Analisi di terminazione della trascrizione Utilizzando BrUTP-strand-specifici Trascrizione Run-on (TRO) Approccio

Summary

Descriviamo un approccio sperimentale di base per l'analisi della terminazione della trascrizione da parte della RNA polimerasi II in vivo utilizzando BrUTP con l'approccio TRO (Strand-specific Transcription Run-on) in lievito in gemmazione. Questo protocollo può essere esteso per studiare la terminazione della trascrizione da parte di altre RNA polimerasi sia nel lievito che negli eucarioti superiori.

Abstract

Questo manoscritto descrive un protocollo per rilevare difetti trascrizione terminazione in vivo. Il protocollo TRO specifico filamento utilizzando BrUTP qui descritto è un potente approccio sperimentale per analizzare il difetto di terminazione della trascrizione in condizioni fisiologiche. Come il dosaggio TRO tradizionale, si basa sulla presenza di una polimerasi trascrizionalmente attivo oltre all'estremità 3 'del gene come indicatore di trascrizione terminazione difetti ^1. Supera due principali problemi incontrati con il test TRO tradizionale. In primo luogo, esso può rilevare se la polimerasi lettura attraverso il segnale di terminazione è quello che ha avviato la trascrizione dal promotore-prossimale, o se è semplicemente rappresentando una polimerasi diffusamente trascrizione che ha avviato non specificamente da qualche nel corpo o 3 ' fine del gene. In secondo luogo, può distinguere se il segnale polimerasi trascrizionalmente attivo oltre laregione terminatore è veramente il translettura polimerasi senso mRNA di trascrizione o un segnale di RNA anti-senso non codificante terminator-iniziati. Brevemente, il protocollo prevede permeabilizzante le cellule di lievito in crescita esponenziale, permettendo ai trascritti che avviati in vivo di allungare in presenza del nucleotide BrUTP, purificare RNA BrUTP marcato dall'approccio affinità, trascrizione inversa del RNA nascente purificato e amplificando il cDNA usando primer specifici filamento che fiancheggiano il promotore e le regioni di terminazione del gene ^2.

Introduction

Il ciclo di trascrizione eucariotica si compone di tre fasi principali; iniziazione, l'allungamento e la terminazione. La terminazione della trascrizione da parte della RNA polimerasi II è costituito da due distinte fasi, interdipendenti ^3. Il primo passo prevede la scissione, poliadenilazione e il rilascio di mRNA dal modello, ed è immediatamente seguita dalla seconda fase, segnata dal disimpegno della polimerasi dal modello. La corretta terminazione è di fondamentale importanza per il riciclaggio della polimerasi durante l'iniziazione / ripresa della trascrizione, per evitare l'interferenza con la trascrizione dei geni a valle, e per mantenere la trascrizione aberranti sotto controllo limitando trascrizione di pervasiva non codificante RNA ^{4, 5.} Nonostante i recenti progressi, la risoluzione è di gran lunga il meno passo capito del ciclo di trascrizione RNA polimerasi II. Un test terminazione affidabile è essenziale per studiare il meccanismo underlying terminazione della trascrizione da parte della RNA polimerasi II in vivo.

Un certo numero di approcci sperimentali sono utilizzati per rilevare il difetto di terminazione in un gene trascrizione attivamente in condizioni fisiologiche. Questi includono Northern blot, fattore di terminazione Chip (immunoprecipitazione della cromatina) e il saggio TRO tradizionale. Ognuna di queste tecniche hanno alcuni vantaggi e svantaggi. Il saggio TRO tradizionali utilizzati per essere l'approccio più affidabile e sensibile per la rilevazione di un difetto di terminazione della trascrizione in vivo ^1. Questo test localizza le molecole polimerasi trascrizionalmente attivi su diverse regioni di un gene all'interno della cella. In condizioni normali, il saggio dimostra molecole polimerasi trascrizionalmente impegnati rigorosamente distribuiti tra la regione promotore e terminatore del gene (Figura 1A). Alla cessazione difettoso, tuttavia, la polimerasi è in grado di leggere il segnale di terminazionee viene rilevato nella regione a valle del 'fine del gene (Figura 1B) 3.

