Qui descritto è un metodo per l'estrazione, la purificazione e il controllo di qualità del DNA genomico dal patogeno fungino biotrofico obbligato, l'oidio, da utilizzare nel sequenziamento del genoma a lettura lunga.
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Articolo metodologico
Purificazione di alto peso molecolare genomico da oidio per lungo-Read Sequencing
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I funghi oidio sono un gruppo di economicamente importanti patogeni delle piante fungine. Relativamente poco si sa sulla biologia molecolare e genetica di questi agenti patogeni, in parte a causa della mancanza di risorse genetiche e genomiche ben sviluppati. Questi organismi hanno grandi, genomi ripetitivi, che hanno reso il sequenziamento del genoma e l'assemblaggio proibitivo difficile. Qui, descriviamo i metodi per la valutazione raccolta, l'estrazione, la purificazione e controllo di qualità di alto peso molecolare DNA genomico da specie muffa uno polverulente, Golovinomyces cichoracearum. Il protocollo descritto comprende distruzione meccanica delle spore seguiti da un ottimizzato fenolo / cloroformio estrazione di DNA genomico. Una resa tipica era 7 ug di DNA a 150 mg conidi. Il DNA genomico che viene isolato utilizzando questa procedura è adatto per il sequenziamento lungo lettura (cioè,> 48,5 kbp). misure di controllo qualità per garantire la dimensione, la resa e la purezza del DNA genomico sono anchedescritto in questo metodo. Sequenziamento del DNA genomico della qualità descritta qui consentirà per l'assemblaggio e il confronto dei genomi multipli oidio, che a sua volta portare ad una migliore comprensione e un migliore controllo di questo patogeno agricolo.
Introduzione
Mal bianco sono un gruppo di piante obbligato fungina biotrofico agenti patogeni che, nel loro insieme, sono la principale causa di malattie delle piante in tutto il mondo 1. Ci sono oltre 900 specie descritte di oidio, che sono stati tassonomico raggruppati in cinque tribù all'interno della famiglia Erisyphaceae 2. Sia per la loro importanza economica e l'intimo rapporto si sviluppano con i loro ospiti, malattie oidio sono stati oggetto di ricerca per> 100 anni. Al momento l'infezione, mal bianco suscitano drastici cambiamenti nella struttura cellulare, il metabolismo e la biologia molecolare dei loro ospiti, a beneficio di questo patogeno. Tuttavia, lo studio di mal bianco è particolarmente difficile a causa della loro vita obbligato, e crescita del fungo in coltura pura non è ancora stato descritto 3, 4, 5,"xref"> 6, 7, 8. Affidabile, stabile trasformazione genetica di mal bianco ha inoltre non è ancora stata compiuta, anche se la trasformazione transitoria è stata riportata in alcune specie 9, 10.
Il sequenziamento e l'assemblaggio di polverulenti genomi muffa ha dimostrato difficile a causa di una serie di caratteristiche del genoma stesso. Genomi oidio sono grandi (120 - 180 Mbp) rispetto ad altri genomi fungini, e consistono 60 - 90% elementi ripetitivi uniformemente distribuiti 11. Questi elementi includono ripetizioni terminali non-lungo, così come gli elementi ripetitivi non categorizzati. Due speciales formae di una singola specie oidio, Blumeria graminis f. sp. hordei e f. sp. tritici (BGH e Bgt, rispettivamente), così come l'uva oidio Erysiphe necator, been sequenziato, e un progetto di genomi per molti altri sono stati completati 12, 13, 14. La ripetitività dei genomi ha reso difficile il montaggio, e il genoma BGH pronto è stato assemblato in 6.989 supercontigs con L50 di 2 Mb 12.
Nonostante il grande genoma, i mal bianco sembrano avere un piccolo numero di geni che codificano proteine, con 5.845 e 6.540 geni predetti in BGH e Bgt, rispettivamente. I oidi sequenziate appaiono anche mancare almeno 99 geni essenziali che sono essenziali in altri funghi, che è coerente con la dipendenza dei funghi sulla loro pianta ospite per la sopravvivenza 11, 12, 13, 14.
