Un metodo semplice per identificare le cinasi che regolano la pluripotenza delle cellule staminali embrionali mediante screening di inibitori ad alta percentuale

Sommario

Qui presentiamo un protocollo quantitativo e scalabile per eseguire schermate di piccole molecole mirate per i regolatori di chinasi della transizione pluripotente con primato naïve.

Abstract

Le cellule staminali embrionali (ESC) possono auto-rinnovarsi o differenziarsi in tutti i tipi di cellule, un fenomeno noto come pluripotenza. Sono stati descritti diversi stati pluripotenti, chiamati pluripotenza "naïve" e "primed". I meccanismi che controllano la transizione naïve-primed sono poco compresi. In particolare, siamo ancora poco informati sulle chinasi di proteine ​​che specificano stati pluripotenti naïve e primed, nonostante la crescente disponibilità di composti di utensili di alta qualità per la funzione di chinasi di sonda. Qui descriviamo una piattaforma scalabile per eseguire schermature di piccole molecole mirate per i regolatori di chinasi della transizione pluripotente con primato naïve in ESC del mouse. Questo approccio utilizza semplici condizioni di coltura cellulare e reagenti standard, materiali e attrezzature per scoprire e convalidare inibitori di chinasi con effetti fino ad oggi non apprezzati sulla pluripotenza. Discutiamo le potenziali applicazioni per questa tecnologia, tra cui lo screening di altre piccole molecoleRaccolte come inibitori sempre più sofisticati di chinasi e librerie emergenti di composti di utensili epigenetici.

Introduzione

Le cellule staminali embrionali (ESC) hanno la capacità di auto-rinnovare o differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula nel corpo adulto, fenomeno noto come pluripotenza ¹ . Recenti testimonianze indicano che esistono stati pluripotenti distinti nello sviluppo, chiamati pluripotenza "naïve" e "primed" ² . Gli ESC Naïve rappresentano uno stato di sviluppo simile a quello trovato nell'embrione preimplantato ³ . Al contrario, ESC pluripotenti primati sono pronti per uscire dalla pluripotenza e differenziarsi in linee embrionali specializzate ^{4 , 5} .

Gli stati pluripotenti naïve e primati sono contrassegnati da reti regolatori genetiche distinte. La pluripotenza naïve è caratterizzata dall'espressione di fattori di trascrizione pluripotenziali chiave come Nanog, Krueppel-like fattori di trascrizione (Klfs), Rex1 ² e Esrrb 6. Nei ESC dei topi (mESC), la pluripotenza iniziata è caratterizzata da una ridotta espressione di marcatori naïve e da una specifica firma di espressione genica che include la de novo DNA metiltransferasi Dnmt3b ⁷ . In vivo , le cellule staminali epiblast (EpiSCs) ^{4 , 5} impiegate in pluripotenza primaria hanno inoltre espresso il marker Epiblast Fgf5 e marcatori di primogenitura di lineage come Brachyury ⁸ .

I mESC forniscono un modello tracciato per sondare meccanismi che controllano le transizioni pluripotenti iniettate a iniezione in vitro . Quando si coltivano in fattore di inibizione delle leucemie (LIF) e serum bovino fetale (FBS), i mESC subiscono una transizione dinamica tra stati pluripotenti naïve e primed ^{9 , 10} . Funzioni di segnalazione LIF-Jak-Stat3 per promuovere una rete di regolazione genica naïve ¹¹ , mentre la segnalazione autocrina attraverso il fattore di crescita del fibroblasto 4 (Fgf4) Erk1 / 2 percorre la transizione allo stato iniziale ¹² . Tuttavia, rimane una sfida per valutare sistematicamente il ruolo delle proteine ​​chinasi nel specificare distinti stati pluripotenti.

Qui descriviamo una piattaforma quantitativa e scalabile che consente di eseguire schermature di piccole molecole mirate per i regolatori di chinasi della transizione pluripotente con primato naïve. Usiamo semplici condizioni di coltura mESC e reagenti standard, materiali e attrezzature per scoprire e convalidare inibitori di chinasi con capacità fino a oggi non apprezzata per stabilizzare la pluripotenza ingenua. Inoltre discutiamo potenziali applicazioni estese per questa tecnologia, anche per lo screening di altre collezioni di piccole molecole, come le librerie di inibitori emergenti che mirano a regolatori epigenetici.