Un difetto terminazione della trascrizione si manifesta in presenza di una polimerasi di senso trascrizione che ha avviato dalla regione promotore-prossimale, ed essere in grado di leggere il segnale di terminazione, continua trascrivere la regione a valle della estremità 3 'di un gene, come mostrato in figura 2A. Con la realizzazione che il genoma eucariotico presenta schiacciante trascrizione diffusa in senso così come le direzioni anti-senso e intorno a un gene ^{6, 7, 8, 9, 10,} divenne presto chiaro che il saggio TRO tradizionale non può rilevare se il segnale polimerasi a valle di un gene rappresenta una trascrizione promotore-avviata (Figura 2A) o un RNA aberrante che ha avviato somewhere nel mezzo del gene oa valle dell'elemento terminatore (Figura 2B), o la trascrizione polimerasi in direzione anti-senso dall'estremità 3 'del gene (Figura 2C). Il dosaggio specifico TRO-strand utilizzando BrUTP qui descritto può distinguere se il segnale polimerasi translettura osservato rappresenta promotore-avviato mRNA senso esteso o un trascritto antisenso che ha avviato valle del gene in esame. Abbiamo utilizzato con successo questo approccio per dimostrare il ruolo delle chinasi Kin28 a cessazione della trascrizione in erba di lievito ^2. Utilizzando l'approccio qui dimostriamo che Rna14 è necessario per la terminazione della trascrizione di ASC1 in erba lievito.

Protocol

NOTA: Questo metodo è stato utilizzato nell'articolo ricerca riportata nel Medler, S e Ansari, A. ^2.

1. la coltura e la raccolta delle cellule

1. Avviare una cultura 5 mL di cellule in terreno YPD (estratto di 10 g / L di lievito, 20 g / L peptone, 2% di destrosio) da una piastra di Saccharomyces cerevisiae appena striato.
2. Far crescere le cellule durante la notte in un agitatore orbitale a 30 ° C e 250 rpm.
3. Diluire la coltura cresciuta overnight 100 orari ad un volume finale di 100 ml in mezzo YPD in un pallone da 250 mL confuso.
   NOTA: E 'necessario un totale di 100 ml di coltura per reazione TRO; se sono necessari più reazioni, deve essere utilizzato un volume maggiore di cultura.
4. Far crescere le cellule ad una densità ottica pari a 0,8 - 1,0 in 600 nm (A ₆₀₀ ~ 0,8 - 1.0).
5. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 820 xg per 5 minuti a 4 ° C in un contenitore sterile tubo da 50 ml.
6. Risospendere le cellule in 10 ml di ghiaccio freddo bu TMNffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM MgCl _2, 100 mM NaCl) e incubare in ghiaccio per 5 min.
7. Centrifugare a 820 xg per 5 minuti a 4 ° C per sedimentare le cellule. Rimuovere delicatamente il surnatante tramite aspirazione.

2. permeabilizzante e preparare cellule per Run-on Assay

1. Risospendere le cellule in 1 ml di soluzione Sarkosyl 0,6% pipettando su e giù delicatamente con un tronco di P ₁₀₀₀ punta. Trasferire la sospensione cellulare ad una refrigerata 1,5 ml provetta.
2. Agitare gentilmente le cellule a 4 ° C per 25 minuti su un agitatore piattaforma.
   NOTA: i tubi microcentrifuga devono essere imballati in una provetta da 50 ml con ghiaccio per mantenere una temperatura fredda, evitando possibilità di eventuali nuovi eventi di iniziazione che si verificano al promotore in questa fase.
3. Centrifugare le cellule a 1200 xg per 6 minuti a 4 ° C usando un tavolo refrigerata centrifuga.
4. Aspirare delicatamente il surnatante per rimuovere il liquido in eccesso dal alpellet cellulare meabilized.

3. Trascrizione Run-on Reaction

1. Aggiungere 150 ml di trascrizione di run-in di buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM KCl, 10 mM MgCl _2, 2 mM DTT (ditiotreitolo), 0,75 mm ciascuno di ATP, CTP, GTP, e BrUTP, 200 U RNAsi inibitore) al pellet di cellule permeabilizzate.
2. Mescolare delicatamente pipettando su e giù con un tronco di P ₂₀₀ punta.
   NOTA: Se l'elaborazione di più campioni, tenere tutto in ghiaccio fino a quando tutti i campioni sono pronti e quindi procedere alla fase successiva.
3. Incubare per 5 minuti a 30 ° C in un bagno d'acqua.
   NOTA: Regolare il tempo di incubazione tra 1 e 5 min per assicurare integrazione ottimale del BrUTP nel RNA nascente.
4. Arrestare la reazione aggiungendo 500 ml di freddo reagente isolamento RNA pronto per l'uso. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.