sequenze ripetitive vicino telomeri, centromeri, RN ribosomialeUn array e regioni arricchite in elementi trasponibili gene sono scarsamente assemblati dalle strategie di sequenziamento short-letto e sono spesso sottorappresentati negli assiemi genoma 15. Tali regioni sono ritenuti responsabili di molte delle lacune che si verificano in sequenze genomiche, e questo vale per i mal bianco con la loro vasta espansione elementi ripetitivi 16. Altamente regioni del genoma di plastica si trovano spesso in tali regioni ripetitive 3. Essi servono come sito di riarrangiamenti e spesso codificano geni sotto forte pressione selettiva, come i geni che codificano proteine effettrici e geni codificanti enzimi del metabolismo secondario. I progressi nelle tecnologie di sequenziamento di lunga lettura singola molecola di fornire una possibile soluzione per il sequenziamento tra le regioni ripetitive di genomi 15. Ad esempio, Faino et al. (2015) hanno trovato che l'inclusione di lunga sequenza leggi le tecnologie e m otticoANALITICI permesso loro di produrre una sequenza genomica gap-meno due ceppi della pianta fungina patogeni Verticillium dalia, triplicando la proporzione di sequenze di DNA ripetute nel genoma, aumentando il numero di annotazioni geniche (e riducendo il numero di parziale o mancanti annotazioni geniche ) e genoma rivelatrice riarrangiamenti 17.
Impiegare queste tecnologie di sequenziamento lunghe lettura, elevate concentrazioni di DNA genomico di alta qualità, con minime dimensioni> 20 kbp, sono necessari. Qui si descrivono i nostri metodi per la raccolta dei conidi, purificazione del DNA ad alto peso molecolare da conidi e le nostre valutazioni controllo qualità utilizzando le specie oidio Golovinomyces cichoracearum cresciuti su cetriolo 18. Questo protocollo si basa su un protocollo sviluppato nel gruppo laboratorio B. Keller (Università di Zurigo, Zurigo Svizzera) 13, 19e include diverse modifiche che hanno portato a un incremento delle rese di DNA e una maggiore percentuale di DNA> 48,5 kbp dimensioni. Il protocollo include anche misure di controllo di qualità sulla base delle raccomandazioni da parte del Dipartimento dell'energia degli Stati Uniti Joint Genome Institute 20, 21, 22.
La funzione di ciascun reagente inclusa nel tampone di lisi, e la logica per ogni fase di purificazione, sono come descritto in Henry (2008) 23. Protocolli pubblicati disponibili per l'isolamento di alto peso molecolare DNA genomico da tessuti vegetali e microbici sono stati consultati anche durante la progettazione di questo protocollo 24, 25, 26, 27, 28.
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Protocollo
1. Preparazione del materiale Fungal
- Crescere Oidio
- Crescere le piante in camere di crescita con le seguenti condizioni: 22 ° C Temperatura di giorno, temperatura 20 ° C notte, 80% di umidità relativa, 14-h giornata intera e un'intensità luminosa di 125 μE / m 2 / s (fornito da lampade fluorescenti ).
- Infettare piante di cetriolo (Cucumis sativa varietà Bush Champion) con Golovinomyces cichoracearum ceppo UCSC1 come descritto 18, 29.
- Fare la raccolta Oidio Conidi
- Raccolto conidi da piante infette a 7 - 10 giorni dopo l'inoculazione con un piccolo vuoto con un filtro in linea (11 micron) su cui i conidi accumulano. Applicando una leggera pressione, eseguire l'ugello di vuoto lungo la superficie della foglia per raccogliere il conidi.
NOTA: La resa media di G. cichoracearum è di 20 mg di conidi da un pesantemente infeCTED foglia di cetriolo di circa 130 cm 2 nella zona. - Spazzolare circa 150 mg di conidi (circa 375 volumi mL o conidi di 7-8 foglie cetriolo infetti) dal filtro su un foglio di carta pulita. Da qui, trasferire conidi in 2 mL cryovials con diametro due 5/32-inch pre-raffreddata (in azoto liquido) palle di macinazione in acciaio. ritornare immediatamente tubi di azoto liquido. conservare le provette a -80 ° C.
- Raccolto conidi da piante infette a 7 - 10 giorni dopo l'inoculazione con un piccolo vuoto con un filtro in linea (11 micron) su cui i conidi accumulano. Applicando una leggera pressione, eseguire l'ugello di vuoto lungo la superficie della foglia per raccogliere il conidi.
- Rottura aperta Conidi da Ball Milling
- Flash congelare piatti di alluminio di mulino a palle in azoto liquido. Carico cryovials in cremagliera mulini a palle. Agitare vigorosamente la cryovials con conidi e acciaio palline in mulino a sfere per 30 s a 30 cicli / s (a temperatura ambiente). ricongelare immediatamente cryovials in azoto liquido.