Protocollo

1. Collazione di librerie di inibitori di piccole molecole

1. Librerie di inibitori di collazione di collezioni di inibitori di chinasi pubblicamente accessibili, ad esempio Biblioteca di Integrated Network Signature Cellular (LINCS) della Harvard Medical School, una raccolta mirata di 228 potenti e selettivi selettori di chinasi (http://lincs.hms.harvard.edu) , E il Set di inibitori della proteina (PKIS), una collezione composta 376 assemblata da ricercatori industriali (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) ¹³ . In alternativa, assemblare una raccolta di inibitori chinasi su misura da composti disponibili in commercio.
   NOTA: Nel nostro laboratorio abbiamo assemblato una raccolta di 72 inibitori potenti e selettivi di chinasi di attrezzi che coprono 51 chinasi di destinazione primarie, tutte disponibili da fonti commerciali.
2. Assemblare inibitori di chinasi in piastre a 96 pozzetti per un'elaborazione ottimale di elevata produttività a diverse concentrazioni (usa 1, 0,1 aNd 0,01 mM). Includere in ogni pozzetto di controllo delle piastre contenenti solo DMSO e inibitori di controllo di riferimento PD173074 (FGFRi) e Ruxolitinib (JAKi), che sono noti per promuovere rispettivamente stati pluripotenti naïve e primed. Annotare in un foglio di calcolo o un software simile.

2. Condizioni e procedure di cultura del mESC per la preparazione dello schermo

1. Preparare i piatti da 10 cm di gelato rivestiti allo 0,1% aggiungendo 5 ml di gelatina 0,1% (w / v) a piastre da 10 cm e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Aspirare la gelatina e lasciare la piastra secca per 2 min.
2. Coltivare qualsiasi linea standard mESC a 37 ° C 5% CO ₂ su 0,1% piastre rivestite in gelatina da 10 cm in media mESC media (vedi tabella materiali) contenenti 100 ng / ml GST-LIF, 10% fetale calf serum e 5% Knockout serum Sostituzione. Sostituire i supporti ogni giorno e passare i mESC a circa 80% confluenza ogni secondo giorno ad una diluizione di 1: 5-1: 10.
3. Per passare i mESC, aspirare i supporti e lavare con 5 ml oF salina fosforata tamponata (PBS) per piastra.
4. Aggiungere 1 mL di trysina-EDTA (0,05% di Trypsina, 0,02% EDTA) per piastra di mESC e incubare a 37 ° C per 10 minuti.
5. Resuspendere le cellule trypsinizzate in 4 mL di supporto mESC e centrifugare a 1.200 giri / min per 5 min.
6. Riposizionare completamente il pellet cellulare in 5 ml di media mESC, pipettando su e giù per generare una sospensione di una singola cellula.
7. Contare le cellule combinando una sospensione cellulare di 10 μl e 10 μL di Trypan Blue (0,4%). Inserire in una camera di conteggio delle celle o utilizzare un emocytometro e un microscopio leggero.
8. Sementi 3 x 10 ³ mESC in piastre a 96 pozzetti rivestiti con gelatina del 0.1%, volume finale 100 μL di supporti, utilizzando una pipetta multicanale.
9. Applicare inibitori di chinasi a diluizione 1: 100 (inibitore di 1 μl aggiunto a 100 μL di supporto) utilizzando una pipetta multicanale. Infine pipetta media per mescolare l'inibitore e la sospensione cellulare, quindi lasciare che le cellule si stabiliscano in una cappa di coltura tissutale per 1 h per garantire una distribuzione uniforme acroSs la superficie di placcatura. Le cellule di coltura per 48 h senza cambiare il supporto.
   NOTA: Le lastre di riserva di 1 / 0,1 / 0,01 mM daranno una concentrazione finale di inibitori rispettivamente di 10/1 / 0,1 μM. Si consiglia di avviare lo schermo ad una concentrazione finale di 1 μM per assicurare un'efficace inibizione delle chinasi di destinazione primaria riducendo al minimo gli effetti fuori bersaglio.

