Articolo metodologico

Batteria di comportamentali test valutazione generale locomozione, forza muscolare e coordinazione in topi

DOI:

10.3791/55491

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23 gennaio 2018

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Neuroscience Studies, Queen's University, 2Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, 3Medical Genetics/ Department of Pediatrics, Kingston General Hospital, Centre for Neuroscience Studies, and Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test comportamentali è utilizzato in studi pre-clinici per valutare gli effetti fenotipici di una malattia o un trattamento benessere di un animale. Al fine di valutare globalmente funzionamento del motore, abbiamo selezionato le prove per la locomozione generale, forza muscolare e di coordinazione: campo aperto-test, il test di rete e il rotarod test, rispettivamente.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test comportamentali è utilizzato in studi pre-clinici per valutare gli effetti fenotipici ed esiti che dispone di una particolare malattia o un trattamento benessere e la salute dell'animale. Ci sono numerosi test comportamentali che possono essere applicate. Abbiamo selezionato un test per la locomozione generale, campo aperto test (OFT); un test per la forza muscolare, la mesh testare (MT); e un test per il coordinamento, il rotarod test (RR). Test può essere realizzato su base settimanale o mensile. Come un test per la locomozione generale, l'OFT opere oggettivamente monitoraggio parametri di movimento mentre il mouse è in un'apparecchiatura di campo aperto. Il campo è in genere una finestra di 2' x 2', e i movimenti vengono registrati tramite telerilevamento laser o tramite acquisizione video. Il mouse è posizionato al centro del campo aperto e può spostarsi liberamente per il test. La MT utilizza la latenza per un mouse per cadere uno schermo invertito come una misura della forza muscolare. Un mouse è posizionato su uno schermo, che è invertito sopra una scatola trasparente ed è cronometrato per loro latenza a cadere. Vengono eseguite tre prove, con il meglio delle tre prove ha segnate per quel giorno. Un punteggio di 60 s è il tempo massimo è rimasto un mouse invertito. I topi sono dati un periodo di riposo di 5 minuti tra tentativi di prova di mesh. Infine, un protocollo accelerato sulla RR valuta resistenza e coordinazione motoria. Durante un periodo di prova, un mouse cammina su una canna rotante in quanto aumenta in velocità da 4 giri/min a 40 giri al minuto oltre 5 min. La prova termina quando il mouse tocca il sensore di pressione magnetizzata al momento di cadere. Ogni mouse subisce tre prove, e la prova migliore è segnata per quel giorno. Questo dati comportamentali combinati consentono la valutazione globale della mobilità, coordinazione, forza e movimento degli animali da esperimento. Almeno due delle tre misure di test comportamentali deve mostrare miglioramento per un animale a qualificarsi come avendo complessiva migliorata funzione motoria.

Introduzione

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L'obiettivo dei test comportamentali è misurare la caratterizzazione fenotipica, sia in studi per un nuovo modello murino di malattie che colpiscono il sistema nervoso centrale o per una versione di prova di un nuovo trattamento. Ci sono una varietà di test comportamentali da scegliere. La spiegazione razionale per l'utilizzo di una combinazione di test comportamentali è spesso completamente per valutare i risultati di trattamento pre-clinico. La batteria di test comportamentali nel presente documento comprende la prova di campo aperto (OFT), la prova della maglia (MT) e il rotarod test (RR).

L'OFT è usato come una misura di attività locomotrice generale1,2,3,4,5,6,7. Questa valutazione permette il mouse per muoversi liberamente in un campo aperto, e le misurazioni effettuate sono i movimenti del mouse nel corso della prova del comportamento. Le analisi quantitative effettuate con un OFT comprendono allevamento, lunghezza percorsa, tempo trascorso movimento (ad es., camminare e correre) ed i cambiamenti in attività nel corso del tempo (ad es., salto e più lento/iperattivo movimenti), motivo per cui è utile e analisi approfondita del comportamento del roditore.

La MT è utilizzato per valutare la forza dei topi1,2,8,9,10,11. L'uso di tutte e quattro le membra per appendere fuori di una rete di griglia metallica consente la misurazione non invasiva della capacità dei topi per mostrare tensione sostenuta arto mentre opporre gli effetti della gravità. Questa valutazione avviene posizionando un cursore del mouse su una maglia invertita e temporizzazione sua latenza a cadere. Questo test valuta la forza muscolare del mouse misurando quanto tempo può contenere se stesso sullo schermo invertito prima di cadere.

