Rilevamento di Ligand-activated proteina G-recettore accoppiato internalizzazione da microscopia confocale

Sommario

Questo protocollo descrive rilevamento microscopia confocale del recettore accoppiato alla proteina G (GPCR) internalizzazione in cellule di mammifero. Esso comprende la coltura di cellule di base, trasfezione, e la procedura microscopia confocale e fornisce un metodo efficiente e facilmente interpretabili per rilevare la localizzazione subcellulare e internalizzazione del GPCR fusione espressa.

Abstract

La microscopia a scansione laser confocale (CLSM) è una tecnica di imaging ottico per l'imaging ad alto contrasto. Si tratta di un approccio potente per visualizzare le proteine di fusione fluorescenti, come la proteina fluorescente verde (GFP), per determinarne l'espressione, la localizzazione e la funzione. La localizzazione subcellulare delle proteine bersaglio è importante per l'identificazione, la caratterizzazione e le analisi funzionali. L'internalizzazione è uno dei meccanismi predominanti che controllano la segnalazione del recettore accoppiato alla proteina G (GPCR) per garantire le risposte cellulari appropriate agli stimoli. Qui, descriviamo un metodo sperimentale per rilevare la localizzazione subcellulare e l'internalizzazione di GPCR in cellule HEK293 con la microscopia confocale. Inoltre, questo esperimento fornisce alcuni dettagli sulla coltura cellulare e la trasfezione. Questo protocollo è compatibile con una varietà di marcatori fluorescenti ampiamente disponibili ed è applicabile alla visualizzazione della localizzazione subcellulare della maggior parte delle proteine, nonché dell'internalizzazione di GPCR. Questa tecnica dovrebbe consentire ai ricercatori di manipolare in modo efficiente l'espressione genica dei GPCR nelle linee cellulari di mammifero e dovrebbe facilitare gli studi sulla localizzazione e l'internalizzazione subcellulare dei GPCR.

Introduzione

Cellule possiedono macchine traffico merci da trasportare extracellulare materiali, ad esempio leganti, microrganismi, nutrienti e proteine transmembrana-nella cella per informazioni, energia e altri scopi ^{1, 2.} È fondamentale per l'omeostasi cellulare, la funzione dei tessuti, e la sopravvivenza delle cellule complessiva. L'espressione a base di cellule di proteine di fusione fluorescenti è un potente strumento per studiare la localizzazione e internalizzazione di recettori transmembrana, come G recettori accoppiati alle proteine (GPCR), in vie di segnalazione ^3.

L'espressione di proteine di fusione contrassegnate con proteina fluorescente verde (GFP) dalla medusa Aequorea victoria, combinato con tecniche di rivelazione di fluorescenza diretta, ha guadagnato un largo consenso nel proteina-targeting di ricerca ^{4, 5, 6.} detecti GFP-basedsulla presenta il vantaggio di consentire l'imaging in tempo reale delle cellule viventi evitando artefatti fissaggio ^7. Una serie di vettori di clonaggio versatili è stato costruito per facilitare l'espressione di proteine per fusioni GFP in varie cellule ^{8, 9.} Il vettore pEGFP-N1 è un vettore plasmidico utilizzato e commercializzato codificante una maggiore proteina fluorescente verde (EGFP), che è stato ottimizzato da wild-type per GFP luminosa fluorescenza e più alta espressione in cellule di mammifero. Per osservare il segnale fluorescente EGFP espresso in cellule di mammifero, la microscopia a fluorescenza deve essere condotta con l'eccitazione a 488 nm e l'emissione a 507 nm, preferibilmente con microscopia confocale.

Monitoraggio della localizzazione subcellulare e internalizzazione ligando mediata da recettori è una tecnica comune per indagare la trasduzione del segnale e funzione della GPCR ¹⁰ up>, ^11. Nella maggior parte dei casi, porta alla internalizzazione desensibilizzazione dei GPCR (l'attenuazione della risposta stimolo nonostante la presenza di agonisti) ^{12, 13.} I recettori internalizzati possono essere incorporati nella lisosoma e degradati, oppure possono essere riciclati alla superficie cellulare, a seconda della natura dei recettori e le linee cellulari utilizzate negli esperimenti.