3. Analisi della screening di inibitori della chinasi

1. Lavare le piastre mESC a 96 pozzetti in 200 μl di PBS usando aspiratore e pipette multicanale.
2. Realizzare gli estratti di cellule in 150 μl di tampone di lisi (20 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40 (v / v), 0,5% sodio deossicolato (w / v), 10 mM β-glicerofosfato , 10 mM di sodio pirofosfato, 1 mM NaF, 2 mM Na ₃ VO ₄ , Completi Compresi di Proteas Inhibitore Cocktail).
3. Determinare gli estratti per centrifugazione a 1.500 xg per 30 minuti in piastre a 96 pozzetti a fondo V.
4. Immobilizzare 100 μL di supernatanti su un nitrocelMembrana lulosa utilizzando un collettore a macchia a vuoto a 96 pozzetti.
5. Asciugare la membrana e macchiare con 40 ml di Ponceau S per garantire un trasferimento costante.
6. Lavare la membrana con TBST e bloccare il latte TBST / 3% (w / v).
7. Incubare in anticorpi Nanog e Dnmt3b a una diluizione di 1: 1.000 (v / v) in TBST / 3% (w / v) di latte in polvere durante la notte.
8. Lavare le membrane in 3 x 10 min in TBST e incubare in 30 mL di anticorpi secondari ad una diluizione di 1: 10.000 (v / v) nel latte TBST / 3% (w / v).
9. Sviluppare utilizzando un sistema di imaging digitale immunoblotting.
   NOTA: se possibile, utilizzare l'immunoblotting quantitativo di fluorescenza per rilevare Nanog e Dnmt3b. Tuttavia, il segnale di fondo per Dnmt3b da immunoblotting a fluorescenza è troppo elevato. Pertanto, vengono impiegati anticorpi anti-coniglio (Nanog) e anti-mouse-HRP (Dnmt3b) a fluorescenza da 800 nm.

4. Analisi dei dati dello schermo e valida degli inibitori come regolatori pluripotenziali Bona Fide

NOTA: Si tratta di un passo fondamentale per garantire che solo i moduli di pluripotenza in buona fede siano identificati. E 'essenziale per inibitori di triage basati sia sul rapporto Nanog: Dnmt3b che sul segnale complessivo, per garantire che gli inibitori di chinasi che influenzino negativamente la sopravvivenza del mESC non siano selezionati per ulteriori analisi.

1. Quantificare il segnale Nanog e Dnmt3b utilizzando il software di analisi immunoblotting e importare i valori in un foglio di calcolo o in un software simile. Calcola il rapporto Nanog: Dnmt3b per tutti i campioni rispetto al controllo DMSO. Inoltre, determinare il totale del segnale Nanog e Dnmt3b per garantire che gli inibitori della chinasi non influenzino il rapporto Nanog: Dnmt3b modificando la vitalità del mESC.
2. Utilizzare i rapporti Nanog: Dnmt3b per identificare gli inibitori che promuovono la pluripotenza ingenua (Nanog: rapporto Dnmt3b superiore al controllo) e la pluripotenza primaria (rapporto Nanog: Dnmt3b inferiore al controllo). Impostare il cut-off a 2 ° deviazione dai valori di controllo e filtrare gli inibitori di chinasi che producono un segnale totale Nanog + Dnmt3b inferiore aIl 50% del valore di controllo DMSO per generare un'elevata lista di fiducia degli inibitori di chinasi che stabilizzano stati pluripotenti a livello naïve (rapporto High Nanog: Dnmt3b) e primati (basso Nanog: Dnmt3b ratio).
3. Validare gli inibitori della chinasi mediante la semina di mESC a 2 x 10 ⁵ cellule per 6 pozzetti in 2 mL di media e aggiungere inibitori di chinasi a 1 μM per 48 h senza cambiare supporto.
4. Lyse mESCs nel buffer di lisi e analizzare l'espressione di Nanog e Dnmt3b mediante immunoblotting convenzionale SDS-PAGE.
5. Inoltre convalidare i colpi con l'immunoblotting SDS-PAGE per i marker naif pluripotenza Klf2 e Klf4 e Oct4 per assicurare che la pluripotenza sia mantenuta dopo un trattamento inibitore di 48 ore.

Risultati

Utilizzando la procedura presentata qui ( Figura 1 ), viene visualizzata la libreria LINCS di 228 inibitori potenti e selettivi di chinasi per identificare quelli che modulano la pluripotenza del mESC. La biblioteca viene preparata ad una concentrazione di 0,1 mM per una diluizione 1: 100 e la concentrazione finale di screening di 1 μM nei mESC. 48 h più tardi, i mESCs sono stati lisati e gli estratti preparati per l'analisi quantitativa di macchie a macchia di Nanog e Dnmt3b espressione ( Figura 2 , in alto). I risultati di altre concentrazioni di screening non sono qui rappresentati per brevità. Nanog: il rapporto Dnmt3b è determinato per ogni inibitore delle chinasi e i composti classificati e un cut-off 2x applicato ( Figura 2 , in basso). Il totale del segnale Nanog e Dnmt3b relativo al controllo è sovrapposto alla classifica degli inibitori e sottoposto a una cut-off di 0,5x per consentire la triificazione degli inibitori che mostrano una significativa tossicità del mESC. Selezionare inibitori di chinasi che stabilizzano la stabilità naïveSono convalidate utilizzando convenzionali nanoblocco di Nanog / Dnmt3b ( Figura 3 ). Gli obiettivi primari di chinasi di questi inibitori sono presentati nella Tabella 1 . Inoltre dimostriamo l'applicabilità di questo schermo per identificare inibitori che stabilizzano lo stato iniziato ¹⁴ .

