Iniezione periferica di fibrille alfasinucleina nel peritoneo o linguetta di Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi che esprimono umana alfasinucleina con la mutazione A53T familiare e luciferasi di lucciola, può indurre neuropatologia, compreso neuroinflammation , nel loro sistema nervoso centrale.
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Articolo metodologico
Bioluminescenza Imaging di Neuroinflammation in topi transgenici Dopo periferica inoculazione di alfa-sinucleina fibrille
In questo articolo
Sommario
Abstract
Per studiare il comportamento prione-come misfolded alfasinucleina, sono necessari modelli murini che permettono la trasmissione veloce e semplice di prionoids alfa-sinucleina, che causano neuropatologia all'interno del sistema nervoso centrale (CNS). Qui si descrive che intraglossal o iniezione intraperitoneale di fibrille alfasinucleina in bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi che iperesprimono alfasinucleina umano con la mutazione A53T dal promotore proteina prionica e luciferasi di lucciola da il promotore di proteina acida fibrillare gliale (GFAP), è sufficiente per indurre la malattia neuropatologiche. In confronto a omozigote Tg (M83 + / +) topi che sviluppano gravi sintomi neurologici che cominciano ad un'età di 8 mesi, eterozigote Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) gli animali rimangono liberi da malattia spontanea fino a raggiungere un all'età di 22 mesi. È interessante notare che l'iniezione di fibrille alfasinucleina tramite l'intraperitoneal percorso indotta malattia neurologica con paralisi in quattro dei cinque Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi con un tempo di incubazione medio di 229 ± 17 giorni. animali malati hanno mostrato gravi depositi di fosforilata alfa-sinucleina nel cervello e midollo spinale. Accumuli di alfa-sinucleina erano sarcosile insolubile e colocalized con ubiquitina e P62, e sono accompagnati da una risposta infiammatoria conseguente gliosi astrocitaria e microgliosis. Sorprendentemente, l'inoculazione di fibrille alfasinucleina nella lingua era meno efficace nel causare malattia con uno solo dei cinque animali iniettati mostrano alfasinucleina patologia dopo 285 giorni. I nostri risultati mostrano che l'inoculazione per via intraglossal e ancora di più per via intraperitoneale è idoneo ad indurre la malattia neurologica con caratteristiche rilevanti del sinucleinopatie a Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi. Ciò fornisce un nuovo modello per lo studio patogenesi prioni come indurred entro prionoids alfa-sinucleina in maggiore dettaglio.
Introduzione
V'è una crescente evidenza che l'alfa-sinucleina ha caratteristiche che sono simili a quelli della proteina prionica, in particolare nella sua capacità di auto-seme e propagano misfolding tra cellule e lungo percorsi neuronali. La struttura, di alfa-sinucleina è indicato anche come 'prioni-like' o 'prionoid', ed è supportata da osservazioni in esperimenti di trapianto, che suggeriscono la trasmissibilità di misfolded alfa-sinucleina da neuroni malati a appena trapiantato neuroni sani 1, 2 , 3, 4. Anche l'iniezione diretta di misfolded alfasinucleina nel cervello o la periferia, per esempio il muscolo arti posteriori o parete intestinale, provoca una diffusione di alfasinucleina patologia a parti distali del SNC 5, 6, 7, 8, 9, 10. Abbiamo analizzato trasmissione di prionoids alfa-sinucleina tramite percorsi periferici in maggior dettaglio e affrontato la questione se misfolded alfasinucleina può neuroinvade del SNC dopo una singola iniezione intraperitoneale o intraglossal, una caratteristica che in precedenza era stato mostrato per prioni ma non per alfa misfolded sinucleina. Dopo l'iniezione dei prioni nella lingua, neuroinvasione del SNC avviene tramite propagazione lungo il nervo ipoglosso della lingua che conduce al nucleo del nervo ipoglosso, che si trova nel tronco cerebrale 11. Come un modello murino abbiamo scelto Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi che sovraesprimono il mutante A53T di umana alfasinucleina dal promotore prione, e luciferasi di lucciola sotto il controllo di un promotore GFAP per monitorare attivazione degli astrociti da bioluminescenza, come precedentemente indicato nel cervello diprioni infetti topi 12. Nelle nostre mani bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) i topi non hanno sviluppato la malattia fino a 23 mesi di età, come è stato dimostrato da altri 13. Una singola iniezione di fibrille alfasinucleina umani tramite l'intraglossal o rotta indotta malattia neurologica intraperitoneale con patologia nel cervello e midollo spinale di Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mice sostengono l'ipotesi che prionoids alfa-sinucleina condividere caratteristiche importanti con prioni 14.