4. RNA Estrazione

1. Aggiungere 200 ml di perline di vetro lavata con acido al suspensi cellularesu (passo 3,4), e agitare vigorosamente per 20 minuti a 4 ° C in un vortex.
2. Forare il fondo della provetta utilizzando un 22 G ago caldo e posizionarlo sulla parte superiore di un tubo conico sterile da 15 ml.
3. Centrifugare a 300 xg per 1 min a 4 ° C per raccogliere il lisato cellulare. Trasferire il lisato cellulare di una provetta da microcentrifuga da 1,5.
4. Aggiungere 500 ml di RNA freddo reagente isolamento e 200 ml di cloroformio al lisato cellulare. Mescolare il contenuto su un vortex e centrifugare a 16.168 xg per 20 minuti a 4 ° C.
5. Trasferire la fase acquosa superiore ad una nuova provetta.
6. Aggiungere un volume uguale di fenolo freddo / cloroformio / alcool isoamilico (125: 24: 1) pH 4-5. Agitare vigorosamente su un vortex e centrifugare a 16.168 xg per 15 min a 4 ° C.
7. Trasferire la fase acquosa contenente RNA superiore ad una nuova provetta. Ripetere il punto 4.6 altre due volte.
8. Per la fase acquosa finale di RNA contenenti, aggiungere 5 M NaCl stock per ottenere una concentrazione finale di 0,3 M. Aggiungere 3 volte la quantità in volume di etanolo freddo per precipitare l'RNA.
   1. Incubare per 1 ora o durante la notte a -20 ° C.
      NOTA: Eseguire le operazioni da 4.9 - 4.11, mentre le perle anti-BrdU vengono incubate per bloccare (vedi punto 5.3).
9. Centrifugare a 16.168 xg per 20 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet di RNA in 100 ml di acqua DEPC (dietilpirocarbonato).
10. Utilizzare un isolamento mini kit di RNA per separare l'RNA dai nucleotidi BrUTP prive di personalità giuridica. Eluire l'RNA dalla colonna con 100 ml di acqua RNasi-free.
11. Incubare l'RNA in un bagno d'acqua a 65 ° C per 5 minuti e poi trasferire in ghiaccio per almeno 2 min.

5. Affinità Purificazione di RNA BrUTP marcato

1. Per 25 ml di anti-BrdU stabilì perline, aggiungere 500 ml di 0,25x SSPE (sodio fosfato salino EDTA) tampone di legame (20x PESS: 3 M di NaCl, 0,2 M NaH ₂ PO ₄ , 0,02 M EDTA, pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,05% Tween, 37,5 mM NaCl). Centrifugare a 200 xg per 30 s a 4 ° C e rimuovere il surnatante.
2. Ripetere il passaggio 5.1 tre volte.
3. Aggiungere 500 ml di tampone di bloccaggio (1x Binding Buffer, 0.1% polivinilpirrolidone, 1 mg di ultra-puri albumina sierica bovina (BSA)) per le perline e agitare delicatamente per 1 - 2 ore a 4 ° C su un agitatore piattaforma.
4. Lavare le perline altre due volte con 500 ml di tampone di legame, come descritto al punto 5.1.
5. Aggiungere 400 ml di Binding Buffer ai talloni.
6. Trasferire 100 ml di RNA (dal punto 4.11) direttamente ai talloni. Incubare con delicata agitazione per 1 - 2 ore a 4 ° C su un agitatore piattaforma.
7. Lavare le perline in sequenza con 500 ml di tampone di legame, 500 ml di tampone basso contenuto di sale (0.2x PESS, 1 mM EDTA, 0.05% Tween), 500 ml di tampone di sale (0,25x PESS, 1 mM EDTA, 0,05% di Tween, 100 mM NaCl), e due volte con 500 ml di buffer di TET (1x TE, 0,05% di Tween), filatura a200 xg per 30 s a 4 ° C tra ogni lavaggio.
8. Eluire l'RNA BrUTP marcato da perline in sequenza, due volte con 150 microlitri e una volta con 200 ml di tampone di eluizione (20 mM DTT, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1% SDS), incubando per 4 min a 42 ° C in un bagno di acqua seguita da una breve centrifuga per separare perline dal surnatante.

