Articolo metodologico

Protocolli per la visualizzazione steroidogenica organi e dei loro organi interattivi con Immunocolorazione nella mosca della frutta Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/55519

⸱

14 aprile 2017

 ,  ,  , 
1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Life Science Center of Tsukuba Advanced Research Alliance, University of Tsukuba, 3Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Descriviamo un protocollo per la dissezione, la fissazione, e immunocolorazione di organi steroidogeniche in Drosophila larve e adulti femmine per studiare steroidi biosintesi dell'ormone e del suo meccanismo di regolazione. Oltre agli organi steroidogenici, visualizziamo l'innervazione degli organi steroidogeniche così come cellule bersaglio steroidogeniche come le cellule staminali germinali.

Abstract

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Negli organismi multicellulari, un piccolo gruppo di cellule è dotato di una funzione specializzata nella loro attività biogenica, inducendo una risposta sistemica crescita e la riproduzione. Negli insetti, ghiandola larvale prothoracic (PG) e le femmine adulte azione ovaio ruoli essenziali biosynthesizing principali ormoni steroidei chiamati ecdysteroids. Questi organi ecdysteroidogenic sono innervati dal sistema nervoso, attraverso cui la temporizzazione della biosintesi è influenzato da stimoli ambientali. Qui si descrive un protocollo per la visualizzazione degli organi e dei loro organi ecdysteroidogenic interattivi in larve e adulti della mosca della frutta Drosophila melanogaster, che fornisce un sistema modello adatto per lo studio ormone steroide biosintesi e il suo meccanismo di regolazione. dissezione abile permette di mantenere le posizioni degli organi ecdysteroidogenic e dei loro organi interattivi compreso il cervello, il cordone nervoso ventrale, e altri tessuti. Immunocolorazione con unntibodies contro enzimi ecdysteroidogenic, insieme a proteine ​​transgeniche fluorescenza guidati dai promotori tessuto-specifici, sono disponibili per marcare le cellule ecdysteroidogenic. Inoltre, i innervazione degli organi ecdysteroidogenic possono anche essere etichettati da anticorpi specifici o una serie di driver GAL4 in vari tipi di neuroni. Pertanto, gli organi ecdysteroidogenic e le loro connessioni neuronali possono essere visualizzati simultaneamente mediante immunocolorazione e tecniche transgeniche. Infine, si descrive come visualizzare le cellule staminali germinali, la cui proliferazione e manutenzione sono controllate da ecdysteroids. Questo metodo contribuisce alla comprensione globale di steroide biosintesi dell'ormone e del suo meccanismo di regolazione neuronale.

Introduzione

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Negli organismi multicellulari, un gruppo di celle è dotato di una funzione specializzata nella loro attività biogenica che è essenziale per tutto il corpo. Assolvere i loro compiti, ogni tessuto o organo esprime una serie di geni correlati alle loro funzioni e comunica con altri tessuti orchestrare loro attività nel contesto dello sviluppo. Caratterizzare tali funzioni cellulari specializzate e interazioni tra organi, è necessario specificare un gruppo di celle insieme ad altri tipi di celle essendo mantenuta intatta nell'architettura multicellulare.

Un esempio di tali organi specializzati è un organo steroidea, dove molti enzimi bio....

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Protocollo

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NOTA: Lo schema generale dei protocolli è mostrato in Figura 1.

1. La dissezione del larvale Anello Gland (RG)

NOTA: In D. melanogaster, che appartiene alla Ditteri cyclorrhaphous, il PG è all'interno di un organo endocrino composito chiamato ghiandola anello (RG, Figura 2D). Poiché è irrealizzabile che il PG è chirurgicamente separato da altri tipi di cellule (discussi in seguito), un obiettivo pratico è isolare intatto, RG indenne da dissezione.

  1. Preparazione di larve nelle fasi di sviluppo adeguati <....

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Risultati

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Abbiamo usato i protocolli di cui sopra per visualizzare gli organi steroidogenici e dei loro organi interattivi in D. melanogaster larve e adulti di sesso femminile. Lo schema generale di protocolli è mostrato in Figura 1.

RG, compreso il PG (Figura 2D), è più piccolo e più trasparente del cervello e si trova sul lato antero-dorsale del cervello (Figura 2A-C e 3A-E). Per marcare le cellule PG, molti gruppi hanno generato vari tipi di anticorpi contro enzim.......