Il RR valuta il coordinamento del mouse mentre si utilizza l'accelerante protocollo1,2,7,8,9,12,13. L'apparato di rotarod è costituito da una trave cilindrica che ruota in aria a partire da 4 giri/min. Il mouse può imparare questa abilità di coordinazione motoria e quindi è sfidato da un aumento lento, incrementale fino a 40 giri/min. Classicamente, il protocollo di velocità costante è una misura della forza muscolare, mentre il protocollo di accelerazione per il RR valuta la coordinazione, la resistenza e la forza muscolare1,2,7, 14.

I vantaggi di queste tre prove comportamentali sono che che sono ampiamente accettate in tutto il roditore comportamentale prova comunità2,7,8,9e quando presi non solo come la somma del prove individuali, ma collettivamente, può essere utilizzato come una valutazione globale del comportamento fenotipico quando indagare i diversi risultati di trattamenti sperimentali. L'OFT è uno dei test solo per attività locomotrice nel complesso2. La RR è anche uno dei pochi modi per valutare coordinamento2, diversi da quelli per l'utilizzo di software di analisi di andatura, che non verrà discusso qui. Ci sono alcuni modi in cui può essere valutata la forza muscolare di un mouse; Tuttavia, utilizzando la MT, o un filo pendere test, è stato utilizzato prevalentemente nella letteratura ed è accettata come un metodo affidabile per testare la forza muscolare2,8,9,10, 11. molte altre tecniche per la misurazione di locomozione generali e il coordinamento sono estremamente che richiede tempo e non può produrre dati affidabili (ad es., tempi manualmente il movimento del mouse o manualmente pittura zampe per analisi del passo). I sistemi automatici per l'OFT e la RR aumentano l'affidabilità e la validità dei dati prodotti e risparmiare tempo e fatica.

Ad esempio, dato il neurodegeneration del modello del topo malattia di Sandhoff, durante l'esecuzione di questa batteria di test, l'OFT sarebbe il primo di questi test utilizzati per valutare le anomalie del motore che sono di solito visto in questo modello di topo a partire dai 3 mesi di età. I deficit nella coordinazione motoria dovrebbero anche diventare apparente inizio a 12 settimane di età. Deficit di forza muscolare dovrebbe iniziare circa 14 settimane di età, ma in definitiva diventano molto più significativi di 16 settimane.

Questi test sono utili quando lo studio delle malattie che causano danni significativi di motori, compreso di malattie neurodegenerative9 come Sandhoff malattia1,8,13, morbo di Parkinson7, Malattia di Huntington, sclerosi multipla. Il test può essere utilizzato anche per studiare l'invecchiamento e a formulare valutazioni comparative geriatriche o misure di salute. Disturbi della deambulazione e cambiamenti nella locomozione e l'equilibrio sono visti in molti di questi stati di malattia. Tuttavia, l'utilità di questi test non è limitata alle malattie con sintomi neuromuscolari prevalenti.

Siete pregati di notare che non ci sono stati nessun variabili di confusione notate per quanto riguarda la motivazione o la novità di una delle misure di test comportamentali descritte. È indispensabile per determinati stati di malattia e patologie che i ricercatori acquisiscano dati comportamentali preliminari prima il mouse presenta sintomi fenotipici; il ricercatore deve quindi periodicamente (ogni settimana) garantire che tutte le motorie sono contabilizzate. Molte malattie hanno una rapida insorgenza dei sintomi fenotipici e senza test settimanali, questi sintomi non sarebbero essere contabilizzati.

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Protocollo

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Tutti i protocolli qui descritti sono stati eseguiti in conformità con e sono stati approvati dalla, Comitato di cura della Regina Università degli animali. La frequenza del controllo comportamentale può essere settimanale o mensile o una combinazione dei due (cioè, mensili e settimanali quando uno si aspetta di vedere la più grande differenza altrove).

Nota: Murini studi comportamentali sono in gran parte sesso/età/ceppo-dipendente, e pertanto è essenziale per raccogliere i punti di tempo proprio e rimanere coerenti attraverso gruppi sperimentali. Fattori ambientali (ad es., profumi, rumore, temperatura, umidità illuminazione, ecc.) notevolmente influenzano il comportamento e l'ansia nei topi. Provare a ridurre questi fattori ambientali per quanto possibili.