6. Precipitazione di RNA BrUTP Labeled

1. Aggiungere 500 ml di freddo fenolo / cloroformio / alcool isoamilico (125: 24: 1) pH 4-5 per l'affinità purificato BrUTP etichettati RNA. Miscelare su vortex e centrifugare a 16.168 xg per 15 min a 4 ° C.
2. Trasferire la fase acquosa superiore ad una nuova provetta.
3. Aggiungere 5 M NaCl magazzino per ottenere una concentrazione finale di 0,3 M e 3 volte il volume di etanolo freddo per precipitare l'RNA.
4. Incubare a -20 ° C per una notte.
5. Raccogliere il RNA precipitato per centrifugazione a 16.168 xg per 30 min a 4 ° C.
6. Rimuovere il surnatante e consentire il pellet asciugare all'aria per 10 min.
7. Risospendere il pellet di RNA in 26 ml di acqua DEPC.
8. Determinare la concentrazione di RNA finale misurando l'assorbanza a 260 nm utilizzando uno spettrofotometro. Inoltre, determinare il rapporto di 260/280. Un rapporto ~ 2 è indicativa di un campione di RNA puro.
9. Conservare i campioni di RNA in aliquote a -80 ° C fino al momento della sintesi del DNA.

7. trascrizione inversa di RNA BrUTP marcato

1. Regolare la concentrazione di RNA a 100 ng / ml con acqua DEPC. Utilizzare 0,5 mg di RNA per ogni reazione di sintesi del DNA.
   NOTA: La concentrazione di template di RNA può variare da 0,5 a 1.0 mg per ottenere sintesi ottimale cDNA.
2. Reverse trascrivere l'RNA utilizzando più primer inversa disegnati a valle del sito (sito di terminazione) poli (A) come mostrato nella figura 3A.
3. Per ogni reazione di trascrizione inversa, aggiungere 5 ml di RNA template (0,5 mg), 1 dNTP mix microlitri (10 mM ciascuno), 2 ml di primer reverse C, D, E, F o G (50 pM ciascuno) (vedere la Figura 3A) e acqua priva di nucleasi. Il volume finale di reazione in ciascuna provetta è di 13 microlitri.
   NOTA: Il numero di reazioni di trascrizione inversa dipenderà dal numero di primer inversi utilizzati per la sintesi di cDNA. Ad esempio, per ASC1 cinque primer inverso sono stati utilizzati e quindi cinque reazioni trascrizione inversa sono stati istituiti. Etichettare i tubi come C, D, E, F e G sulla base del primer reverse utilizzato per la sintesi di cDNA.
4. Incubare le provette contenenti RNA template, miscela dNTP e primer in un termociclatore a 65 ° C per 5 minuti per rimuovere ogni conformazione strutturale secondaria, e poi raffreddare a 4 ° C per almeno 2 min.
5. Aggiungere 1 ml trascrittasi (200 U / mL) invertono, 4 microlitri di buffer e 2 ml di 0,1 M DTT in ogni provetta contenente il modello di RNA e innesco (passo 7,4). Mescolare pipettando gentilmente su e giù.
6. Eseguire trascrizione inversa incubando la miscela di reazione in un termociclatore a 42 ° C per 60 min.
7. Inattivare i trascrittasi inversa a 65 ° C per 20 min.
8. Conservare il cDNA a -20 ° C o procedere al passo successivo.