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Protocollo
Tutte le procedure tra cui animali sono stati eseguiti con l'approvazione del Comitato per la protezione degli animali di Reno-Westfalia Agenzia North State Environment (LANUV). Gli animali sono stati alloggiati e curati secondo condizioni standard con 12 h ciclo luce / buio e libero accesso a cibo e acqua.
1. Modello Animal
- Intercross emizigote Tg (GFAP -Luc +/-) topi con emizigote topi Tg (M83 +/-) per generare emizigote bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mouse 15, 16.
- Genotipo progenie con PCR in tempo reale per la presenza del transgene codifica alfasinucleina umana e con PCR standard per luciferasi di lucciola 12, 17.
- Inoculare gli animali ad un'età di sei-otto settimane.
2. Preparazione dell'inoculo
- preparare monomeric ricombinante alfa-sinucleina umana con la mutazione A53T in tampone salina tamponata con Tris (TBS) contenente 150 mM NaCl in 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) come è stato descritto in precedenza 14.
- Preparare fibrillare alfa-sinucleina per vaccinazioni agitando 3 ug / ml di monomerico ricombinante alfa-sinucleina umana in un agitatore orbitale a 800 rpm e 37 ° C per 5 giorni.
- Diluire assiemi fibrille in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per raggiungere una concentrazione finale di 1 mg / mL per intraperitoneale o 2 mg / mL per vaccinazioni intraglossal.
- Frammentare le fibrille alfasinucleina con un sonicatore asta per 1 min (40 impulsi di durata di 0,5 s con una pausa di un secondo tra ogni impulso e ampiezza impostata al 50%) su ghiaccio. Per evitare la contaminazione da cross-semina. Utilizzare sonde sonicazione puliti per preparare inoculo diverso.
3. Intraglossal Iniezioni
- Anestetizzare gli animali con un'intrapeiniezione ritoneal di 100 mg / kg di ketamina e 10 mg / kg xilazina. Pinch punta dell'animale e confermare che non ritira la sua arti posteriori per garantire la corretta anestesia. Utilizzare veterinario pomata sugli occhi dell'animale per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
- Fissare animali narcotizzati accuratamente con nastro adesivo su una piastra riscaldante in una dorsale posizione supina con la testa rivolte verso l'investigatore.
- Riempire una siringa ipodermica monouso 27 G con 5 ml di fibrille alfasinucleina sonicata o PBS.
- Utilizzare una pinza pollice smussato dal naso con punte zigrinate per tenere bocca dell'animale aperta, ed una seconda coppia minore di pinze per tirare fuori attentamente la linguetta per rendere il lato inferiore della linguetta accessibile per iniezione.
- Iniettare l'ago della siringa nella parte inferiore destra o sinistra della lingua in prossimità del nervo ipoglosso. Iniettare lentamente l'inoculo dopo 5 s. Lentamente ritrarre l'ago dopo 5 s per garantire che l'inoculoè penetrato il tessuto e non si perde mentre ritraendo l'ago.
- Rilasciare l'animale dalle sue fissazioni e lasciarlo sulla piastra di riscaldamento sotto costante monitoraggio fino al recupero completo.
4. iniezioni intraperitoneali
- Per le iniezioni intraperitoneali, narcotizzare gli animali brevemente in una camera anestesia per inalazione con isoflurano / ossigeno utilizzando una portata di 2 L / min e il vaporizzatore impostato a 2%. Pinch punta dell'animale e confermare che non ritira la sua arti posteriori per garantire la corretta anestesia.
- Riempire una siringa ipodermica monouso 27 G con 50 ml di fibrille alfasinucleina sonicata o PBS.
- Direttamente iniettare nel peritoneo del mouse e non penetrare tenue o cieco situato dietro la parete addominale tenendo l'animale in una posizione dorsale con la testa rivolta verso l'investigatore e verso il basso a circa 45 °. Monitorare gli animali fino a quando non hanno recuperatodall'anestesia.
