Utilizzando Recettori pHluorin-tag per il monitoraggio subcellulare localizzazione e il traffico

Ashley M. Fox-Loe; Brandon J. Henderson; Christopher I. Richards

doi:10.3791/55466

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Articolo metodologico

Utilizzando Recettori pHluorin-tag per il monitoraggio subcellulare localizzazione e il traffico

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DOI:

10.3791/55466

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16 marzo 2017

Ashley M. Fox-Loe¹ , Brandon J. Henderson² , Christopher I. Richards¹

¹Department of Chemistry, University of Kentucky, ²Department of Biomedical Sciences, Marshall University

In questo articolo

Sommario

Etichettare il dominio extracellulare di una proteina di membrana con un fluoroforo sensibile pH, superecliptic pHluorin (SEP), permette la localizzazione subcellulare, espressione, e il traffico da determinare. proteine Imaging SEP-etichettato con riflessione interna totale microscopia a fluorescenza (TIRFM) consente la quantificazione dei livelli di proteine nella membrana ER e nel plasma periferico.

Abstract

La comprensione traffico di membrana di proteine, il montaggio, e l'espressione richiede un approccio che distingue tra coloro che risiedono in organelli intracellulari e quelli localizzati sulla membrana plasmatica. misure tradizionali a base di fluorescenza non hanno la capacità di distinguere le proteine di membrana che risiedono in diversi organelli. Taglio metodologie all'avanguardia trascendono i metodi tradizionali di accoppiamento fluorofori pH-sensibile con microscopia a riflessione interna totale in fluorescenza (TIRFM). TIRF illuminazione eccita il campione fino a circa 150 nm dall'interfaccia di vetro-campione, riducendo così bassa, aumentando il rapporto segnale rumore e migliorando risoluzione. Il volume di eccitazione in TIRFM comprende la membrana plasmatica e organelli vicine, come il pronto soccorso periferico. Superecliptic pHluorin (SEP) è una versione sensibile pH di GFP. Geneticamente codifica settembre nel dominio extracellulare di una proteina di membrana di interesse posiziona il fluoroforo sulato luminale del ER e nella regione extracellulare della cella. SEP fluorescente quando il pH è superiore a 6, ma rimane in uno stato off a valori di pH inferiori. Pertanto, i recettori etichettati con settembre fluorescenza quando risiedono nel reticolo endoplasmatico (ER) o dopo l'inserimento nella membrana plasmatica (PM), ma non quando si trova ad una vescicola tratta o altri organelli, come il Golgi. Il pH extracellulare può essere regolata a dettare la fluorescenza dei recettori sulla membrana plasmatica. La differenza di fluorescenza tra le immagini TIRF a pH neutro e extracellulare acido per la stessa cella corrisponde a un numero relativo di recettori presenti sulla membrana plasmatica. Questo permette la misurazione simultanea di recettori intracellulari residenti e membrana plasmatica. eventi di inserimento vescicole singolo può anche essere misurato quando il pH extracellulare è neutro, corrispondente ad un basso vescicole traffico pH fusione con la membrana plasmatica e la transizione in uno stato fluorescente. Questo Versatile tecnica può essere sfruttata per studiare la localizzazione, espressione, e il traffico di proteine di membrana.

Introduzione

Le variazioni di espressione dei recettori, la distribuzione, e l'assemblaggio sono stati collegati a una vasta gamma di malattie, tra cui il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la fibrosi cistica, e la tossicodipendenza ^{^1,} ^{^2,} ^{^3,} ^{^4,} ^5. Ad esempio, la nicotina e altri ligandi nicotinici influenzano il traffico di recettori nicotinici (nAChR) che portano a cambiamenti di traffico, di espressione, e upregulation ^{^1,} ^{^2,}