1. aperto campo prova

Nota: Prima del test comportamentali, gli animali dovrebbero essere abituata alla camera dove il test si svolgerà per 10-15 min prima dell'inizio della prova. Accertarsi che dispositivi di protezione personale e tutte le attrezzature locali vengono seguite linee guida per i protocolli dei test comportamentali.

Nota: Nessun addestramento prima della prova.

  1. Assicurarsi che il computer e il programma OFT sono, in esecuzione e correttamente connesso alla fotocamera o casella campo aperto. Fare clic sul programma smartware, l'icona di campo aperto e "OK". Ha scelto la fonte di "convertitore analogico digitale" tra le opzioni della fotocamera. Fare clic su "rilevamento" e assicurarsi che lo spazio intero campo è visualizzato e che le dimensioni sono 30 x 30 cm.
    Nota: Attrezzatura layout possono variare a seconda dei vincoli di spazio, ma assicurarsi che il computer e il campo aperto apparato è vicino a vicenda in una stanza ben illuminata per la cattura video corretto.
  2. Fare clic su "taratura" "istantanea" e poi "OK" per assicurarsi che il mouse viene rilevato all'interno dei confini del campo aperto. Fare clic su "tempo" per pre-impostare una quantità di tempo per testare i topi; in questo caso, impostare 5 min.
  3. Immettere gli argomenti facendo clic sull'icona di "soggetti". Fare clic su "utilità di pianificazione" ed evidenziare tutti i test per soggetto e quindi fare clic sulla doppia freccia verde e "fase uno, sessione uno;" questo porterà in tutti i soggetti al fine di iniziare a raccogliere dati.
  4. Posizionare il mouse al centro del campo aperto e clicca sull'icona "start" per richiedere il programma per iniziare la registrazione. Testare un solo mouse alla volta.
  5. Una volta completato 5 min, il programma passa automaticamente al prossimo argomento. In questo caso, rimuovere il mouse che ha completato il test e inserire il prossimo soggetto in campo aperto. Cliccare su "start".
  6. Pulire l'apparecchio. Ripetere i passaggi da 1.3-1.4 per i restanti soggetti.
  7. Al fine di analizzare i dati una volta che tutti i soggetti sono passati attraverso test, fare clic sull'icona "analizzare" nella parte superiore destra dello schermo. Fare clic su "analizzare" nuovamente e quindi "relazione di sintesi". Facoltativamente, esportare i dati su una chiavetta USB.

2. maglia Test

Nota: La superficie e le dimensioni della mesh a MT possono influenzare le prestazioni. A MT, se un mouse cade entro i primi 10 s durante il periodo di raccolta primi 2 punti, sarà rimesso sulla mesh immediatamente per un secondo tentativo. La mesh utilizzata nel presente documento era una rete metallica, con i fori della maglia circa 1,5 mm di diametro.

Nota: Eseguire questi test allo stesso tempo del giorno è consigliato, poiché i parametri fisiologici e biochimici fluttuano durante tutta la giornata. Peso corporeo può influenzare le prestazioni in questo test e pertanto deve essere preso in considerazione.

  1. Posizionare un mouse al centro di una mesh e invertire la maglia almeno 20 cm sopra un contenitore trasparente. Una volta invertito, avviare il timer.
  2. Tempo e registrare il tempo di latenza a cadere. Se il mouse non rientra entro 60 s, dargli un punteggio di 60 s e condotta no ulteriori test. Consentire il mouse a riposare per almeno 5 min. Questa è la fine della prova 1.
  3. Pulire giù l'attrezzatura e durante l'intervallo Inter-prova 5-min, prova un secondo mouse, se necessario. Ripetere i passaggi da 2.1-2.2 per le prove 2 e 3, se necessario (fino a quando il mouse non segna 60 s, dovrebbero essere sottoposti a tre prove).

3. Rotarod Test

Nota: La superficie e il diametro dello stelo su RT possono influenzare le prestazioni. Su RT, se un mouse cade entro i primi 10 s durante i primi punti di tempo 2 collezione, metterlo sulla barra immediatamente per un secondo tentativo.