5. Bioluminescenza Imaging
- Immagine Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi ogni 2-4 settimane con un sistema di imaging bioluminescenza.
- Prima di imaging breve anestetizzare topi in una camera di isoflurano / ossigeno con una portata di 2 L / min e il vaporizzatore impostato a 2%. Pinch punta dell'animale e confermare che non ritira la sua arti posteriori per garantire la corretta anestesia.
- Shave e depilare le teste dei topi con una crema depilatoria. Colorare le orecchie in nero con un indicatore non irritante per bloccare bioluminescenza non specifico.
- Diluire sale di potassio D-luciferina, il substrato di luciferasi, in PBS ad una / soluzione stock di 30 mg mL. Conservare questo in 1 aliquote mL a -20 ° C. Proteggere il D-luciferina disciolto dall'esposizione alla luce.
- Pesare gli animali prima dell'iniezione. Calcolare il volume esatto di D-luciferina per iniezione di 150 mg / kg di peso corporeo. Intraperitoneale iniettare D-luciferin e restituire l'animale alla camera di anestesia.
- Avviare il software di imaging. Dopo che il sistema di imaging ha raggiunto la sua temperatura di esercizio inizializzare il sistema facendo clic sul pulsante 'Initialize' nel pannello di controllo.
- Selezionare i pulsanti 'luminescenti' e 'fotografia'. Impostare il tempo di esposizione a 60 s, il binning a 'Media', l'F / Stop per '1', e il guadagno EM 'Off'.
- Confermare che il filtro di eccitazione è impostato 'Block' e il filtro per le emissioni di 'aperto', e impostare l'altezza soggetto a 1,50 cm.
- Dieci minuti dopo l'iniezione con D-luciferina, collocare gli animali sulla piastra di riscaldamento nella camera di imaging e garantire che il muso siano correttamente inseriti nella presa anestesia. Chiudere il flusso isoflurano / ossigeno dalla camera di inalazione e aprire il flusso per la camera di imaging con una portata di 0,25 L / min e un'evaporazione del 2%. Chiudere la porta della camera di imaging properly.
- Fare clic sul pulsante 'Acquire' per misurare la bioluminescenza, che prende 60 s. Arrestare il flusso isoflurano e monitorare gli animali fino a quando non hanno completamente recuperato dopo di loro il ritorno alle loro gabbie.
- Utilizzare il software di imaging per quantificare la bioluminescenza. All'interno del 'Tool Palette' selezionare 'Strumenti ROI. Sotto 'Tipo' all'interno dei 'Strumenti ROI' selezionare 'misurazione del ROI'.
- All'interno dei 'Strumenti ROI' clic sullo strumento "cerchio" e selezionare il numero di ROI per disegnare dal menu a discesa - idealmente '3' per tre topi.
- Nell'immagine, fare clic destro ciascuna ROI e sotto 'Proprietà' regolare la larghezza e l'altezza di 1,25 cm. Posizionare ogni ROI su tutta l'area del cervello che viene quantificato.
- In alto a sinistra dell'immagine, impostare il pannello unità 'radianza (fotoni).
- All'interno del 'tavolozza degli strumenti', selezionare 'Regolazione immagine' e regolare il minimo eil massimo della 'scala a colori', per esempio, da 0.20e6 a 1.00e6.
- In 'File' salvare i dati con 'Salva'.
6. Le analisi biochimiche
- Isolare il cervello e il midollo spinale secondo i protocolli stabiliti 18, 19.
- Omogeneizzare intero cervello e del midollo spinale interi campioni separatamente in PBS in presenza di inibitori di proteasi e fosfatasi (diluito in PBS a 1x) in due cicli di 30 s con 6.000 rpm in un omogeneizzatore tessuto. Assicurarsi che il cervello e il midollo spinale campioni omogeneizzazione ad una concentrazione finale del 20% (peso / volume).
- Sonicare i campioni due volte mentre il loro mantenimento ghiaccio con una costante di impulso di 10 s ed un'ampiezza impostata al 50%.
- Regolare le omogenati al 10% in PBS e 750 mM NaCl diluendo loro 1: 1 con 1,5 M NaCl in PBS.
- Per separare i detriti cellulari, centrifugare le omogenati a 1.000 xg per 5 minuti a4 ° C. Mantenere i supernatanti per i passaggi successivi e scartare il pellet.
