Protocolli per la visualizzazione steroidogenica organi e dei loro organi interattivi con Immunocolorazione nella mosca della frutta Drosophila melanogaster

Summary

Descriviamo un protocollo per la dissezione, la fissazione, e immunocolorazione di organi steroidogeniche in Drosophila larve e adulti femmine per studiare steroidi biosintesi dell'ormone e del suo meccanismo di regolazione. Oltre agli organi steroidogenici, visualizziamo l'innervazione degli organi steroidogeniche così come cellule bersaglio steroidogeniche come le cellule staminali germinali.

Abstract

Negli organismi multicellulari, un piccolo gruppo di cellule è dotato di una funzione specializzata nella loro attività biogenica, inducendo una risposta sistemica crescita e la riproduzione. Negli insetti, ghiandola larvale prothoracic (PG) e le femmine adulte azione ovaio ruoli essenziali biosynthesizing principali ormoni steroidei chiamati ecdysteroids. Questi organi ecdysteroidogenic sono innervati dal sistema nervoso, attraverso cui la temporizzazione della biosintesi è influenzato da stimoli ambientali. Qui si descrive un protocollo per la visualizzazione degli organi e dei loro organi ecdysteroidogenic interattivi in larve e adulti della mosca della frutta Drosophila melanogaster, che fornisce un sistema modello adatto per lo studio ormone steroide biosintesi e il suo meccanismo di regolazione. dissezione abile permette di mantenere le posizioni degli organi ecdysteroidogenic e dei loro organi interattivi compreso il cervello, il cordone nervoso ventrale, e altri tessuti. Immunocolorazione con unntibodies contro enzimi ecdysteroidogenic, insieme a proteine ​​transgeniche fluorescenza guidati dai promotori tessuto-specifici, sono disponibili per marcare le cellule ecdysteroidogenic. Inoltre, i innervazione degli organi ecdysteroidogenic possono anche essere etichettati da anticorpi specifici o una serie di driver GAL4 in vari tipi di neuroni. Pertanto, gli organi ecdysteroidogenic e le loro connessioni neuronali possono essere visualizzati simultaneamente mediante immunocolorazione e tecniche transgeniche. Infine, si descrive come visualizzare le cellule staminali germinali, la cui proliferazione e manutenzione sono controllate da ecdysteroids. Questo metodo contribuisce alla comprensione globale di steroide biosintesi dell'ormone e del suo meccanismo di regolazione neuronale.

Introduction

Negli organismi multicellulari, un gruppo di celle è dotato di una funzione specializzata nella loro attività biogenica che è essenziale per tutto il corpo. Assolvere i loro compiti, ogni tessuto o organo esprime una serie di geni correlati alle loro funzioni e comunica con altri tessuti orchestrare loro attività nel contesto dello sviluppo. Caratterizzare tali funzioni cellulari specializzate e interazioni tra organi, è necessario specificare un gruppo di celle insieme ad altri tipi di celle essendo mantenuta intatta nell'architettura multicellulare.

Un esempio di tali organi specializzati è un organo steroidea, dove molti enzimi bio....

Protocol

NOTA: Lo schema generale dei protocolli è mostrato in Figura 1.

1. La dissezione del larvale Anello Gland (RG)

NOTA: In D. melanogaster, che appartiene alla Ditteri cyclorrhaphous, il PG è all'interno di un organo endocrino composito chiamato ghiandola anello (RG, Figura 2D). Poiché è irrealizzabile che il PG è chirurgicamente separato da altri tipi di cellule (discussi in seguito), un obiettivo pratico è isolare intatto, RG indenne da dissezione.

1. Preparazione di larve nelle fasi di sviluppo adeguati <....

Results

Abbiamo usato i protocolli di cui sopra per visualizzare gli organi steroidogenici e dei loro organi interattivi in D. melanogaster larve e adulti di sesso femminile. Lo schema generale di protocolli è mostrato in Figura 1.

