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Summary

Etichettare il dominio extracellulare di una proteina di membrana con un fluoroforo sensibile pH, superecliptic pHluorin (SEP), permette la localizzazione subcellulare, espressione, e il traffico da determinare. proteine ​​Imaging SEP-etichettato con riflessione interna totale microscopia a fluorescenza (TIRFM) consente la quantificazione dei livelli di proteine ​​nella membrana ER e nel plasma periferico.

Abstract

La comprensione traffico di membrana di proteine, il montaggio, e l'espressione richiede un approccio che distingue tra coloro che risiedono in organelli intracellulari e quelli localizzati sulla membrana plasmatica. misure tradizionali a base di fluorescenza non hanno la capacità di distinguere le proteine ​​di membrana che risiedono in diversi organelli. Taglio metodologie all'avanguardia trascendono i metodi tradizionali di accoppiamento fluorofori pH-sensibile con microscopia a riflessione interna totale in fluorescenza (TIRFM). TIRF illuminazione eccita il campione fino a circa 150 nm dall'interfaccia di vetro-campione, riducendo così bassa, aumentando il rapporto segnale rumore e migliorando risoluzione. Il volume di eccitazione in TIRFM comprende la membrana plasmatica e organelli vicine, come il pronto soccorso periferico. Superecliptic pHluorin (SEP) è una versione sensibile pH di GFP. Geneticamente codifica settembre nel dominio extracellulare di una proteina di membrana di interesse posiziona il fluoroforo sulato luminale del ER e nella regione extracellulare della cella. SEP fluorescente quando il pH è superiore a 6, ma rimane in uno stato off a valori di pH inferiori. Pertanto, i recettori etichettati con settembre fluorescenza quando risiedono nel reticolo endoplasmatico (ER) o dopo l'inserimento nella membrana plasmatica (PM), ma non quando si trova ad una vescicola tratta o altri organelli, come il Golgi. Il pH extracellulare può essere regolata a dettare la fluorescenza dei recettori sulla membrana plasmatica. La differenza di fluorescenza tra le immagini TIRF a pH neutro e extracellulare acido per la stessa cella corrisponde a un numero relativo di recettori presenti sulla membrana plasmatica. Questo permette la misurazione simultanea di recettori intracellulari residenti e membrana plasmatica. eventi di inserimento vescicole singolo può anche essere misurato quando il pH extracellulare è neutro, corrispondente ad un basso vescicole traffico pH fusione con la membrana plasmatica e la transizione in uno stato fluorescente. Questo Versatile tecnica può essere sfruttata per studiare la localizzazione, espressione, e il traffico di proteine ​​di membrana.

Introduction

Le variazioni di espressione dei recettori, la distribuzione, e l'assemblaggio sono stati collegati a una vasta gamma di malattie, tra cui il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la fibrosi cistica, e la tossicodipendenza ^{1, 2, 3, 4, 5.} Ad esempio, la nicotina e altri ligandi nicotinici influenzano il traffico di recettori nicotinici (nAChR) che portano a cambiamenti di traffico, di espressione, e upregulation ^{1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10.} La nicotina aumenta il numero totale di nAChR assemblate all'interno di una cella, aumenta il traffico verso la membrana plasmatica, und altera l'assemblaggio di subunità per favorire una versione ad alta sensibilità di alcuni sottotipi. Risolvere i cambiamenti distinti nel traffico, il montaggio, e l'espressione dei recettori in un modello di malattia fornisce dettagli cruciali meccanicistici che sono essenziali per definire bersagli farmacologici. Un approccio ideale sarebbe rapidamente distinguere tra recettori intracellulari e quelli localizzati sulla membrana plasmatica. Ciò è particolarmente impegnativo nei casi in cui una maggioranza di una particolare proteina intracellulare risiede, come ad esempio con nAChR. Dal momento che la maggior parte dei nAChR sono localizzate al reticolo endoplasmatico, le misure tradizionali non hanno la risoluzione spazio-temporale necessario per individuare la localizzazione e il traffico di modifiche lungo la via secretoria. Traffico di recettore e di espressione studi di nAChR sono stati principalmente condotti utilizzando radioligand vincolanti ^11, saggi biotinylation ^12, western blotting ^13, o immunoprecipitazione techniq UES ^12. Questi dipendono dalla specificità di legame di una molecola giornalista o fissazione di cellule e non hanno la capacità di distinguere tra simultaneamente residente membrana plasmatica e recettori intracellulari. Pertanto, gli studi di dinamica di montaggio canale ionico e vescicole hanno in gran parte affidamento su basso-throughput tecniche elettrofisiologiche ^14.