NOTA: Inizialmente, accedere ad un campione di conidi mediante microscopia a ingrandimento 100X per l'efficienza di rottura della parete cellulare durante la macinazione. Se necessario, macinare per altri 1 - 2 cicli di 30 s per 30 cicli / s, but mantenere il numero di giri al minimo. La valutazione di routine di rottura conidica al microscopio in questa fase non è necessaria una volta stabilite le condizioni ottimali.
- Flash congelare piatti di alluminio di mulino a palle in azoto liquido. Carico cryovials in cremagliera mulini a palle. Agitare vigorosamente la cryovials con conidi e acciaio palline in mulino a sfere per 30 s a 30 cicli / s (a temperatura ambiente). ricongelare immediatamente cryovials in azoto liquido.
2. Il DNA genomico Purificazione
- conidi Lysis
- Lavorando in fretta per evitare lo scongelamento conidi, rimuovere le sfere di acciaio da cryovials con un magnete. Aggiungere 700 microlitri 65 ° C tampone di lisi (Tabella 1) e vortex 5 - 10 s fino a formare un impasto liquido.
- Aggiungere 300 microlitri pre-riscaldato (65 ° C) 5% (v / v) sarcosilL e capovolgere delicatamente per miscelare (1 inversione per 3 s) cinque volte. Incubare le provette per 30 min a 65 ° C; invertire delicatamente 3 volte a 10, 20 e 30 min. Usando una pipetta ampio tunnel, trasferire l'intera soluzione di nuovo 2 ml provetta. In tutte le fasi successive, mescolare delicatamente, lenta inversione e trasferire le soluzioni di DNA contenenti con punte di pipette ampio tunnel.
- DNA Extraction I
- Aggiungere 1 volume di cloroforma: alcool isoamilico (24: 1 v / v) alla soluzione di lisi e capovolgendo delicatamente per miscelare cinque volte. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, delicatamente per miscelare invertendo cinque volte a metà strada e di nuovo alla fine dell'incubazione. Centrifugare a temperatura ambiente per 15 minuti a 14.000 x g. Utilizzando ampio tunnel punta della pipetta, trasferire accuratamente lo strato acquoso al nuovo 2 ml provetta; evitare di includere materiale dall'interfaccia.
- DNA Precipitazioni I
- Aggiungere 1 volume temperatura ambiente 100% isopropanolo (circa 750 mL) e capovolgere delicatamente per miscelare sei volte. Centrifugare a temperatura ambiente per 15 minuti a 14.000 x g. rimuovere con attenzione il surnatante e gettarlo.
- Aggiungere 450 microlitri pre-raffreddata (-20 ° C) 70% di etanolo. Centrifugare per 5 minuti a temperatura ambiente a 14.000 x g. rimuovere con attenzione il surnatante e gettarlo. Centrifugare a 1000 xg per 3 s, rimuovere con attenzione il surnatante con punta fine della pipetta e scartare. Far asciugare il pellet per 15 minuti unat temperatura ambiente. Non asciugare per più di 15 min.
- Risospendere il pellet in 300 microlitri TE (10 mM Tris-Cl, 1 mM di acido etilendiammina tetra-acetico, pH 8,0). Incubare per una notte a 4 ° C. Delicatamente flick per sospendere di nuovo il materiale residuo che non è andato in soluzione.
- Per eliminare la contaminazione di RNA, aggiungere 10 ml RNasi A (10 mg / mL). Delicatamente capovolgere per mescolare tre volte. Centrifugare a 1000 xg per 3 s. Incubare a 37 ° C per 2 h.
- DNA Extraction II
- Aggiungere 300 microlitri fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25: 24: 1 v / v) e capovolgere delicatamente per miscelare cinque volte. Incubare 10 minuti a temperatura ambiente, delicatamente invertendo mescolare cinque volte al giro di boa e di nuovo alla fine dell'incubazione. Centrifugare 15 min a temperatura ambiente a 14.000 x g. Usando un puntale ampio tunnel, trasferire il surnatante in nuova 1,5 ml provetta.
- DNA Precipitazioni II
- Aggiungere 0,01 volume di 3 M acetato di sodio pH 5,2 (approximately 3 ml), capovolgere delicatamente per miscelare cinque volte. Aggiungere 2,5 volumi pre-raffreddata (-20 ° C) 100% di etanolo (circa 750 mL). Delicatamente capovolgere per mescolare cinque volte. Incubare per una notte a -20 ° C.
- Centrifugare 30 min a 4 ° C a 14.000 x g. rimuovere con attenzione il surnatante e gettarlo.
- Aggiungere 450 microlitri pre-raffreddata (-20 ° C) 70% di etanolo. Centrifugare per 5 minuti a 4 ° C a 14.000 x g. rimuovere con attenzione il surnatante e gettarlo. Centrifugare a 1000 xg per 3 s. rimuovere con attenzione il surnatante con punta fine pipetta e degli scarti.
