno della cavità è consigliabile.
          9. Asportare il cuore e tagliato trasversalmente verso l'estremità caudale dell'aorta addominale. Rimuovere l'intera aorta.
          10. Posto dell'aorta in un piatto di 35 mm e stuzzicare via grasso in eccesso sull'aorta usando due aghi 21 gauge. Posizionare l'aorta asportata nel tubo del microcentrifuge 1,7 mL sul ghiaccio.
    4. Dissociazione dell'Aorta in sospensioni di cellule singole
      1. Pipettare 0,2 mL aorta dissociazione di tampone nella provetta contenente l'aorta. Inserire le lame della forbice di primavera verso l'estremità conica del tubo e tritare rapidamente l'aorta per facilitare la digestione enzimatica.
      2. Trasferire il composto di tessuto-soluzione a un 15 mL collezione tubo e pipetta 1,8 mL aorta dissociazione buffer per un volume totale di 2 mL.
        Nota: Per il semplice trasferimento della sospensione del tessuto, tagliare il 1 cm la parte conica della punta di una pipetta di 1.000 µ l standard. Utilizzare la punta accorciata per trasferire la sospensione con una micropipetta.
      3. Incubare l'aorta macinata nel buffer di dissociazione dell'aorta per 55 min a 37 ° C, agitando a 220 giri/min (0,514 x g).
      4. Passare la sospensione attraverso filtro cella 50-µm in una provetta da 15 mL in polipropilene collezione. Utilizzare il pistone di gomma di un stantuffo della siringa per facilitare il filtraggio.
      5. Sciacquare il tubo di raccolta da 15 mL con buffer di 1 mL FACS, raccogliere la sospensione e passare attraverso il filtro delle cellule.
      6. Lavare il filtro di cella µm 50 due volte con 1 mL di tampone di FACS.
      7. Agglomerare le cellule mediante centrifugazione a 300 x g per 5 min a 4 ° C. Risospendere le cellule in freddo FACS Buffer. Contare le celle in una camera di Burker/emocitometro.
      8. Trasferire o cellule 1 x 106 (per citometria a flusso di base) o la sospensione di intera cella (per FACS) un 5ml con etichetta rotonda-fondo polistirene provette. Continuare alla sezione 2 per citometria a flusso protocollo di colorazione.

2. flusso Cytometry e FACS macchiatura

FluoroforoR-ficoeritrina (PE)PE/cianina (Cy) 7PE/cianina (Cy) 5Pacific Blue (PB)
Laser (nm)Blu (488 nm) / giallo (561-570 nm) - verde (532 nm)Blu (488 nm) / giallo (561-570 nm) - verde (532 nm)Blu (488 nm) / giallo (561-570 nm) - verde (532 nm)Violetto (405 nm)
EccitazioneMAX (nm)496496496401
EmissioneMAX (nm)578785667455
Marcatore fenotipicoF4/80CD11cCD11bCD45
EMR1, Ly71Integrina αX, integrina αX catena, CR4, p150, ITGAXΑM integrina, Mac-1, Mo1, CR3, Ly-40, C3biR, ITGAMT200, Ly-5, LCA
Tipo di cella miratiMacrofagi residenti del tessutoMacrofagi attivati classicamente (M1)Monociti / macrofagiLeucociti (macrofagi / monociti, linfociti e granulociti)
Subset di cellule dendriticheCellule dendritiche, cellule NK, linfociti T attivati e un sottoinsieme di intestinali linfociti intraepiteliali (IEL)Granulociti, cellule dendritiche, cellule NK e sottoinsiemi di cellule T e B
Fattore di diluizione01:501: 1001: 1001: 100
Controlli di isotipoPE del ratto IgG2aCriceto armeno PE/Cy7 IgGPE/Cy5 topo IgG2bIgG2c ratto Blu Pacifico

Tabella 2: Elenco del fluoroforo contrassegnati gli anticorpi specifici per discriminante macrofagi residenti di tessuto.