risoluzione spaziale e temporale superiore è possibile con i progressi nella microscopia a fluorescenza. Molecole giornalista geneticamente codificate, come la proteina fluorescente verde (GFP) e le sue varianti, eliminare i problemi di legame non specifico e aumentano la sensibilità ^15. Una variante sensibile pH di GFP, noto come superecliptic pHluorin (SEP), può essere utilizzata per sfruttare differenze di pH intrinseche tra compartimenti all'interno di una cella per determinare la localizzazione ^{5, 7, 8,}ref "> ^{9, 16, 17, 18.} settembre fluorescente quando il pH è superiore a 6, ma rimane in uno stato off a pH inferiore. Pertanto, i recettori contrassegnate con SEP loro lato luminale vengono rilevati quando presente nel reticolo endoplasmatico ( ER) o dopo l'inserimento nella membrana plasmatica (PM), ma non quando confinato in una vescicola traffico. manipolazione del pH extracellulare in contatto con recettori sulla membrana plasmatica altera conseguentemente la fluorescenza e quindi il rilevamento di questi recettori. Se la stessa cella viene sequenzialmente ripreso sia a pH extracellulare neutro e poi un pH inferiore a 6, la differenza tra le immagini è attribuita a recettori situati sulla membrana plasmatica. Questo consente la misurazione simultanea di intracellulare (ER periferica) e recettori membrana plasmatica residenti ^{5, 7, 8} </su^{p>, 9.} eventi di inserimento vescicole singolo possono essere risolti quando il pH extracellulare è neutrale. Una volta che un basso vescicole traffico pH fonde con la membrana plasmatica, lato luminale della vescicola è esposta alla soluzione extracellulare neutra, causando una transizione rilevata come una raffica di fluorescenza ^{7, 18, 19, 20.} Settembre permette di misurare recettori localizzati alla membrana plasmatica e periferico reticolo endoplasmatico, e fornisce un mezzo per misurare il traffico di recettori tra queste regioni subcellulari ^{5, 7, 18.}

Per ottenere una risoluzione più alta a livello della membrana plasmatica, un recettore con la SEP geneticamente codificato viene ripreso al microscopio a riflessione interna totale fioritura (TIRFM). Questo metodo è particolarmenteutile se la maggior parte dei recettori sono localizzati a regioni intracellulari, poiché TIRFM aumenta la visibilità della membrana plasmatica. TIRFM consente anche la risoluzione della dinamica di traffico dei singoli vescicole che trasportano i recettori SEP-etichettati su inserimento nel PM. Riflessione totale avviene all'interfaccia tra materiali con differenti indici di rifrazione, come tra una cella e un vetro di copertura antiscivolo ^{21, 22.} Settembre fluorescente quando irradiato con 488 nm di eccitazione, che è orientata per ottenere la riflessione interna totale all'interfaccia della soluzione vetro e cellule. Questo produce un'onda evanescente che penetra circa 150 nm nel campione, solo fluorofori emozionanti all'interno di questo volume. Solo Settembre contenente recettori in un ambiente pH neutro in questo intervallo di eccitazione vengono rilevati, corrispondenti a quelli residenti sulla membrana plasmatica o periferica reticolo endoplasmatico. Dal momento che il rilevamento è limitata to di eccitazione dal onda evanescente, fluorescenza di fondo della regione intracellulare è ridotto e il rapporto segnale-rumore viene aumentato ^{21, 22.} Inoltre, poiché la radiazione non penetra la massa della cella, photodamage è minimizzato che permette l'imaging cellulare dal vivo nel corso del tempo. Come risultato, TIRFM accoppiato con geneticamente codificato settembre fornisce l'alta risoluzione e la sensibilità richiesta per misurare subcellulari localizzazione e traffico dinamiche di recettori di membrana lungo la via secretoria.