Figura 1: Flusso di lavoro per la screening di inibitori di chinasi che modulano la transizione naïve-primed. Il mESC è stato trattato con una libreria di inibitori della chinasi di composto 228 ad una concentrazione finale di 1 μM. I lisati sono stati preparati e trasferiti su membrane di nitrocellulosa per l'analisi immuno dot-blot e determinati i livelli di Nanog e Dnmt3b (Figura adattata da Williams e altri ¹⁴ ). Clicca qui per visualizzare al Versione di questa figura.

Figura 2: Analisi dello schermo di pluripotenza a iniqua e identificazione dell'inibitore. (Top) Rappresentative Nanog e Dnmt3b immuno dot-blot immagini. (In basso) I valori Nanog e Dnmt3b per ciascun inibitore di chinasi sono stati determinati rispetto al controllo DMSO e sono stati determinati i rapporti Nanog: Dnmt3b e il relativo rapporto Nanog + Dnmt3b e gli inibitori classificati in confronto al controllo DMSO. Gli inibitori trovati per alterare il rapporto Nanog: Dnmt3b oltre una soglia di 2 volte sopra o sotto il controllo DMSO sono stati identificati come driver della pluripotenza naïve o primata. Una soglia di 2x sotto il controllo DMSO è stata impostata per inibitori di triage che compromettono la sopravvivenza del mESC. Sono evidenziati gli inibitori selezionati per l'ulteriore validazione. (Figura adattata da Williams e altri ¹⁴ ).S / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Validazione di composti di successo selezionati identificati. I mESC sono stati trattati con 1 μM AZD4547 (un inibitore selettivo di FGFR) o gli inibitori indicati dallo schermo in Figura 2. Nanog: i livelli di Dnmt3b determinati con standard SDS-PAGE e analisi immunoblot. I valori numerici del relativo Nanog: Dnmt3b e Nanog + Dnmt3b sono indicati nella tabella sottostante e inibitori che stabilizzano lo stato pluripotente ingenuo evidenziato in verde. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Composto	Obiettivi primari		Altri obiettivi
AV-951	VEGFR
HG-6-64-01	ABL, BRAF, RET, CSF1R, EGFR, EPHA8, FGFR, FLT3, KIT, LOK, MAP4K1, p38b, MUSK, PDGFR, TAOK3, TNNI3K
WH-4-023	Lck		src
R406	Syk
GW-572016	HER2		EGFR
KIN001-244	PDK1
WZ-4-145	CSF1R, DDR1, EGFR, TIE1, PDGFR2
WZ-7043	CSF1R, DDR1, FGFR e TAO1
GW786034	VEGFR1		VEGFR2, VEGFR3 &# 160;
AZD-1480	JAK2

Tabella 1: Composti selezionati e loro target primario di chinasi.

Discussione

Qui dimostriamo una metodologia ampiamente accessibile per sondare il ruolo delle vie di segnalazione di chinasi nella regolazione della transizione pluripotente con primato naïve. Questo affronta una domanda fondamentale nel campo ESC. Sebbene gli approcci di genomica ad alta trasmissione e di transcriptomics siano utilizzati abitualmente per identificare i regolatori trascrizionali chiave di stati pluripotenti naïve e innescati, la chiarificazione delle reti di segnalazione di pluripotenza si è dimostrata impegnativa. Ora forniamo una strategia flessibile che impiega gli inibitori chimici per identificare le chinasi che controllano la transizione pluripotente iniettabile a livello mESC. Questo si basa su semplici apparecchiature, reagenti e materiali che sono disponibili per la maggior parte dei laboratori che studiano la segnalazione delle cellule e la biologia ESC. Critico per il successo di questa piattaforma è il nostro sviluppo di un saggio robusto per quantificare la transizione tra stati pluripotenti naïve e primed. La creazione di questo test ha richiesto significative modificazioni iterative alla cell platDensità, tempo di incubazione degli inibitori e condizioni di immunoblotting.

