Qui presentiamo un protocollo per la rilevazione dell'espressione di microRNA nella membrana peritoneale del ratto utilizzando la reazione a catena di polimerasi reattiva-trasversale in tempo reale. Questo metodo è adatto allo studio del profilo di espressione di microRNA nella membrana peritoneale del ratto in diverse condizioni patologiche.
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Articolo metodologico
Rilevamento dell'espressione di microRNA nella membrana peritoneale dei ratti usando il quantitativo PCR in tempo reale
In questo articolo
Sommario
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) sono piccoli RNA non codificanti che regolano l'espressione di RNA messaggero post-trascrizionale. Il profilo di espressione miRNA è stato studiato in vari organi e tessuti nel ratto. Tuttavia, i metodi standard per la purificazione di miRNA e l'individuazione della loro espressione nella membrana peritoneale del ratto non sono stati ben stabiliti. Abbiamo sviluppato un metodo efficace e affidabile per purificare e quantificare i miRNA utilizzando la reazione a catena di polimerasi a reazione inversa in tempo reale (qRT-PCR) nella membrana peritoneale del ratto. Questo protocollo è costituito da quattro fasi: 1) purificazione del campione di membrana peritoneale; 2) la purificazione di RNA totale incluso miRNA dal campione di membrana peritoneale; 3) trascrizione inversa di miRNA per produrre cDNA; E 4) qRT-PCR per rilevare l'espressione di miRNA. Usando questo protocollo, abbiamo determinato con successo che l'espressione di sei miRNA (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 e miRNA-34a-5p)Significativamente nella membrana peritoneale di un modello di fibrosi peritoneale del ratto rispetto a quelli nei gruppi di controllo. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare il profilo dell'espressione di miRNA nella membrana peritoneale dei ratti in molte condizioni patologiche.
Introduzione
MicroRNAs (miRNAs) sono brevi e non codificanti RNA che regolano post-trascrizionale l'espressione del messaggero RNA (mRNA) 1 . I cambiamenti nell'espressione dei miRNA regolano l'espressione di molti mRNA che svolgono ruoli chiave in varie condizioni patologiche, tra cui il cancro, l'infiammazione, i disturbi metabolici e la fibrosi 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Pertanto, i miRNA hanno potenziale c....
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Protocollo
Tutti i protocolli sperimentali animali sono stati approvati dal comitato di etica degli animali dell'Università di Jichi Medical e sono stati eseguiti in conformità con le linee guida per l'uso e la cura degli animali sperimentali della Jichi Medical University Guide for Animals Laboratory.
1. Raccolta di campioni peritoneali
- Raccogliere i seguenti elementi: tubo centrifuga da 50 ml con cotone inzuppato in isoflurano, foglio di sughero, piatto di Petri con soluzione salina fosfatica (PBS), forbici chirurgiche e pinze.
- Eutanizzare un ratto con un sovradosaggio di isofluorano, poi spruzzare la pelle addominale ....
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Risultati
I risultati qui presentati sono basati sul nostro studio precedentemente riportato 8 . Abbiamo studiato il profilo di espressione miRNA nella fibrosi peritoneale. La fibrosi peritoneale è una delle principali complicanze della dialisi peritoneale. È caratterizzato dalla perdita del monostrato di cellule mesoteliali e dall'accumulo in eccesso di componenti della matrice extracellulare ed è associato all'insuccesso della membrana peritoneale
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Discussione
Utilizzando il protocollo presentato in questo manoscritto, miRNAs nella membrana peritoneale del ratto sono state correttamente purificate e rilevate usando qRT-PCR. L'affidabilità dell'analisi dei dati qRT-PCR dipende dalla qualità dei miRNA purificati. Pertanto, la purezza dei miRNAs può essere controllata prima di qRT-PCR dal rapporto di assorbanza a 260 nm a quella a 280 nm, che può essere misurato usando uno spettrofotometro. Quando non si può ottenere amplificazione significativa di miRNA utilizzando qRT-.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Miyako Shigeta per il suo ottimo supporto tecnico. Questo lavoro è stato parzialmente supportato da JSPS KAKENHI (numero di sovvenzione 25461252).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Trituratore QIA | Qiagen | 79654 | in una microcentrifuga a colonna rotante |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | rotante a base di membrana di silice |
| Reagente di lisi QIAzol Reagente di lisi | base di fenolo/guanidina | Qiagen | 79306 |
| Tampone RLT | Qiagen | 79216 | tampone di lavaggio 1 |
| tampone RWT | Kit Qiagen | 1067933 | wash buffer 2 |
| miScript II RT | Qiagen | 218161 | include 10 volte Nucleics Mix contenente deossinucleotidi, ribonucleotidi trifosfati e primer oligo-dT; miScript Miscela di trascrittasi inversa contenente poli(A) polimerasi e trascrittasi inversa e; Kit miScript HiSpec buffer |
| miScript SYBR Green PCR | Qiagen | 218073 | include QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix e miScript Universal Primer |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | non divulgato |
| miRNA-142-3p primer | Qiagen | MS00031451 | 5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3' |
| miRNA-21-5p primer | Qiagen | MS00009079 | 5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3'miRNA-221-3p |
| primer | Qiagen | MS00003857 | 5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3'miRNA-223-3p |
| primer | Qiagen | MS00033320 | 5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3'miRNA-34a-5p |
| primer | Qiagen | MS00003318 | 5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3'miRNA-327 |
| primer | Qiagen | MS00000805 | 5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3'MicroAmp |
| Piastra di reazione ottica a 96 pozzetti per qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific 4316813 | Piastra di reazione a 96 pozzetti | |
| MicroAmp Pellicola adesiva ottica | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | pellicola adesiva per piastra di reazione a 96 pozzetti |
| QuantStudio 12K Flex Flex Sistema di PCR in tempo reale | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Strumento per PCR in tempo reale |
| QuantStudio 12K Flex Software versione 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | dello strumento PCR in tempo reale |
| metilgliossale | Sigma-Aldrich | M0252 | |
| Midperic | Terumo | non assegnato | liquido per dialisi peritoneale |
| Sprague– I ratti Dawley | SLC | non assegnano |
Riferimenti
- Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).
- Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Back....
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Ristampe e permessi