Protocol

1. Colture cellulari e trasfezione Mantenere il mouse neuroblastoma 2 bis (N2a), le cellule in terreni di coltura. Fare 500 ml N2a terreni di coltura da 200 ml di mezzo Aquila Dulbecco (DMEM) con alto glucosio, 250 ml ridotti mezzi siero, 50 ml di siero fetale bovino (FBS), e 5 ml di penicillina / streptomicina (100x). Mantenere le cellule in un pallone T75 a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. Dividi celle 1:15 quando necessario, o circa il 80-90% di confluenza. Questo è tipicamente 2-3 volte a settimana. Coat 35 millimetri di vetro piatto fondo con poli-D-lisina. In un armadio biosicurezza flusso laminare, aggiungere 200 ml di 0,1 mg / ml di poli-D-lisina su vetro regione inferiore sterile piastra da 35 mm. Mettere in un piatto di 37 ° C incubatore per 1 ora. Lavare accuratamente piatto con DDH 2 O 3-4 volte. Lasciare piatti a completamente a secco per più di 1 ora. Sterilize piatti che utilizzano la luce UV nell'armadio biosicurezza, se necessario. Piastra cellule N2a per l'imaging TIRFM. Rimuovere i supporti crescita da cellule aderenti. Staccare cellule dal matraccio incubando con 1 ml 1x tripsina (+ EDTA) per 5 min a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. Inattivare tripsina con l'aggiunta di 9 ml di terreni di crescita. Media mix, tripsina, e le cellule distaccate con una pipetta. Visivamente contare cellule utilizzando un emocitometro e calcolare il volume corretto per aggiungere 90.000 cellule per ogni vetro rivestito piatto fondo poli-D-lisina. Questa densità è necessario per trasfezione efficiente e di imaging singola TIRF cellulare. Aggiungere 2 ml di terreni di crescita per ogni piatto fondo di vetro contenente 90.000 cellule. Incubare il piatto a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% per 16-24 ore. N2a trasfezione Ottenere un costrutto plasmide contenente un fluoroforo settembre incorporatonella regione extracellulare della proteina di interesse. Tecniche di clonazione standard come amplificazione PCR 5 possono essere usate per generare il costrutto. NOTA: Sep dovrebbe essere incorporato nella regione extracellulare della proteina di membrana in modo che risiede all'interno del lume del reticolo endoplasmatico o traffico vescicole ed è esposto a soluzione extracellulare quando sulla membrana plasmatica. Settembre è simile per dimensioni a GFP e strategie di clonaggio simili possono essere utilizzati. Sostituire i mezzi di crescita su cellule placcato con 1,5 ml ridotta supporti siero (es Opti-MEM), circa 30 minuti prima dell'aggiunta del reagente di trasfezione. NOTA: al farmaco in studio indotto cambiamenti nella recettori, un'adeguata concentrazione di farmaco può essere aggiunto al momento della trasfezione. Aggiungere 500 ng di ogni plasmide desiderato costruire a 250 microlitri ridotto supporto siero (tubo 1). Aggiungere 2 ml di reagente di trasfezione ad un tubo separato containing 250 ml di mezzi siero ridotto. Incubare tubo 2 a temperatura ambiente per 5 min. Il rapporto di reagente di trasfezione di DNA plasmidico deve essere ottimizzata per esprimere ciascuna proteina di interesse. Combinare provette 1 e 2 per ottenere una soluzione contenente 500 ml di trasfezione reagente e mix plasmide. Incubare a temperatura ambiente per 25 min. Aggiungere i 500 microlitri miscela trasfezione le cellule pre-plated per un volume totale di 2 ml per piatto. Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% per 24 ore. Dopo 24 ore, rimuovere il mix trasfezione e lavare le cellule con mezzi di crescita e quindi aggiungere 2 ml di terreni di crescita per ogni piatto. NOTA: Se un farmaco è stato aggiunto al momento della transfezione, esso può essere riempito di nuovo in questa fase. Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% per 24 ore. celle di immagine 48 ore dopo la trasfezione. 2. Imaging cellulare dal vivo da Total InTernal Riflessione microscopia a fluorescenza (TIRFM) Imaging istituito Eseguire l'imaging con un microscopio a fluorescenza set-up invertito con una fase di scansione, come mostrato in Figura 1. Ciò richiede l'allineamento di una sorgente laser DPSS 488 nm, un motore passo-passo per regolare 488 la posizione del fascio nm, e un'alta apertura numerica (NA 1.49) 60X o 100X obiettivo ad immersione. Far passare il raggio laser attraverso il filtro di eccitazione appropriata (banda passante 488/10 nm). Allineare il fascio laser polarizzato attraverso una singola fibra modalità collegata ad un lanciatore montato un motore passo-passo. In modalità epifluorescenza, il fascio di eccitazione è centrato nel mezzo dell'apertura posteriore dell'obiettivo. Per raggiungere TIRF, utilizzare il motore passo-passo per tradurre il fascio laser focalizzato attraverso l'apertura posteriore della lente obiettivo fino a raggiungere l'angolo critico e del fascio non viene trasmessa attraverso il campione e viene invece totalmente riflessa vetro-cell interfaccia. Catturare immagini utilizzando un EMCCD (512 x 512 pixel), controllata con software di imaging (ad es Metamorph) con il filtro di emissione appropriata montati nel percorso di emissione (525/50 nm). Preparare la soluzione di imaging Preparare 200 ml di soluzione extracellulare (ECS) mescolando 150 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 10 mM HEPES e 10 mM di glucosio in DDH 2 O. soluzioni fotografici di NaCl, KCl, MgCl 2, e CaCl 2 può essere preparato in anticipo e combinato con HEPES freschi e glucosio nel giorno di imaging. Regolare il pH di una soluzione contenente 100 ml ECS a pH 7,4. Regolare le restanti 100 ml di ECS ad un pH di 5,4. Lavare le cellule trasfettate con 2 ml di ECS (pH 7,4). Aggiungere 2 ml di ECS (pH 7.4) alle cellule trasfettate prima di imaging. L'imaging cellulare Live in TIRF Accendere l'intero sistema, sapg 