8. amplificazione di cDNA

1. Eseguire la reazione di PCR per l'amplificazione di ciascun preparato cDNA (etichettata C, D, E, F e G per ASC1) dal punto 7.8 come segue: template 3,0 microlitri di cDNA dal punto 7.8, 1.0 ml forward primer B (10 mM), 1,0 microlitri inversa Primer C o 10x polimerasi tampone D o e o F o G (10 micron), 2,5 microlitri PCR, 0,5 microlitri miscela dNTP (10 mm ciascuno), 1,0 ml MgCl ₂ (2,5 mm), 15,5 acqua di grado microlitri PCR, e 0,5 microlitri termostabile polimerasi dell'enzima.
   NOTA: diverse diluizioni di cDNA che va da 1: 5 a 1: 100 dovrebbero essere testati per ottimizzare la resa del prodotto di PCR. Un primer forward singolo promotore-prossimale sarà utilizzato per amplificare il cDNAottenuta utilizzando diversi inneschi inversa. Ad esempio, un singolo innesco B avanti situato vicino il promotore è stato usato in combinazione con cinque primer inversi da C a G per ASC1. BC, BD, BE, BF e BG sono stati usati in provette etichettate rispettivamente come C, D, E, F e G, come mostrato nella Figura 3A.
2. Eseguire la PCR utilizzando i seguenti parametri ciclo termico: 1 ciclo di 95 ° C per 2 min (hot start per l'attivazione della polimerasi), 30 - 40 cicli a 95 ° C per 30 s (denaturazione), 54 ° C per 15 s (ricottura) , 68 ° C per 1 min (estensione) e 1 ciclo a 68 ° C per 5 min (estensione finale).
   NOTA: La temperatura di ricottura può variare a seconda delle primers specifici utilizzati e il tempo di estensione varia a seconda delle dimensioni del prodotto atteso.
3. Separare il prodotto di PCR mediante elettroforesi su 0,8%, 1,5%, o 2 gel di agarosio% a seconda della dimensione prevista del prodotto.
4. Quantificare il prodotto di PCR come descritto in El Kaderi et al. , 2012 ^11.
   NOTA: In alternativa, utilizzare strategia in tempo reale RT-qPCR per quantificare la quantità di trascritti nascenti.

Results

Per dimostrare l'applicabilità della procedura TRO BrUTP-strand-specifica nel rilevare un difetto di terminazione della trascrizione, abbiamo utilizzato un mutante sensibile alla temperatura di cessazione difettoso di RNA14 chiamato rna14-1. Il ruolo di Rna14 in cessazione di trascrizione di RNA polimerasi II è stata dimostrata con il saggio TRO tradizionale che ha rilevato l'RNA nella regione Terminator-prossimale di geni selezionati ^1. La rilev...

Discussion

Il protocollo specifica TRO-filo usato qui è stato adattato dal protocollo utilizzato per GRO-Seq (Global Run On-Sequencing) analisi in cellule di mammifero ^12. Abbiamo modificato con successo il protocollo di studiare la trascrizione nascente in erba lievito. Per analizzare in particolare il difetto di terminazione della trascrizione, abbiamo regolato il protocollo ulteriormente per sbarazzarsi della fase di RNA idrolisi. Questo ci ha permesso di rilevare in particolare la lunghezza trascrizioni...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Miscela di alcol fenolo-cloroformio-isoamilico	Sigma-Aldrich	77619	pH 4-5
Reagente TRIzol	Life technologies	15596-026
Inibitore della RNasi, placenta umana	New England Biolabs	M0307S
Perline anti-BrdU	Santa Cruz Biotechnology	sc-32323AC
Protoscript II	New England Biolabs	M03368L	o un enzima equivalente
Advantage 2 polimerasi Mix	Clontech	639201	o un enzima equivalente
5-Bromouridina 5' trifosfato sale sodico	Santa Cruz Biotechnology	sc-214314A
RNeasy Mini kit	Qiagen	74104
ATP	New England Biolabs	N0451AA
CTP		N0454AA
GTP		N0452AA
Albumina sierica bovina ultrapura (BSA)	MC Labs	UBSA-100
Asc1 B			AGATTCGTCGGTCACAAGTCC
Asc1 C			GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC
Asc1 D			TGTACATATGTATTTTCGCAGCA
Asc1 E			GCCAAGGAGACTGAATTTAATG
Asc1 F			CTATGGAATGGGGGTTTTAAG
Asc1 G			GGTTATGGCAGACATGCCAC
5s cDNA			AGATTGCAGCACCTGAGT
5' 5s reverse			GGTTGCGGCCATATCTAC
3' 5s reverse			TGAGTTTCGCGTATGGTC