- Far asciugare il pellet per 30-60 minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in 27,5 microlitri TE. Incubare per una notte a 4 ° C. Delicatamente flick per sospendere di nuovo il materiale residuo che non è andato in soluzione.
- Aliquotare 2,5 ml in 22,5 microlitri TE (volume finale 25 ml) per prove di controllo di qualità (vedi sotto). campioni di DNA Conservare a 4 ° C fino alla presentazione per il sequenziamento. Per lo stoccaggio, conservare i campioni a lungo terminea -80 ° C e ridurre al minimo i cicli di gelo-disgelo per evitare taglio.
NOTA: Fare attenzione durante la dispensazione in questa fase, come l'elevato peso molecolare DNA genomico possono essere difficili da pipettare correttamente, ed è importante per garantire che "QC aliquota" è una rappresentazione accurata del campione di DNA genomico.
3. Controllo Qualità
- Purezza del campione
- Utilizzando un TE vuoto, valutare la purezza del campione di DNA caricando 1 ml di QC Aliquotare su uno spettrofotometro piccolo volume. Record A260 / A280 e A260 / A230 letture. DNA puro avrà un rapporto A260 / A280 del rapporto di circa 1,8 e A260 / A230 tra 1,8 e 2,2.
- La quantificazione del DNA genomico
- Eseguire la quantificazione di QC aliquota utilizzando un kit di analisi quantificazione del DNA a doppio filamento commerciale secondo le istruzioni del produttore.
- DNA valutazione della qualità I
- Carico di circa 60 ng di DNA genomico eladder DNA su un gel di agarosio 0,7% in TAE 1x (40 mM Tris, 20 mM acido acetico, e 1 mM EDTA, pH 8,0). Apparecchiatura gel funzionare a 70 V per 40 - 45 min fino bande di DNA genomico sono circa 2 cm dal pozzo e banda separazione nella scala è evidente. Queste condizioni possono essere necessario regolare basato su apparato gel elettroforesi disponibili.
- DNA valutazione della qualità II
- Carico di circa 60 ng di DNA genomico e molecolare elevato peso DNA ladder (adatto per pulsato-field gel electrophoresis) su un gel di agarosio 1% in 0,5x TBE (44.5 mM Tris, 44,5 mM di acido borico, 1 mM EDTA, pH 8,3) e eseguire in 0.5x TBE tampone di corsa con un 5 - campo pulsato protocollo elettroforesi su gel 80 kbp forma d'onda per 16 h.
- La valutazione di batteri, funghi e contaminanti vegetali
- Eseguire la reazione a catena della polimerasi (PCR) per amplificare le opportune distanziatori interni trascritti (ITS) regioni dei geni ribosomali utilizzando primer e condizioni di amplificazione listacato nella tabella 2. Carico 10 microlitri della reazione risultante su un gel.
NOTA: Una band che rappresenta l'oidio regione ITS deve essere amplificato con il primer fungine ITS. DNA da questo amplicone e ogni amplicone generata con i primer o vegetali batteriche dovrebbe essere sequenziato per determinare l'origine della contaminazione. Solo oidio sequenze ITS dovrebbe essere trovato nel amplicone fungine.
- Eseguire la reazione a catena della polimerasi (PCR) per amplificare le opportune distanziatori interni trascritti (ITS) regioni dei geni ribosomali utilizzando primer e condizioni di amplificazione listacato nella tabella 2. Carico 10 microlitri della reazione risultante su un gel.
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Risultati
Un esempio rappresentativo di 60ng purificato DNA genomico da G. cichoracearum eseguito su un gel di agarosio usando elettroforesi su gel e utilizzando campo pulsato elettroforesi su gel sono mostrati nelle Figure 1 e 2 rispettivamente,. preparazioni di DNA genomico che passano, marginalmente accettazione e di rifiuto controllo qualità sono rappresentati. preparazioni di DNA genomico che passano completamente il controllo della ...