  1. Raccogliere e preparare i seguenti elementi: tubi di polistirolo di turno-fondo di FACS Buffer 5 mL, recettore CD16/32 Fc anti-topo blocco dell'anticorpo, fluoroforo coniugato o unconjugated anticorpi primari, anticorpi secondari coniugati fluoroforo (se necessario), 1x tampone fosfato salino (PBS).
    Nota: Per la macchiatura grandi quantità di cellule, la concentrazione di anticorpi è più critici piuttosto che di numero di cellulare. Ad esempio, se colorazione 10x106 celle il volume di accumulo colorazione e concentrazione di anticorpi dovrebbe essere lo stesso come se colorazione 1.0 x 106 celle in 100 µ l di tampone. Per la colorazione 1.0 x 108 cellule, aumentando la quantità di anticorpo 5 volte è raccomandato.
  2. Eventualmente, aggiungere ulteriori ghiacciata FACS Buffer per ogni tubo di FACS, pellet di cellule mediante centrifugazione a 751 x g per 5 min (4 ° C). Aspirare il surnatante in seguito a centrifugazione.
  3. Aggiungere recettore CD16/CD32 Fc anti-topo blocco dell'anticorpo a tutti i campioni secondo le istruzioni del produttore. Incubare per 15 min a 4 ° C o su ghiaccio.
  4. Aggiungere esempi di anticorpo primario coniugato fluoroforo cocktail direttamente al recettore Fc blocco contenenti anticorpi delle cellule sospensione ed incubare a 4 ° C per 30 min. Protect esempi dalla luce per ridurre al minimo lo sbiancamento di anticorpi coniugati fluoroforo.
    1. Nel caso in cui sono stati utilizzati anticorpi primari non coniugati, eseguire la procedura a seguito di completamento passo 2.4.
    2. Anticorpo primario Wash macchiato campioni mediante centrifugazione a 751 x g per 5 min (4 ° C).
    3. Rimuovere il surnatante di decantazione e risospendere il pellet in 100 µ l di tampone di FACS.
    4. Anticorpo secondario coniugato in tutti i campioni necessari ed incubare per 30 min a 4 ° C. Procedere al punto 2.5.
  5. Incubazione dell'anticorpo seguente, aggiungere 2 mL di buffer di FACS freddo ghiaccio poi a pellet di cellule a 751 x g per 5 minuti (4 ° C). Decantare il supernatante ed essere sicuri di non disturbare il pellet.
  6. Mescolare delicatamente le cellule e quindi risospendere con 200-400 µ l di tampone di FACS, quindi tenetelo al buio a 4 ° C fino a analisi di citometria a flusso standard o ordinamento delle cellule.
  7. Per il fissaggio di breve termine delle cellule marcate, procedere a passi 2.8 a 2.10. Utilizzare la fissazione per la citometria a flusso standard solo.
  8. Subito dopo passo 2.5, risospendere le cellule in 0,5 mL 2-4% paraformaldeide (PFA) per 15-30 min a 4 ° C.
    Nota: Attenzione: PFA è un noto irritante con effetti cancerogeni e tossici. Quando si utilizza PFA, maneggiare con cura estrema. Assicurarsi di utilizzare appropriati dispositivi di protezione individuale e ventilazione di scarico.
  9. La fissazione seguente, lavare le cellule con l'aggiunta di 2 mL FACS tampone a tutti i campioni e centrifugare a 751 x g a 4 ° C per 5 min. Remove surnatante in seguito a centrifugazione.
  10. Risospendere le cellule fissate in 200 µ l di tampone di FACS freddo ghiaccio e conservare a 4 ° C. Negozio fix celle fino a 1 settimana a 4 ° C, idealmente effettuare l'acquisizione di citometria a flusso entro 48 ore per ridurre al minimo autofluorescenza.
  11. Acquisire dati di cytometry di flusso secondo le istruzioni del produttore citometro a flusso o eseguire ordinamento fluorescente delle cellule attivate come descritto da Basu et al. 23

