Articolo metodologico

Analisi di terminazione della trascrizione Utilizzando BrUTP-strand-specifici Trascrizione Run-on (TRO) Approccio

DOI:

10.3791/55446

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12 marzo 2017

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1Department of Biological Sciences, Wayne State University

In questo articolo

Sommario

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Descriviamo un approccio sperimentale di base per l'analisi della terminazione della trascrizione da parte della RNA polimerasi II in vivo utilizzando BrUTP con l'approccio TRO (Strand-specific Transcription Run-on) in lievito in gemmazione. Questo protocollo può essere esteso per studiare la terminazione della trascrizione da parte di altre RNA polimerasi sia nel lievito che negli eucarioti superiori.

Abstract

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Questo manoscritto descrive un protocollo per rilevare difetti trascrizione terminazione in vivo. Il protocollo TRO specifico filamento utilizzando BrUTP qui descritto è un potente approccio sperimentale per analizzare il difetto di terminazione della trascrizione in condizioni fisiologiche. Come il dosaggio TRO tradizionale, si basa sulla presenza di una polimerasi trascrizionalmente attivo oltre all'estremità 3 'del gene come indicatore di trascrizione terminazione difetti 1. Supera due principali problemi incontrati con il test TRO tradizionale. In primo luogo, esso può rilevare se la polimerasi lettura attraverso il segnale di terminazione è quello che ha avviato la trascrizione dal promotore-prossimale, o se è semplicemente rappresentando una polimerasi diffusamente trascrizione che ha avviato non specificamente da qualche nel corpo o 3 ' fine del gene. In secondo luogo, può distinguere se il segnale polimerasi trascrizionalmente attivo oltre laregione terminatore è veramente il translettura polimerasi senso mRNA di trascrizione o un segnale di RNA anti-senso non codificante terminator-iniziati. Brevemente, il protocollo prevede permeabilizzante le cellule di lievito in crescita esponenziale, permettendo ai trascritti che avviati in vivo di allungare in presenza del nucleotide BrUTP, purificare RNA BrUTP marcato dall'approccio affinità, trascrizione inversa del RNA nascente purificato e amplificando il cDNA usando primer specifici filamento che fiancheggiano il promotore e le regioni di terminazione del gene 2.

Introduzione

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Il ciclo di trascrizione eucariotica si compone di tre fasi principali; iniziazione, l'allungamento e la terminazione. La terminazione della trascrizione da parte della RNA polimerasi II è costituito da due distinte fasi, interdipendenti 3. Il primo passo prevede la scissione, poliadenilazione e il rilascio di mRNA dal modello, ed è immediatamente seguita dalla seconda fase, segnata dal disimpegno della polimerasi dal modello. La corretta terminazione è di fondamentale importanza per il riciclaggio della polimerasi durante l'iniziazione / ripresa della trascrizione, per evitare l'interferenza con la trascrizione dei geni a valle, e....

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Protocollo

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NOTA: Questo metodo è stato utilizzato nell'articolo ricerca riportata nel Medler, S e Ansari, A. 2.

1. la coltura e la raccolta delle cellule

  1. Avviare una cultura 5 mL di cellule in terreno YPD (estratto di 10 g / L di lievito, 20 g / L peptone, 2% di destrosio) da una piastra di Saccharomyces cerevisiae appena striato.
  2. Far crescere le cellule durante la notte in un agitatore orbitale a 30 ° C e 250 rpm.
  3. Diluire la coltura cresciuta overnight 100 orari ad un volume finale di 100 ml in mezzo YPD in un pallone da 250 mL confuso.
    NOTA: E 'necessario un totale di 1....

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Risultati

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Per dimostrare l'applicabilità della procedura TRO BrUTP-strand-specifica nel rilevare un difetto di terminazione della trascrizione, abbiamo utilizzato un mutante sensibile alla temperatura di cessazione difettoso di RNA14 chiamato rna14-1. Il ruolo di Rna14 in cessazione di trascrizione di RNA polimerasi II è stata dimostrata con il saggio TRO tradizionale che ha rilevato l'RNA nella regione Terminator-prossimale di geni selezionati 1. La rilev.......

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Discussione

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Il protocollo specifica TRO-filo usato qui è stato adattato dal protocollo utilizzato per GRO-Seq (Global Run On-Sequencing) analisi in cellule di mammifero 12. Abbiamo modificato con successo il protocollo di studiare la trascrizione nascente in erba lievito. Per analizzare in particolare il difetto di terminazione della trascrizione, abbiamo regolato il protocollo ulteriormente per sbarazzarsi della fase di RNA idrolisi. Questo ci ha permesso di rilevare in particolare la lunghezza trascrizioni.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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La ricerca nel laboratorio di Ansari è stata supportata dalla borsa di ricerca (No. MCB 1020911) dalla National Science Foundation.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Miscela di alcol fenolo-cloroformio-isoamilicoSigma-Aldrich77619pH 4-5
Reagente TRIzolLife technologies15596-026
Inibitore della RNasi, placenta umanaNew England BiolabsM0307S
Perline anti-BrdUSanta Cruz Biotechnologysc-32323AC
Protoscript IINew England BiolabsM03368Lo un enzima equivalente
Advantage 2 polimerasi MixClontech639201o un enzima equivalente
5-Bromouridina 5' trifosfato sale sodicoSanta Cruz Biotechnologysc-214314A
RNeasy Mini kitQiagen74104
ATPNew England BiolabsN0451AA
CTPN0454AA
GTPN0452AA
Albumina sierica bovina ultrapura (BSA)MC LabsUBSA-100
Asc1 BAGATTCGTCGGTCACAAGTCC
Asc1 CGAACTTTATACATATTCTTAGTT
AGCAGTC
Asc1 DTGTACATATGTATTTTCGCAGCA
Asc1 EGCCAAGGAGACTGAATTTAATG
Asc1 FCTATGGAATGGGGGTTTTAAG
Asc1 GGGTTATGGCAGACATGCCAC
5s cDNAAGATTGCAGCACCTGAGT
5' 5s reverseGGTTGCGGCCATATCTAC
3' 5s reverseTGAGTTTCGCGTATGGTC

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Birse, C. E., Minvielle-Sebastia, L., Lee, B. A., Keller, W., Proudfoot, N. J. Coupling termination of transcription to messenger RNA maturation in yeast. Science. 280 (5361), 298-301 (1998).
  2. Medler, S., Ansari, A. Gene looping facilitates TFIIH kinase-mediated termination of t....

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Transcription TerminationBrUTP TROStrand Specific TROTranscription Run OnYeast CellsRNA PurificationNascent TranscriptsPolymerase DetectionPromoter TerminatorcDNA Synthesis

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