I recettori dell'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRHRs) appartengono alla famiglia GPCR e hanno una struttura tipica proteina GPCR, con un terminale ammino extracellulare, un terminale -COOH intracellulare, e sette transmembrana (TM) ¹⁴ domini. La trasfezione di plasmidico ricombinante Sj GnRHR-EGFP (con il gene GnRHR da Sepiella japonica) e la rilevazione di microscopia confocale GnRHR Sj EGFP-tag (espressi in cellule HEK293) è stata riportata Precemalizioso, e la fluorescenza GFP è stato stabilito come reporter per saggi di localizzazione della proteina transmembrana ^15. Ora, l'interiorizzazione di Sj GnRHR, attivato da S. japonica gonadotropina-releasing hormone (GnRH Sj), è stata dimostrata in maniere tempo-e dose-dipendenti mediante microscopia confocale.

Protocollo

1. Preparazione delle cellule

1. il recupero delle cellule
   1. Trasferire le cellule renali 293 crioconservate embrionali umane (HEK293) da un serbatoio di azoto liquido bagnomaria C 37 ° e agitare continuamente per 1 - 2 min.
   2. Aggiungere 10 ml di mezzo di crescita Equilibrated (mezzo di Dulbecco modificato da Eagle (DMEM), 10% siero bovino (FBS), e 1% di soluzione di penicillina-streptomicina fetale) a 10 cm piatto di coltura cellulare. Delicatamente aggiungere le cellule scongelate al mezzo di crescita equilibrata.
   3. Incubare le cellule in una camicia d'acqua CO ₂ incubatore a 37 ° C con un'atmosfera umidificata contenente il 95% di CO aria e 5% ₂ per 2 - 4 h.
   4. Dopo 2 - 4 h, controllare che le cellule sono allegati. Sostituire il terreno di crescita equilibrata e la cultura per un altro 24-48 ore.
      NOTA: La modifica del mezzo di crescita equilibrata è utile perché elimina dimetilsolfossido (DMSO) e protegge contro i danni cellulari.
2. passaggio della cella
   1. Dopo 24 - 48 h, quando le cellule sono cresciute a confluenza vicino, scartare il mezzo di crescita equilibrata e lavare le cellule con 2 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Agitare delicatamente il piatto.
   2. Eliminare il PBS e aggiungere 1 ml di tripsina-EDTA (soluzione salina, 0,25% tripsina, e 0,02% EDTA). Per digerire completamente le cellule, agitare il piatto con attenzione e aspirare via la soluzione tripsina-EDTA. Mettere il piatto nel 37 ° C con camicia d'acqua CO ₂ incubatore per 3 min.
      NOTA: Durante questo periodo, preparare tre piatti nuovi coltura cellulare 10 cm e aggiungere 10 ml di terreno di crescita equilibrata a ciascuno.
   3. Utilizzando un microscopio ottico, determinare se le cellule hanno sollevato dal fondo del recipiente. Aggiungere 2 ml di terreno di crescita equilibrata al piatto. Mescolare pipettando e pipettare immediatamente 0,6 ml di sospensione cellulare per ciascuno dei nuovi piatti. Mescolare delicatamente pipettando e permettono alle cellule di incubare a 37 ° C e 5% CO _2.

2. Cella Semina

1. Dopo 24 - 48 h, quando le cellule sono cresciute a diversi passaggi vicino confluenza, scartare il mezzo di crescita equilibrata e lavare le cellule con 2 ml di PBS. Agitare delicatamente il piatto.
2. Eliminare il PBS e aggiungere 1 ml di tripsina-EDTA. Per digerire completamente le cellule, agitare il piatto con attenzione e aspirare fuori dalla tripsina-EDTA. Mettere il piatto nel 37 ° C con camicia d'acqua CO ₂ incubatore per 3 min.
   NOTA: Durante questo periodo, preparare una piastra da 6 pozzetti aggiungendo 2 mL di terreno di crescita equilibrata in ciascun pozzetto.
3. Aggiungere 1 ml di mezzo di crescita equilibrata al piatto, se, sotto osservazione microscopica, le cellule hanno sollevato dal fondo piatto. Mescolare pipettando e subito pipettare 0,1 ml di sospensione cellulare (il volume viene regolato in funzione della densità crescita cellulare) in ciascun pozzetto della preparato il 6 pozzetti (lastra alveolare inferiore 6 pozzetti con 2 ml di mezzo di crescita equilibrata). Mescolare delicatamente pipettando e consentire alle celluleincubare a 37 ° C e 5% CO _2.