488 nm laser, macchina fotografica, fase di traduzione, e il programma di imaging. Mettere a fuoco il fascio epifluorescenza e regolare la potenza di circa 1 MW presso l'obiettivo 60X. Aggiungere l'olio con l'obiettivo e mettere un piatto di cellule trasfettate sulla fase di traduzione. Fissare il piatto in posizione con supporti di scena per assicurarsi che non si muove rispetto alla fase in modo che le cellule possono essere ripreso più volte. In modalità epifluorescenza, mettere a fuoco il microscopio e individuare le fluorescenti, cellule transfettate. Le cellule rimangono concentrati in diversi piani di messa a fuoco. Individuare singole cellule isolate, per procedere con TIRF. Nel programma di imaging, impostare il tempo di esposizione a 200 msec e ottimizzare l'intensità di fluorescenza impostando il guadagno EM. Transizione il fascio laser in TIRF traducendo il fascio attraverso l'obiettivo in modo graduale utilizzando il motore passo-passo. All'avvicinarsi angolo critico, il fascio visibilmente tradurre attraverso il bordo del piatto fino converge a The punto di riflessione interna totale sul piano del campione. Verificare che le cellule sono in modalità TIRF regolando la manopola di messa a fuoco. In TIRF, solo piano di cellule può essere focalizzata (cioè circa 150 nm dall'interfaccia vetro), producendo un'immagine molto definita con alta risoluzione della membrana plasmatica. Imaging settembre per determinare la localizzazione subcellulare Individuare sani, trasfettate, singole cellule nel piano di imaging. Acquisire una immagine focalizzata di cella a pH 7,4. Settembre etichettato recettori sulla membrana plasmatica e reticolo endoplasmatico dovrebbe essere visibile. bloccare rapidamente il fascio laser di raggiungere il campione per evitare photobleaching. Memorizzare le posizioni di scena corrispondenti a ciascuna cella utilizzando software di imaging microscopio in grado di registrare più posizioni xy. Ripetere i passaggi 2.4.1-2.4.4 per 20-30 cellule per piatto, mentre utilizzando il software per registrare la posizione di ogni cella. After tutte le immagini delle cellule a pH 7.4 sono raccolti, rimuovere manualmente la soluzione a pH 7.4 ECS con una pipetta. Non toccare il piatto come questo potrebbe spostare le posizioni di scena memorizzati. Aggiungere con cautela 2 ml di pH 5.4 ECS al piatto e attendere 10 min. Durante questo tempo, salvo immagini precedentemente acquisite. Sotto la serie identiche di condizioni utilizzate per raccogliere immagini a pH 7.4, spostare il palco per ciascuna posizione salvata e acquisire un'immagine della stessa cella a pH 5.4. Le cellule dovrebbero guardare meno definiti dal momento che tutti fluorescenza rilevata è originario dal reticolo endoplasmatico confinato settembre etichettato recettori. Salvare le immagini delle cellule pH 5.4. Imaging singoli eventi di inserimento delle vescicole in cellule vive Sostituire mezzi di crescita delle cellule trasfettate con 2 ml pH 7,4 ECS, o con Leibovitz L-15 media. Il pH del Leibovitz L-15 media è CO 2 indipendenti, permettendo di imaging avvenire per un lungo periodo di tempo se necessario. Placvia e il piatto di cellule transfettate sul palco del microscopio. Fissare e mettere a fuoco una singola cella in TIRF seguente precedente punto 2.3. Se presente, impostare la messa a fuoco automatica in modo che la messa a fuoco non deriva durante il periodo di imaging. Registrare una serie di 1.000 fotogrammi, catturando continuamente le immagini ad un frame rate di 200 msec. Sequenze di fluorescenza saranno visibili in questo periodo, corrispondente a vescicole basso traffico pH fondersi con la membrana plasmatica, esponendo SEP al pH extracellulare 7.4. Individuare un'altra singola cellula e ripetere il passo precedente. Ripristinare autofocus, se necessario. 3. Immagine analisi ed elaborazione dei dati Analizzando settembre fluorescenza per determinare localizzazione subcellulare Aprire le immagini delle celle utilizzando un software di analisi delle immagini, come Metamorph o ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). Sottrarre il fondo sia dal pH 5,4 e pH 7,4 immagini utilizzando l'impostazione rotolamento della sfera. Utilizzare una soglia basato intensità di quantificare la fluorescenza da una singola cellula. selezionare manualmente una regione di interesse attorno alla cella nell'immagine del pH 7,4. Misurare l'area delle cellule, intensità media, e la densità integrata utilizzando un plugin di ImageJ o utilizzando la funzione integrata "Misura" nella scheda Analizza. Ripetere passaggi 3.1.1-3.1.3 per la stessa cella a pH 5,4, adeguando la soglia basato intensità e regione di interesse nello stesso modo. Dopo la densità integrato è ottenuto per immagini cellulari sia a pH 7.4 e 5.4, calcolare la membrana plasmatica densità integrato sottraendo il valore pH 5.4 dal 7.4 pH. La differenza corrisponde ai recettori numero relativo sulla membrana plasmatica all'interno della regione TIRF eccitazione. Come misura di traffico, calcolare la percentuale relativa di settembre etichettato recettori situati sulla membrana plasmatica rispetto ai restanti recettori visibili nelle excitati TIRFsul volume dividendo la membrana plasmatica della densità integrata dalla densità totale integrato a pH 7.4, moltiplicato per 100. Analizzando gli eventi di inserimento singolo vescicole Aprire la serie di 1.000 immagini TIFF utilizzando il software di analisi delle immagini. Sottrarre il fondo da tutti i fotogrammi con l'impostazione rotolamento della sfera. Regolare il bilanciamento del colore della registrazione per massimizzare le regioni intensi corrispondenti alle vescicole eventi di inserimento. contare manualmente le raffiche di fluorescenza che durano più di 3 fotogrammi (> 600 msec).

