Articolo metodologico

Quantificazione delle endosomi e dei motivi di lisosomi nei neuroni coltivati ​​utilizzando sonde fluorescenti

DOI:

10.3791/55488

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22 maggio 2017

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1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2PhD Program in Human Biology, School of Integrative and Global Majors, University of Tsukuba, 3Life Science Center of Tsukuba Advanced Research Alliance (TARA), University of Tsukuba

In questo articolo

Sommario

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L'indagine sul traffico di membrana è fondamentale per la comprensione delle funzioni neuronali. Qui introduciamo un metodo per quantificare la motilità della vescicola nei neuroni. Questo è un metodo conveniente che può essere adattato alla quantificazione del traffico di membrana nel sistema nervoso.

Abstract

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Nel cervello, i sistemi di traffico di membrana svolgono un ruolo importante nella regolazione delle funzioni neuronali, come la morfologia neuronale, la plasticità sinaptica, la sopravvivenza e le comunicazioni gliali. Ad oggi, numerosi studi hanno riportato che i difetti di questi sistemi causano varie malattie neuronali. Quindi, la comprensione dei meccanismi sottostanti alla dinamica delle vescicole può fornire indizi influenti che potrebbero aiutare nel trattamento di diversi disturbi neuronali. Qui descriviamo un metodo per quantificare le motilità delle vescicole, come la distanza della motilità e il tasso di movimento, utilizzando un plug-in software per la piattaforma ImageJ. Per ottenere immagini per la quantificazione, abbiamo etichettato strutture endosomi-lisosomi neuronali con proteine ​​del marker di vescicola tagged EGFP e osservato il movimento delle vescicole usando una microscopia a tempo trascorso. Questo metodo è estremamente utile e semplifica la misurazione della motilità della vescicola nei neuriti, come assoni e dendriti, così come nel soma di entrambi i neuroni e le cellule gliali. FurthermoQuesto metodo può essere applicato ad altre linee cellulari, come i fibroblasti e le cellule endoteliali. Questo approccio potrebbe fornire un prezioso avanzamento della nostra comprensione del traffico di membrana.

Introduzione

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Il controllo preciso del traffico endosomi-lisosomi è indispensabile per la regolazione della funzione neuronale. In particolare, i movimenti dinamici di queste vescicole sono un fattore chiave alla base della regolazione morfologica, dello sviluppo e della sopravvivenza neuronale. I difetti in questo sistema causano gravi disordini neuronali 1 , 2 . I meccanismi molecolari che collegano il traffico di vescicole alle malattie neuronali sono considerate complicate e diversi gruppi hanno cercato di esaminare questa rilevanza. Ad esempio, è stato riportato che la motilità endoteliale tardiva perturbed è signific....

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Protocollo

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Tutte le procedure animali sono state eseguite con l'approvazione dell'Università di Tsukuba Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Dissezione

  1. Per preparare il giorno embrionale 13-14 ICR o C57BL / 6 feti, eutanizzare i topi incinte con dislocazione cervicale. Rimuovere l'utero e metterlo in un piatto di Petri con Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Sciacquarlo bene per rimuovere il sangue.
  2. Usando le pinze, trasferire l'utero in un nuovo piatto di petri con 70% di etanolo per sterilizzare.
  3. Trasferire l'utero in un nuovo piatto di Petri con HBSS. Rimuovere i feti dall'utero us....

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Risultati

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Questo test è stato progettato per misurare la dinamica delle vescicole nella coltura in vitro . Questo saggio è stato utilizzato per determinare la motilità vescicola associata alla morfologia neuronale e alla sopravvivenza. Figura 1A e B mostrano dati rappresentativi che mostrano la motilità dei lisosomi nei neuroni. I neuroni corticali sono stati trasfettati con il marker lizosomico, LAMP-EGFP, e osservati utilizzando un microscopio standard .......

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Discussione

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Questo protocollo introduce la procedura per quantificare la motilità della vescicola. Nei neuroni primari, endosomi e lisosomi tendono a mostrare un'elevata motilità nei neuroni più giovani (4-6 DIV). Dato che i neuroni devono fornire alcuni componenti ai bordi principali per allungare i processi neurali, il traffico di membrana dovrebbe verificarsi dinamicamente durante questa fase. Quindi, è importante utilizzare i neuroni più giovani per osservare la motilità dinamica nei dendriti neuronali. Inoltre, le vescicol.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno niente da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo il dottor Ricardo Dolmetsch (Stanford University School of Medicine, presente affiliazione: Istituti Novartis per la Ricerca Biomedica) per contribuire a sviluppare questa analisi e il dottor Matthew Wood, Takuma Aihara e Dongsook Kim per la loro lettura critica del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Terreno neurobasaleThermo Fisher21103-049
Terreno dell'aquila modificato di Dulbecco (DMEM)Wako044-29765
Opti-MEMThermo Fisher31985070Terreno privo di siero
Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)Thermo Fisher14170112
Penicilina StreptmicinaThermo Fisher15140122
Integratori L-GlutamminaThermo Fisher25030081
B-27Thermo Fisher17504044
2,5% TripsinaThermo Fisher15090046
Poli-D-Lisina bromidrato (PDL)SigmaP7280
Poli-L-Ornitina (PLO)SigmaP4957
Filtrocellulare in nylonCorning431750
Lipofectamine 2000Thermo Fisher11668027Reagente di trasfezione
Polietilenimmina "Max" (PEI)polysciences24765Reagente di trasfezione. In alternativa alla Lipofectamin2000, è disponibile 0,1 mg/mL di polietilenimmina disciolta in acqua sterilizzata. Ma è a bassa efficienza e ad alta tossicità.
BIOREVO BZ-9000KeyenceNA
Sistema di incubazione INUG2-K13Tokay HitNA
GraphPad Prism versione 6.0GraphPad SoftwareNA
Excel versione 15MicrosoftNA
ImageJ versione 1.47NANA

Riferimenti

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  1. Nicot, A. S., Laporte, J. Endosomal phosphoinositides and human diseases. Traffic. 9 (8), 1240-1249 (2008).
  2. De Matteis, M. A., Luini, A. Mendelian disorders of membrane trafficking. N Engl J Med. 365 (10), 927-938 (2011).
  3. Lebrand, C.

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