Nota: Eseguire questi test allo stesso tempo del giorno è consigliato, poiché i parametri fisiologici e biochimici fluttuano durante tutta la giornata. Peso corporeo può influenzare le prestazioni in questo test e pertanto deve essere preso in considerazione.

  1. Accendere l'IITC rotarod e il computer. Garantire che essi siano collegati correttamente per la registrazione di dati.
  2. Assicurarsi che il programma è in esecuzione il protocollo accelerato. Impostare la lunghezza desiderata del rotarod test su xxx (l'intervallo valido è 000 e 999); in questo caso, premere 300 *. Impostare il numero di corsie da utilizzarsi per xxx (l'intervallo valido è 001 attraverso 005); in questo caso, premere 005 *. Impostare la velocità di partenza di xxx rpm (immettere 3005 per 5 giri/min; l'intervallo valido è 001 attraverso 045); in questo caso, premere 004 *.
  3. Impostare la velocità massima a xxx rpm (immettere 4.030 per 30 rpm; l'intervallo valido è 001 attraverso 045); in questo caso, premere 040 *. Impostare la velocità di rampa a xxx in s (invio 5.030 per una rampa di 30 s per velocità massima; l'intervallo valido è 000 e 999); in questo caso premere 300 *. Impostare l'unità su modalità mouse (immettere 6001 per mouse avanti e 6002 per mouse inverso); in questo caso, premere 6001 *.
  4. Garantire che tutte le corsie magnetizzate sono bilanciate prima di iniziare la prova. Posizionare un mouse in ogni corsia del rotarod.
  5. Premere start per avviare il programma. Mentre i topi cadono, rimuoverli dal loro corsie prontamente per garantire che essi non "inciampare" le altre corsie.
  6. Consentire i topi a riposare per un intervallo Inter-trial di 10 min. Questa è la fine della prova 1. Durante l'intervallo Inter-trial, pulire l'apparecchiatura e inizia la prova per la prossima serie di topi.
  7. Ripetere i passaggi 4-6 come necessario. Se un mouse rimane sul rotarod per la versione di prova completa 5-min, ulteriori prove non sono necessarie per quel mouse.

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Risultati

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Gli animali di studio possono subire il paradigma comportamentale prova settimanale o mensile per ospitare i punti di tempo necessario richiesti per l'analisi. Vedere la Figura 1 per esempi sui tempi di test comportamentali. Nei dati rappresentativi qui sotto, preso da Osmon ha et al. (2016), i topi hanno subito la batteria di test comportamentali mensile, cominciando a 12 settimane di età, fino al loro endpoint umano circa 40 settimane di età. I tempi di test co...

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Discussione

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Per tutti i test, pulire e disinfettare la superficie per ridurre al minimo i contagi e distrattori ai topi. Inoltre, essere certi che i topi sono dato sufficienti periodi di riposo tra una prova e tra comportamentale prove quando si utilizza l'OFT, RR e Mt.

Nell'OFT, è fondamentale che ogni mouse è posizionato al centro di campo aperto e che il programma viene avviato al momento del rilascio del mouse verso il centro. Essere sicuri che non ci sono nessun movimenti della mano che i sensori pos...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vorremmo ringraziare la nuova speranza Resarch Fondazione per il finanziamento della nostra ricerca e il loro continuo supporto. Vorremmo anche ringraziare IITC parziale sostegno finanziario per questo lavoro.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
IITC Life Sciences Rotarod con software di calcolo Serie 8IITC Life Sciences755
Quadrato Campo Aperto 45 x 45 x 40 cm (colore grigio). Altri colori del pavimento disponibili: bianco, nero.Harvard Aparatus (PanLab)760190
  Modulo preconfigurato in campo apertoHarvard Aparatus (PanLab)760688
Piattaforma software Smart V3.0Harvard Aparatus (PanLab)760681
Convertitore video (analogico/digitale)Harvard Aparatus (PanLab)760262
Sistema di fissaggio del tetto per telecameraHarvard Aparatus (PanLab)760277
Fotocamera e obiettivo analogico SonyNTSCHarvard Aparatus (PanLab)760505

Riferimenti

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  1. Osmon, K. J., et al. Systemic Gene Transfer of a Hexosaminidase Variant Using an scAAV9.47 Vector Corrects GM2 Gangliosidosis in Sandhoff Mice. Human Gene Therapy. 27 (7), 497-508 (2016).
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