3. cellule trasfezione

1. Metodo trasfezione 1, con formulazioni liposomi
   NOTA: Si prega di consultare la tabella dei materiali per il reagente di trasfezione 1.
   1. Il giorno seguente, in modo che le cellule dovrebbero essere 85-95% confluenti.
   2. Aggiungere 3 pg di DNA plasmidico (500 ng / ml) e 100 ml di mezzi di siero ridotta in una provetta sterile, e mescolare delicatamente. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
   3. Preparare 9 ml di reagente 1 e 100 ml di mezzi di siero ridotta in un'altra provetta e mescolare delicatamente. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
   4. Combinare la miscela plasmide diluito con reagente diluito 1 (volume totale = 215 ml). Mescolare delicatamente e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
   5. media Aspirare la piastra cellule in coltura, e aggiungere 1,5 ml DMEM fresco senza FBS.
   6. Aggiungere 215 microlitri di DNA-trasfessione miscela reagente in ogni pozzetto, goccia a goccia, e mescolare delicatamente agitando la piastra.
   7. Incubare a 37 ° C e 5% CO _2: 4 - 8 ore. Sostituire con DMEM fresco con il 10% FBS.
   8. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO ₂ per altre 24 - 48 ore prima di eseguire qualsiasi esperimenti.
2. Metodo trasfezione 2, con formulazioni liposomi
   NOTA: Si prega di consultare la tabella dei materiali per il reagente di trasfezione 2.
   1. Aggiungere media siero 2 pg di DNA plasmidico (500 ng / ml), 4 ml di reagente 2, e 100 microlitri ridotti in una provetta sterile. Mescolare delicatamente e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
   2. Aggiungere la miscela di trasfezione per le cellule in modo goccia a goccia.
   3. Dopo la trasfezione, le cellule incubare per 24 - 48 ore a 37 ° C e 5% di CO _2, prima di eseguire qualsiasi esperimenti.

4. coltura cellulare in copertina Slips

1. Rispostare il mezzo di crescita della coltura 6 pozzetti.
2. Lavare il monostrato di cellule con 1 ml di PBS senza calcio e magnesio.
3. Aggiungere 0,5 ml di tripsina-EDTA. Agitare il piatto con attenzione e aspirare fuori tripsina-EDTA. Incubare la piastra di coltura per 3 minuti a 37 ° C e 5% CO _2. Il tempo di incubazione effettiva dipende dalla linea cellulare utilizzato.
   NOTA: Durante questo periodo, preparare un nuovo 12-pozzetti e aggiungere 15 mm di diametro copertura sterile scivola a ciascun pozzetto. coprioggetto rivestiti con lisina, laminina, o collagene può migliorare l'adesione cellulare per cellule HEK293 che facilmente si staccano.
4. Quando le cellule vengono staccate, aggiungere mezzo di crescita completo 1 ml preriscaldata a ciascun pozzetto. Mescolare pipettando e trasferire immediatamente il numero di cellule per piastra 12 pozzetti con coprioggetto. Aggiungi terreno di coltura completo fresco ad ogni pozzetto per regolare il volume totale di 1 ml
5. Incubare le cellule per 16 - 24 ore a 37 ° C e 5% CO _2.
   NOTA: Dopo il 30 -60 min, la maggioranza delle cellule avrà aderito alle coprioggetto sterili.