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Discussione
Per ottenere puro, alto peso molecolare DNA genomico dal obbligato biotrofico funghi oidio, una versione modificata di metodi precedentemente descritti è stato sviluppato 30. La resa media usando questo protocollo ottimizzato è 7 ug di DNA a 150 mg conidi, un raddoppio della resa ottenuta con un protocollo precedente. Inoltre, la dimensione media è aumentata da circa 20 a oltre 48,5 kbp kbp. Questo protocollo è stato ottimizzato nel cucumber- sistema cichoracearum G.. Per ottenere la mig...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo protocollo è stato sviluppato a sostegno di un progetto di sequenziamento congiunto Genome Institute-Community (#1657). Il lavoro è stato sostenuto in parte dalla Philomathia Foundation, dalla National Science Foundation (#0929226) e dall'Energy Biosciences Institute a S. Somerville; e dal Fondo Nazionale Svizzero per la Ricerca Scientifica (#310030_163260) a B. Keller. Vorremmo ringraziare i nostri colleghi, M. Figureroa e M. Miller (Università del Minnesota), R. Panstruga (RWTH Aachen University), C. Pedersen (Università di Copenhagen), P. Spanu (Imperial College), J. Taneja (Università della California Berkeley), M. Wildermuth (Università della California Berkeley), R. Wise (Iowa State University) e S. Xiao (Università del Maryland) per i loro generosi consigli e per aver offerto volontariamente i loro protocolli mentre sviluppavamo il protocollo qui descritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Mulino a sfere MM400 | Retsch | 20.745.0001 | O mulino a sfere equivalente |
| 2 mL provette per fresatura a sfere | Sarstedt | 72.694.007 | |
| Sfere di fresatura in acciaio inox da 5/32" | OPS Diagnostics | GBSS 165-5000-01 | |
| Bagno d'acqua della serie 280 controllato da microprocessore Preimpostato su 65 ° C | Thermo Fisher Scientific | 2825 | o bagnomaria equivalente |
| Bagnomaria serie 280 controllato da microprocessore Preimpostato su 37 ° C | Thermo Fisher Scientific | 2825 | O equivalente bagnomaria |
| Eppendorf 5417R microcentrifuga refrigerata | Krakeler Scientific | 38-022621807 | O microcentrifuga equivalente |
| Chlorform: IAA (24:1 v/v) | Sigma-Aldrich | C0549 | Pericoloso in caso di contatto con la pelle o inalazione. Indossare guanti in nitrile, occhiali protettivi, camice da laboratorio e lavorare in cappa chimica |
| Fenolo:Cloroformio:IAA (25:24:1 v/v) | Thermo Fisher Scientific | 15593031 | Pericoloso in caso di contatto con la pelle o inalazione. Indossare guanti in nitrile, occhiali protettivi, camice da laboratorio e lavorare in cappa chimica |
| 100% isopropanolo | Sigma-Aldrich. | ||
| 100% etanolo | Sigma-Aldrich | 34923 | Freddo a -20 ° C uso precedente |
| Acetato di sodio | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Rnasi, senza DNA (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| Metabisolfito di potassio | Sigma-Aldrich | P2522 | |
| Sodio Lauril Sacroinato | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | ||
| Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Bromuro di cetiltrimetilammonio (CTAB) | Sigma-Aldrich | H6269 | |
| Uvex by Honeywell Futura Goggles S345C, Uvextreme | Staples | 423263 | O occhiali equivalenti |
| Guanti in nitrile High Five COBALT, LARGE | Neta Scientific | HFG-N193 | O guanti equivalenti |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10.000x in acqua | Biotium | 41003 | |
| Bromuro di etidio 10 mg/mL | Biotium | 40042 | Pericoloso in caso di contatto con la pelle. Indossare guanti in nitrile e occhiali protettivi |
| Bioreagente ultrapuro di agarosio | VWR International LLC | JT4063 | |
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific FERSM1332 | ||
| 8 - 48 kb CHEF Standard di dimensioni del DNA | Bio-Rad | 170-3707 | |
| Pippin Prep | Life Technologies Corporation | 4472172 | O aparato gel equivalente per campi pulsati |
| Carta da filtro qualitativa Whatman, Grado 1 | Sigma-Aldrich | Camera di | crescita WHA1001042 o equivalente |
| Camera di crescita Percival Percival AR66LXC9 | |||
| Spettrofotometro UV-Vis Nano | Fisher Scientific | ND-8000-GL | O spettrofotometro equivalente |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P11496 | |
| TAE Buffer (Tris-acetato-EDTA) (50x) | Thermo Fisher Scientific | B49 | Diluire 1/50 con acqua prima dell'uso (fino a 1x) |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Tris-Borato-EDTA, 10x Soluzione (Elettroforesi) | Thermo Fisher Scientific BP13334 | Diluire 1/10 con acqua prima dell'uso (fino a 1x) | |
| Azoto | Azoto liquido (-196 ° C) è un pericolo di congelamento. Inoltre, si espande rapidamente dopo il riscaldamento e non deve essere conservato in un contenitore ben chiuso |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