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Risultati

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Quando si utilizza dell'apolipoproteina E (ApoE KO) C57BL/6 (BL6) topi mantenuti su una dieta di alto colesterolo alto grasso (HCHFD o HCD) per 18 settimane, 1 x 104 - 2 x 104 CD45++ F4/80 macrofagi aortici possono essere isolati, quando i due campioni sono in pool. Fegati sezionati da topi KO per ApoE HFHCD-Federazione, prodotto maggiore di cellule di Kupffer5 ordinato 5 x 10 (che dipende dal tempo di ordinamento disponibile). Quando...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modelli di malattia metabolica indotta da dieta che imitano co-morbidità, quali aterosclerosi, semplice steatosi e steatoepatite e diabete di tipo 2 sono ampiamente utilizzati per comprendere meglio i meccanismi molecolari della progressione di malattia. Dipendente dalla digestione della collagenosi viene spesso utilizzata per dissociare tessuti per liberare le cellule dalla matrice extracellulare (ECM)16,27. Enzimi quali la collagenasi perturbare collagene che f...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi di divulgare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vorremmo ringraziare il flusso Cytometry Core Facility presso The Pennsylvania State University Millennium scienza complessa.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
26 G x 5/8 pollici AghiBD305115
23 G x 0,75 pollici ago x 12 pollici Set per la raccolta del sangue BD367297Utilizzato per l'incannulamento dell'IVC sottoepatico durante la perfusione epatica
21 G 1 1/2 in. AghiBD305156
siringa da 1 mL con fermi in gommaBD309659
Siringhe da 10 mL BD309604
Siringa da 1 mLBD309659
F4/80 PEBiolegend123110
CD11c PE/Cy7Biolegend117318
CD11b PE/Cy5eBioscience15-0112-81
Blocco Fc CD16/32 anti-topo Biolegend101320
CD45 Blu PacificoBiolegend103126
PE Ratto IgG2aBiolegend400508
PE/Cy7 Criceto armeno IgGBiolegend400922
PE/Cy5 Ratto IgG2bBiolegend400610
Ratto blu del Pacifico IgG2cBiolegend400717
Dulbecco' s Eagle Medium modificato (DMEM) Cellgro15-017-CV
1x Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Cellgro21-031-CV
70 μ filtri per cellule mCorning, Inc.352350
Provetta per microcentrifuga da 1,7 mLDenvilleC2170
Soluzione acquosa di paraformaldeide -16xMicroscopia elettronica ScienzeCAS #30525-89-4
Forbici per micro dissezione, 3,5 pollici, diritte, 23 mm, affilate Stoelting52132-10PUtilizzato per scopi generali di dissezione
Micro pinze, 4 pollici, curva completa, 0,8 mmStoelting52102-37P Utilizzato per scopi di dissezione generale
Forbici per dissezione a molla – 3 mm Tagliente Fine Science Tool15000-10Utilizzato per la dissezione dell'aorta Passaggi da 1.3.3.17 a 1.3.3.28
Curvato 0,07 mm x 0,04  Pinza a punta mmStrumento per le scienze fini11297-10Utilizzato per la dissezione dell'aorta Passaggi da 1.3.3.17 a 1.3.3.28
Pinze emostatiche (curve)Strumento per le scienze fini13021-12
Eparina Sale sodico FischerScientific9041-08-1
Piastre per colture cellulari/Petri da 35 mmFischer Scientific12-565-90
Piastre per Petri in polistirene (10 cm) con coperchioFischer Scientific08-757-100D
Provette da centrifuga coniche da 15 mL (polipropilene)Fischer Scientific14-959-53A
Provette da centrifuga coniche da 50 mL ( FischerScientific14-432-22
Provette in polistirene a fondo tondo da 5 mLFischer Scientific14-959-5
Siero fetale bovinoGemini Bio-Products100-106
Etanolo (alcool etilico stock denaturato, anidrizzato)MilliporeEX0285-1
Siero bovino AlbuminaRocklandBSA-50
HEPESSigma-AldrichH3375
Collagenasi Tipo IISigma-AldrichC6885
Collagenasi Tipo XISigma-AldrichC7657
Ialuronidasi Tipo ISigma-AldrichH3506
DNAseSigma-AldrichDN25
Collagenasi Tipo ISigma-AldrichC0130
NaOHSigma Aldrich1310-73-2 
CaCl2Sigma Aldrich449709-10G
Bicchiere da 500 mLSigma Aldrich02-540M
Morsetto emostatico da 4 cmStoelting52120-40
Pinza dentataStoelting52104-33P
50 μ m Filtri monousoSystemex04-0042-2317
Collagenasi Tipo IVThermoFischer Scientific17104019
Cloruro di Ammonio Potassio (ACK)ThermoFischer Scientific 
Rasoi (0,22 mm (0,009"))VWR International55411-050
Texas Red MacchiaMacchia rossa di vitalità (in Figura 1A)
A1049201 viva/morta

Riferimenti

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