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Discussione

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Abbiamo studiato biosintesi ecdysteroid e il suo meccanismo di regolazione in D. melanogaster, ed ideato un protocollo per la dissezione e immunocolorazione. I tempi di biosintesi ecdysteroid è influenzato da stimoli ambientali attraverso ingressi neuronali 33, quindi è essenziale per mantenere l'innervazione degli organi ecdysteroidogenic insieme al cervello, VNC, e altri tessuti durante la dissezione.

Come descritto sopra, il D. melanogaster PG.......

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Reiko Kise e Tomotsune Ameku per il loro supporto tecnico per questo lavoro. Siamo anche grati a Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, il Bloomington Drosophila Stock Center, Kyoto Stock Center (DGRC), e il Developmental Studies Ibridoma Banca per le scorte e reagenti. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a YSN da JSPS KAKENHI Concessione Numero 16K20945, la Fondazione Naito, e il Premio Ricerca Scienza Inoue; e da una sovvenzione alla RN da MEXT KAKENHI Concessione Numero 16H04792.

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Materiali

Fly stocks

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
piatto per coltura di ovociti
55 mm)AS ONE1-8549-02  per succo d'uva, piastre di agar,
tazza di raccoltaHIKARI KAGAKU
, lievito secco orientale, Tokyo
100% succo d'uvaWelch Food Inc.
larve allevamento
piccole fiale (12ml, 40&volte; 23,5 mm, PS)SARSTEDT58.487
anello monousoAS ONE6-488-01
cibo  il recepi noi sul sito web del centro azionario di Blooington.
Microscopio dissection
dissectingCarl ZeissStemi 2000-C
Microscopio per dissezioneLeicaS8 AP0
piatto per coltura tissutale (35 x 10 mm, non trattato)IWAKI1000-035
SylgardTORAYper coarting all'interno di piastre
Ago Terumo (27G, 0,40 x 19 mm) TERUMONN-2719SUn "coltello" per tagliare la pinza per tessuti
, Inox, #5Dumont, Svizzera
perno per insetti (0,18 mm di diametro)Marchiodissezione del filetto
NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.MB-50-10
fissazione
acqua ultrapuraMerck Millipore
fosfato tamponato soluzione salina (PBS)
FormaldeideNacalai tesque16222-65
ParaformaldeideNacalai tesque02890-45
Triton-X100Nacalai tesque35501-15
microprovette (1,5 ml)INA OPTIKACF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker)As oneTM-300
rocker Siero bovino AlbuminaSIGMA9048-46-8
primary antibody
anti-Sro (cavia), 1:1000
anti-GFP (coniglio), 1:1000Molecular ProbesA6455Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mAb di topo, GF200), 1:100Nakarai tesque04363-66
anti-5HT (coniglio), 1:500SIGMAS5545
anti-Hts 1B1 (topo)Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)1B1
anti-DE-caderina (ratto), 1:20DSHBDCAD2
anti-nc82 (topo), 1:50DSHBnc82<
strong>secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) IgG (H+L), Alexa Fluor 488 coniugatoLife TechnologiesA-11008
Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-topo di capra, Alexa Fluor 488 coniugatoLife TechnologiesA-11001
Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-ratto di capra, Alexa Fluor 546 coniugatoLife TechnologiesA-11081
Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-porcellino d'India di capra, Alexa Fluor 555 coniugatoLife TechnologiesA-21435
Alexa Fluor 546 falloidina coniugata con coloranteLife TecnologieA-22283
Reagenti di montaggio
Vetro per vetrini Micro MatsunamiGlass Ind.,Ltd.SS7213
Vetro di copertura per microscopio quadratoMatsunami Glass Ind., Ltd.
Reagente FluorSave (Reagente di montaggio)Calbiochem345789
Pipetta di trasferimento 1 ml (Contagocce monouso)WATSON5660-222-1S
imaging
LSM700 Sistema di microscopio a scansione laserCarl ZeissAxio Observer invertito. Z1 SP left
image processing
LSM700 ZENCarl ZeissSi tratta di una speciale interfaccia utente basata sul sistema operativo Microsoft Windows7 a 64 bit
GMR45C06-GAL4  dal Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS– GFP; UAS– mCD8::GFPdoni da K. Ito, Università di Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4vedi in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010)
w; UAS-mCD8::GFP  dal Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4  dal Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)
(, pasta di lievito , per mosche standard silicone Shiga per micro forbici per C218181ImageJw;

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
  2. Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell.....

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Protocollo di immunocolorazionedissezione larvalevisualizzazione dell ovarioghiandola anulare del cervellobiosintesi degli ecdisteroidicellule staminali della linea germinaleinnervazione neuronalemarcatura fluorescente

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