Gli approcci di piccole molecole stanno guadagnando trazione per un uso razionale nelle applicazioni ESC terapeutiche ^{15 , 16} . Una grande forza di screening di piccole molecole è che i composti degli utensili sono progettati e / o modificati per una efficiente assorbimento cellulare. L'efficienza della trasfusione non è limitativa e l'uso di sistemi di erogazione pericolosi come il lentivirus non è necessario. Inoltre, gli inibitori inibiscono frequentemente molteplici isoforme all'interno di una famiglia di chinasi ( es. Fgfr1-4, Jak1-3), che supera la ridondanza funzionale che ostacola le tecniche di interferenza genetica / genomica come RNAi e CRISPR / Cas9. Poiché i composti di utensili più potenti e selettivi diventano disponibili sia dai programmi accademici che da quelli farmaceutici, le chinasi sottoelencate e poco comprese saranno spinte in prima linea nella ricerca ESC. Proponiamo pertanto questo alto livelloL'approccio di screening dei ruderi aprirà nuovi percorsi di ricerca nelle reti normative del sistema ESC.

Una limitazione minore di questa tecnologia è che anche gli inibitori di piccole molecole più potenti e selettivi impegnano e inibiscono più chinasi non correlati in vivo . Tuttavia, i dati sempre più complessi di profilassi di inibitori di chinasi consentono di identificare facilmente gli obiettivi funzionali degli inibitori di chinasi (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase -inibitori). Infine, in linea di principio la nostra piattaforma può essere applicata per interrogare ogni collezione di piccole molecole e / o il dosaggio cellulare per cui sono disponibili anticorpi immunoblottanti di alta qualità. Ciò consentirà di studiare più sistemi regolatori in regolazione pluripotenziaria e facilitare l'identificazione di inibitori di piccole molecole che modificano diversi processi cellulari. In particolare, si pensa che l'applicazione di piccole molecole emergenti come l'epigeneLe sonde TIC sviluppate dal Consorzio di Genomica Strutturale (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics) hanno il potenziale per scoprire ulteriori nuovi regolatori di transizioni pluripotenti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
mESC media
CCE mESC	ATCC	ATCC  SCRC-1023
DMEM Media	Gibco	11965092
L-Glutammina	Gibco		25030081 Finale: 2 mM
Penicillina/Streptomicina	Gibco		15140122 Finale: 50 U/ml
2-mercaptoetanolo	Sigma	M6250	Finale: 0,1 mM
Fattore inibitorio della leucemia (fusione GST)	Reagenti e servizi		Finale: 100 ng/mL
Fattore inibitorio della leucemia	Thermo	PMC9484	Finale: 100 ng/mL
aminoacidi non essenziali	Gibco	11140050	Finale: 0,1 mM
di piruvato di sodio	Gibco		11360070 Finale: 1 mM
Siero di sostituzione KnockOut	Invitrogen	10828-028	Finale: 5%
Siero fetale bovino definito	Fisher	10703464	Finale: 10%
Name	Company	Numero di catalogo	Comments
TC materials
Trypsin-EDTA (0.05%), rosso fenolo	Thermo	25300054
Gelatina da pelle suina	Sigma	1890
Nunc MicroWell 96-Well Microplates	Thermo	156545
DPBS, senza calcio, senza magnesio	Gibco	14190136
V-bottom 96 pozzetti	piastre Greiner Bio-one	651261
Name	Company<	strong>Numero catalogo	Comments
Tampone di lisi
Tris tampone	VWR	103157P
Cloruro di sodio	VWR	97061
EDTA	Sigma	E4884
1% NP-40	Sigma	9016-45-9
Sodio Desossicolato	Sigma	D6750-100g
β-glicerofosfato	Sigma	G9422
Pirofosfato di sodio	Sigma	13472-36-1
Fluoruro di sodio	Sigma	450022
Ortovanadato di sodio	Sigma	450243
Roche Cocktail completo di inibitori della proteasi	Sigma	CO-RO
strong>Name	Company	Numero di catalogo	Comments
Chemicals
Tween	Sigma	P1379-1L
Latte in polvere	Marvel
Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Western Blotting
Protran BA 85 Nitrocellulosa 0,45 &micor; M  Dimensione dei pori (20 cm x 20 cm Fogli) (25 fogli)	GE	10401191
Ponceau S	Sigma	P7170-1L
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Attrezzatura da laboratorio
Minifold I Sistema	GE	10447850
ChemiDoc imager	BioRad	1708280
LiCor Odyssey Imager	LiCor
Name	Company	Numero di catalogo	Comments
Antibodies
Anti-mouse Nanog	Reprocell	RCAB001P
Anti-Dnmt3b	Imgenex	IMG-184A
IRDye 800CW Asino anti-coniglio	Licor	926-32213
Tecnologia di segnalazione cellulare	anti-topo-HRP	7076S
Anti-Klf2	Millipore	09-820
Anti-Klf4	R & D Systems	AF3158
Anti-Oct4	Santa Cruz	sc-5279