5. Microscopia confocale Detection

1. localizzazione cellulare
   1. Dopo 16 - 24 h, quando le cellule sono cresciute a confluenza in prossimità delle sterili coprioggetto nella piastra 12 pozzetti, aggiungere la sonda membrana, DII, a ciascun pozzetto, dando una concentrazione finale di 5 mM. Permettono alle cellule di incubare per 30 minuti a 37 ° C e 5% CO _2.
   2. Dopo 30 min, rimuovere il mezzo di crescita equilibrata e lavare le cellule due volte in PBS freddo (2 - 8 ° C).
   3. Fissare le cellule aggiungendo 1 ml di una soluzione di paraformaldeide al 4% (in PBS) a ciascun pozzetto. Agitare delicatamente per 15 min.
      Attenzione: Paraformaldeide è moderatamente tossico per contatto con la pelle o per inalazione, e designato come probabile cancerogeno umano. Chemicals cappe, recinzioni equilibrio sfiato o altre misure di protezione dovrebbe essere usato per il trattamento di pesatura e di paraformaldeide.
   4. Lavare le cellule fissate due volte in PBS. Aggiungere 200-300 ml di DAPI (4' , 6-diamidino-2-fenilindolo) soluzione (0,5 ug / mL) a ciascun pozzetto e incubare per 10 min a temperatura ambiente.
   5. Lavare le cellule due volte con PBS. rimuovere accuratamente i vetrini dalla piastra e stoppino in eccesso PBS. Capovolgere su vetrini da microscopio caricato con una goccia di mezzo di montaggio (50% v / v di glicerolo / acqua). Rimuovere l'eccesso di soluzione di montaggio dal diapositive.
2. internalizzazione cellulare
   1. Dopo 16 - 24 h, quando le cellule sono cresciute a confluenza in prossimità delle sterili coprioggetto nella piastra 12 pozzetti, rimuovere il mezzo di crescita equilibrata e aggiungere fresco, riscaldato DMEM (37 ° C). Incubare le cellule per 1 ora a 37 ° C e 5% CO _2.
   2. Trattare le cellule con differenti concentrazioni (0, 10 ^-12, 10 ^-9 e 10 ^-6 M) del ligando per 30 min e trattarli con 10 ^-6 M ligando per tempi diversi (0,10, 30 e 60 min).
   3. Lavare le cellule due volte in PBS freddo (2 - 8 ° C). Fissare le cellule aggiungendo 1 ml di una soluzione di paraformaldeide al 4% (in PBS) a ciascun pozzetto. Agitare delicatamente per 15 min.
   4. Lavare le cellule due volte in PBS. rimuovere accuratamente i vetrini dalla piastra e evacuano l'eccesso di PBS. Capovolgere su vetrini da microscopio caricato con una goccia di mezzo di montaggio (50% v / v di glicerolo / acqua). Rimuovere l'eccesso di soluzione di montaggio dal diapositive.
3. Microscopia confocale
   1. Accendere l'hardware del microscopio confocale, tra cui la potenza della lampada al mercurio, microscopio PC, scanner e laser. Effettua il login per account del sistema operativo, avviare il software, controllare la configurazione e selezionare laser. Accendere le diverse unità del sistema di microscopia confocale in ordine secondo le istruzioni.
   2. Porre i vetrini preparati sul palco microscopio. Posizionare il campione sul lente dell'obiettivo utilizzando il controller palco. Aggiungere una goccia di olio di cedro sua coprivetrino quando è selezionata la lente immersione in olio. Posizionare i vetrini su vetrini di fronte alla lente.
   3. Trova le cellule di interesse sotto il microscopio a fluorescenza.
   4. Passare alla modalità di scansione. Scegliere la potenza del laser e la gamma spettrale del fluoroforo emissione. Catturare le immagini di alta qualità confocale di intensità del laser messa a punto e di altri parametri.

Risultati

La figura 1 mostra un esempio di un sistema di microscopia confocale. La figura 2 presenta l'espressione di pEGFP-N1 in cellule HEK293. Il segnale GFP è stato rilevato nel citoplasma e nucleo. La Figura 3 mostra la localizzazione subcellulare di GnRHR da S. japonica in cellule HEK293, coerente con i risultati precedentemente pubblicati ^15. La proteina di fusione con il tag EGFP al C-terminale di Sj

Discussione

Il protocollo presentato qui offre un metodo efficiente e facilmente interpretabili per rilevare la localizzazione subcellulare e l'interiorizzazione della proteina di fusione GPCR espresso in cellule HEK293. La tecnica può essere facilmente adattato per molti geni differenti e tipi di cellule, come per la localizzazione cellulare e internalizzazione del recettore corazonin da Bombyx mori in cellule HEK293 e Bmn ^16.

L'applicazione di successo di quest...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Linea cellulare HEK293
DMEM/Hyclone ad alto contenuto di glucosio		SH30022,01	Alto glucosio 4,0 mM L-glutammina
Siero fetale bovino (FBS)	PuFei	1101-100
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Genom	GNM10010
Penicillina-Streptomicina	Genom	GNM15140
0,25% tripsina e 0,02% EDTA	Genom
Opti-MEM (1x)	GIBCO, by Life Technologies	31985-062	sierici ridotti
Lipofectamine 2000 Reagente per trasfezione	Invitrogen	11668027	Reagente 1
X-tremeGENE HP DNA Reagente per trasfezione	6366236001 Roche		2
DAPI Soluzione colorante	Beyotime	C1006
DiI	Beyotime	C1036
Terreno di montaggio antidissolvenza	Beyotime	P0126
Paraformaldeide	Sinopharm Chemical Reagent Co. (SCRC)	80096618
Coltura cellulare da 100 mm	CORNING	430167
Piastra a 6 pozzetti	ExCell Bio	CS016-0092
piastra a 12 pozzetti	ExCell Bio	CS016-0093
Vetro di copertura	NEST	801007
Vetrini per microscopio	Citoglas	10127105P-G
Thermo Scientific Forma CO2 Incubatore	Thermo	3111
TCS SP5II microscopio confocale a scansione laser	Leica