- Misurare la concentrazione di proteine nei omogenati utilizzando il dosaggio dell'acido bicinconinico (BCA) secondo le istruzioni del produttore. Incubare 1,0 mg di proteina totale da omogenati cerebrali o 0,8 mg di omogenati midollo spinale in N-laurylsarcosyl ad una concentrazione finale del 10% (p / v) per 15 min in ghiaccio.
- Sovrapporre le omogenati su un cuscino 3 ml di saccarosio del 10% (peso / volume) in acqua distillata e ultracentrifuga a 465.000 xg per 1 ora a 4 ° C.
- Risospendere il pellet in un tampone contenente 4% di solfato di sodio dodecil (SDS), 2% β-mercaptoetanolo, 192 mM glicina, 25 mM Tris, e 5% (p / v) di saccarosio.
- Bollire i campioni a 100 ° C per 5 min e caricarli su gel di SDS-poliacrilammide per elettroforesi in un sistema tampone acido morpholineethanesulfonic (MES).
- Trasferire le proteine separate per polivinilidene difluoruro (PVDF) membrane in un semiDry sistema assorbente.
- Incubare le membrane a 0,4% (vol / vol) soluzione di formalina in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente su un rotore a 35 rpm per reticolare le proteine con la membrana.
- Bloccare le membrane in tampone TBS contenente 0,05% (vol / vol) di Tween 20 e 5% (p / v) di latte per 1 ora a temperatura ambiente.
- Incubare le macchie con l'anticorpo primario in tampone bloccante notte a 4 ° C.
- Lavare le membrane tre volte in tampone TBS e incubare con anticorpi secondari perossidasi o fluoroforo-coniugato in TBS per 1 ora a temperatura ambiente.
- Visualizza gli anticorpi secondari legati per chemiluminescenza o fluorescenza secondo i protocolli stabiliti 20.
Analisi 7. immunofluorescenza
- Disidratare il cervello sezionato e il midollo spinale in una stazione di lavorazione dei tessuti e incorporarli in paraffina utilizzando una stazione di paraffina.
- Tagliare il TIS inclusi in paraffinasues con un microtomo a 8 micron sezioni coronali spesse e montare sezioni di vetrini.
- Deparaffinare le sezioni di tessuto incubandoli in due bagni xilolo separate per 5 a 10 min e reidratare attraverso una serie di bagni graduata di etanolo (100%, 90%, 70%, 50%) ed infine con H 2 O.
- Incubare le sezioni in 0,01 M tampone citrato (pH 6,0) per 5 minuti a temperatura ambiente e inoltre li bollire per 10 minuti in un forno a microonde.
- Lasciare che le sezioni raffreddare a temperatura ambiente e incubare con una soluzione di perossido di idrogeno al 3% per 30 minuti per inibire le perossidasi endogene.
- Bloccare le sezioni di tessuto di incubazione con 20% (vol / vol) siero di capra normale, 1% (vol / vol) siero albumina bovina (BSA), e 0,5% Triton X-100 in PBS per 1 ora a temperatura ambiente.
- Incubare le sezioni con l'anticorpo primario diluito in 1% (vol / vol) siero di capra normale, 1% (vol / vol) BSA, e 0,25% Triton X-100 in PBS notte a 4 ° C.
- Lavare sezioni due volte con 0,25% (vol / vol) Triton X-100 in PBS e una volta con PBS.
- Macchiare le sezioni con i corrispondenti anticorpi secondari coniugati fluoroforo e il colorante nucleare DAPI diluito in 1% (vol / vol) siero di capra normale, 1% (vol / vol) BSA, e PBS per 1 ora a temperatura ambiente.
- Dopo lavaggio due volte con 0,25% (vol / vol) Triton X-100 in PBS e una volta con PBS, coprivetrino per i vetrini con mezzi di incorporamento e visualizzare la colorazione con un microscopio confocale a scansione laser.
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Risultati
Iniezione periferica prionoids alfa-sinucleina tramite la lingua o il peritoneo indotta neuropatologia nel SNC di bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mice (Tabella 1 e Figura 1). Dopo una singola iniezione intraperitoneale con fibrille alfasinucleina, quattro dei cinque topi sviluppato malattia neurologica con un tempo di incubazione medio di 229 ± 17 giorni. Sorprendentemente, uno dei cinque topi hanno sviluppato malattie ...