Representative Results

Settembre incorporazione in un recettore consente la rilevazione diretta di tale recettore in una cellula vivo. Accoppiato con TIRFM, questo permette la valutazione dei livelli di espressione relativi sulla membrana plasmatica e la distribuzione dei recettori all'interno delle sedi subcellulari nella regione di TIRF eccitazione. singoli eventi di traffico delle vescicole possono essere risolti. Livelli di espressione relativa…

Discussion

La sensibilità pH SEP consente recettori residenti sulla membrana plasmatica di distinguerli dai recettori intracellulari nel reticolo endoplasmatico, e può essere utilizzato per risolvere gli eventi di inserimento del recettore porta-vescicole ^{5, 7, 8, 9, 18, 19, 20} . Diverse tecniche tr…

Materials

Reagent/Material
Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm^2	VWR	82050-856
35 mm glass bottom petri dishes, sterile	Cell E&G	GBD00002-200
Poly-D-lysine	vwr	215017510
Dulbecco Modified Eagle Medium‎ (DMEM), High Glucose	Fisher Scientific	11-965-084
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco / Fisher Scientific	31-985-088
Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered)	Gibco / Fisher Scientific	16-000-044
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Fisher Scientific	12604-021
Penicillin-Streptomycin Solution	VWR	45000-652
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	Gibco / Fisher Scientific	21083027	Optional
Lipofectamine	Fisher Scientific	11668030	Gently mix; Do not vortex
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Potassium chloride	Fisher Scientific	P217-10
Magnesium chloride	Fisher Scientific	BP214-500
Calcium chloride	Fisher Scientific	C79-500
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
D-Glucose	Fisher Scientific	D16-1
Objective immersion oil	Olympus	Type F
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Microscope	Olympus	IX81
Camera	Andor	iXon Ultra 897
60x, 1.49 NA oil immersion objective	Olympus	APON 60XOTIRF
Motorized stage	Prior	IXPROXY
Motorized actuator (stepper motor)	Thorlabs	ZST213
MetaMorph (or other imaging program)	Metamorph
488 nm laser	Market Tech
Single mode fiber	Thorlabs	SM450
Mirrors	Thorlabs	BB1-E01
Dichroic 488 nm LP	Semrock	Di02-R488-25×36
Bandpass filter, 488 nm	Semrock	LL01-488-12.5
Bandpass filter, 525/50	Semrock	FF03-525/50-25