Microscopia a forza atomica Ricerche del riconoscimento delle lesioni del DNA nella riparazione di excisione dei nucleotidi

Jonas Gross; Nicolas Wirth; Ingrid Tessmer

doi:10.3791/55501

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Articolo metodologico

Microscopia a forza atomica Ricerche del riconoscimento delle lesioni del DNA nella riparazione di excisione dei nucleotidi

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DOI:

10.3791/55501

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24 maggio 2017

Jonas Gross^*¹ , Nicolas Wirth^*¹ , Ingrid Tessmer¹

¹Rudolf Virchow Center for Experimental Biomedicine, University of Würzburg

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, lo studio di diversi approcci di riconoscimento delle lesioni del DNA tramite l'imaging AFM a singola molecola è dimostrato con il sistema di riparazione per escissione nucleotidica come esempio. Vengono descritte le procedure di preparazione dei campioni di DNA e proteine e i dettagli sperimentali e analitici per gli esperimenti AFM.

Abstract

L'imaging AFM è una tecnica potente per lo studio delle interazioni proteina-DNA. Questo metodo a singola molecola consente la risoluzione simultanea di diverse molecole e assemblaggi molecolari in un campione eterogeneo. Nel particolare contesto dei sistemi proteici che interagiscono con il DNA, si possono quindi distinguere diverse forme di complessi proteici e le loro corrispondenti posizioni di legame su siti bersaglio contenenti frammenti di DNA. Qui viene presentata un'applicazione dell'AFM allo studio del riconoscimento delle lesioni del DNA nei sistemi di riparazione del DNA (NER) di escissione nucleotidica procariotica ed eucariotica. Vengono descritte le procedure di preparazione dei campioni di DNA e proteine e vengono forniti dettagli sperimentali e analitici degli esperimenti. I dati consentono di trarre importanti conclusioni sulle strategie con cui la verifica del sito bersaglio può essere raggiunta dalle proteine NER. È interessante notare che indicano diversi approcci di riconoscimento e identificazione delle lesioni per il sistema NER eucariotico, a seconda del tipo di lesione. Inoltre, le distinte proprietà strutturali delle due diverse elicasi coinvolte nel NER procariotico ed eucariotico determinano e spiegano le diverse strategie osservate per questi due sistemi. È importante sottolineare che questi approcci sperimentali e analitici possono essere applicati non solo allo studio della riparazione del DNA, ma anche in modo molto simile ad altri sistemi proteici che interagiscono con il DNA, come quelli coinvolti nei processi di replicazione o trascrizione.

Introduzione

La microscopia a forza atomica (AFM) è una tecnica potente per l'analisi delle interazioni proteine-DNA ¹ ^, ² ^, ³ ^, ⁴ ^, ⁵ ^, ⁶ ^, ⁷ ^, ⁸ ^, ⁹ . Richiede solo basse quantità di materiale di campionamento per visualizzare direttamente campioni eterogenei con una risoluzione a livello di singola molecola. L'eterogeneità può derivare da diversi stati conformazionali o ....