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Discussione
Iniezione periferica di fibrille alfasinucleina nel peritoneo di Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi rappresenta un metodo facile per indurre la malattia neurologica accompagnato da neuroinflammation ricapitolare caratteristiche importanti synucleinopathies. Analogamente, iniezione lingua rappresenta un altro percorso per neuroinvasione da prionoids alfa-sinucleina in topi transgenici ma è meno efficiente. Abbiamo scelto di interrompere i nostri esperimenti a 420 giorni dopo l'iniezione e...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Olga Sharma, Theresa Hundt, e il personale delle DZNE microscopia ed animali strutture per il supporto tecnico.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| anticorpo anti-actina | Merck Millipore | MAB1501 | |
| anti-alfa-sinucleina, anticorpo fosfo S129 [pSyn#64] | Wako | 015-25191 | |
| anti-alfa-sinucleina, anticorpo fosfo S129 [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| anticorpo anti-GFAP | Dako | Z0334 01 | |
| anticorpo anti-IBA-1 | Wako | 019-19741 | |
| anticorpo anti-Sequestosoma-1 (p62) | Proteintech | 18420-1-AP | |
| anticorpo anti-ubiquitina [Ubi-1] | Merck Millipore | MAB1510 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Invitrogen | 14190169 | |
| Ketamina | Ratiopharm | 100 mg/kg | |
| Xilazina | Ratiopharm | 10 mg/kg | |
| Siringa da 27 G | VWR | 613-4900 | |
| Isoflurano | Piramal Healthcare | PZN 4831850 Crema | |
| depilatoria | Veet | ||
| Secureline marcatore da laboratorio | Neolab | 25040 | |
| D-luciferina sale di potassio | Acris | LK10000 | 30 mg/mL soluzione madre |
| Thermomixer Eppendorf | 5776671 | ||
| Sonopuls Mini20 sonicatore | Bandelin | 3648 | |
| IVIS Lumina II sistema di imaging | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 Software | PerkinElmer | ||
| Tg(M83+/-) topi o B6; Topi C3-Tg (Prnp-SNCA*A53T) 83Vle/J | The Jackson Laboratory | 004479 | |
| Pinze a modello standard | Strumenti | 11000-16 | |
| Pinze a modello stretto | Strumenti per la scienza fine 11002-12 | ||
| N-laurilasarcosil | Sigma | L5125-100G | |
| Ultracentrifuga Optima Max-XP | Rotore Beckman Coulter | TLA-110 | |
| Tubi in policarbonato a parete spessa | Beckman Coulter | 362305 | |
| NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | WG1401BOX | |
| HRP anticorpo coniugato | Cayman | Cay10004301-1 | |
| IR Dye 680 anticorpo coniugato | LI-COR Biosciences | 926-68070 | |
| SuperSignal West Dura Substrato a durata estesa | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| Sistema di imaging Stella 3200 | Sistema | ||
| Odyssey | LI-COR Biosciences | ||
| Tween 20 | MP Biomedicals | TWEEN201 | |
| Triton X-100 | Sigma | SA/T8787 | |
| Immobilon-FL Membrana PVDF | Merck Millipore | IPFL00010 | |
| Xylol | Sigma | Roth | |
| Perossido di idrogeno | Sigma | SA/00216763/000500 | soluzione di lavoro 3% |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Thermo Fisher Scientific | A3294-100G | |
| Siero di capra | Thermo Fisher Scientific PCN5000 | ||
| 4,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | diluizione di lavoro 1:50.000 |
| Terreni di montaggio in fluoro | Omnilab | SA/F4680/000025 | |
| Microscopio a scansione laser confocale LSM700 | Carl Zeiss | ||
| HALT proteasi e inibitori della fosfatasi | Thermo Fisher Scientific | ||
| Precellys 24-Dual omogeneizzatore | Peqlab | 91-PCS24D | |
| Alexa Fluor 488 anticorpo coniugato | Thermo Fisher Scientific | A31619 | |
| Alexa Fluor 594 anticorpo coniugato | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| Pierce BCA Proteine Saggio Kit | Thermo Fisher Scientific | 10741395 | |
| Microtomo RM2255 | Leica | ||
| LSM700 microscopio confocale a scansione laser | Carl Zeiss |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