RG, compreso il PG (Figura 2D), è più piccolo e più trasparente del cervello e si trova sul lato antero-dorsale del cervello (Figura 2A-C e 3A-E). Per marcare le cellule PG, molti gruppi hanno generato vari tipi di anticorpi contro enzim.......

Discussion

Abbiamo studiato biosintesi ecdysteroid e il suo meccanismo di regolazione in D. melanogaster, ed ideato un protocollo per la dissezione e immunocolorazione. I tempi di biosintesi ecdysteroid è influenzato da stimoli ambientali attraverso ingressi neuronali ^33, quindi è essenziale per mantenere l'innervazione degli organi ecdysteroidogenic insieme al cervello, VNC, e altri tessuti durante la dissezione.

Come descritto sopra, il D. melanogaster PG.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
piatto per coltura di ovociti
55 mm)	AS ONE	1-8549-02	per succo d'uva, piastre di agar,
tazza di raccolta	HIKARI KAGAKU
	, lievito secco orientale, Tokyo
100% succo d'uva	Welch Food Inc.
larve allevamento
piccole fiale (12ml, 40&volte; 23,5 mm, PS)	SARSTEDT	58.487
anello monouso	AS ONE	6-488-01
cibo			il recepi noi sul sito web del centro azionario di Blooington.
Microscopio dissection
dissecting	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
Microscopio per dissezione	Leica	S8 AP0
piatto per coltura tissutale (35 x 10 mm, non trattato)	IWAKI	1000-035
Sylgard	TORAY		per coarting all'interno di piastre
Ago Terumo (27G, 0,40 x 19 mm)	TERUMO	NN-2719S	Un "coltello" per tagliare la pinza per tessuti
, Inox, #5	Dumont, Svizzera
perno per insetti (0,18 mm di diametro)	Marchio		dissezione del filetto
	NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.	MB-50-10
fissazione
acqua ultrapura	Merck Millipore
fosfato tamponato soluzione salina (PBS)
Formaldeide	Nacalai tesque	16222-65
Paraformaldeide	Nacalai tesque	02890-45
Triton-X100	Nacalai tesque	35501-15
microprovette (1,5 ml)	INA OPTIKA	CF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker)	As one	TM-300
rocker Siero bovino Albumina	SIGMA	9048-46-8
primary antibody
anti-Sro (cavia), 1:1000
anti-GFP (coniglio), 1:1000	Molecular Probes	A6455	Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mAb di topo, GF200), 1:100	Nakarai tesque	04363-66
anti-5HT (coniglio), 1:500	SIGMA	S5545
anti-Hts 1B1 (topo)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1
anti-DE-caderina (ratto), 1:20	DSHB	DCAD2
anti-nc82 (topo), 1:50	DSHB	nc82<
strong>secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) IgG (H+L), Alexa Fluor 488 coniugato	Life Technologies	A-11008
Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-topo di capra, Alexa Fluor 488 coniugato	Life Technologies	A-11001
Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-ratto di capra, Alexa Fluor 546 coniugato	Life Technologies	A-11081
Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-porcellino d'India di capra, Alexa Fluor 555 coniugato	Life Technologies	A-21435
Alexa Fluor 546 falloidina coniugata con colorante	Life Tecnologie	A-22283
Reagenti di montaggio
Vetro per vetrini Micro Matsunami	Glass Ind.,Ltd.	SS7213
Vetro di copertura per microscopio quadrato	Matsunami Glass Ind., Ltd.
Reagente FluorSave (Reagente di montaggio)	Calbiochem	345789
Pipetta di trasferimento 1 ml (Contagocce monouso)	WATSON	5660-222-1S
imaging
LSM700 Sistema di microscopio a scansione laser	Carl Zeiss		Axio Observer invertito. Z1 SP left
image processing
LSM700 ZEN	Carl Zeiss	Si tratta di una speciale interfaccia utente basata sul sistema operativo Microsoft Windows7 a 64 bit
GMR45C06-GAL4			dal Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS– GFP; UAS– mCD8::GFP			doni da K. Ito, Università di Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4			vedi in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010)
w; UAS-mCD8::GFP			dal Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4			dal Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)