Valutazione di alternanza spontanea, riconoscimento novello di oggetti e attacco degli arti nei modelli di topo transgenico Modelli di neuropathologia di Amiloide-β e Tau

Sommario

Qui descritto è un approccio scenico di screening comportamentale che può essere utilizzato per la ricerca di composti che presentano l'efficacia in vivo sui comportamenti motori cognitivi e funzionali nei modelli di topi transgenici di β-amiloidosi e tauopatia. Questi metodi sono ottimizzati per schermare composti per attività in attività di memoria a breve termine e di lavoro.

Abstract

Qui descriviamo un approccio sistematico di test comportamentale che può essere utilizzato per la ricerca di composti che presentano l'efficacia in vivo sui comportamenti motori cognitivi e funzionali nei modelli di topi transgenici di β-amiloidosi e tauopatia. Il paradigma include i test per l'alternanza spontanea in un labirinto Y, il nuovo riconoscimento degli oggetti e il clasping degli arti. Questi test sono stati selezionati in quanto: 1) interrogare la funzione dei domini cognitivi o motori e la circuiteria neurale correlata pertinente allo stato di malattia umana, 2) avere definiti punti definiti, 3) avere controlli di controllo di qualità facilmente implementabili, 4) essere eseguiti Un formato di throughput moderato e 5) richiedono un piccolo intervento da parte dell'investigatore. Questi metodi sono progettati per gli investigatori che cercano di schermare composti per attività in attività di memoria a breve termine o di lavoro o comportamenti motori funzionali associati ai modelli di topi di Alzheimer. I metodi qui descritti usano test comportamentali che engEtà diverse regioni del cervello, tra cui ippocampo e varie aree corticali. Gli investigatori che desiderano test cognitivi che specificamente valutano la cognizione mediata da una singola regione del cervello potrebbero utilizzare queste tecniche per completare altri test comportamentali.

Introduzione

La malattia di Alzheimer (AD) è un disturbo neurodegenerativo progressivo che si traduce in un debilitante declino cognitivo che colpisce circa 44 milioni di persone in tutto il mondo. Attualmente non esistono trattamenti disponibili per l'AD che sono modificando le malattie, sottolineando l'urgente necessità di scoperta preclinica di nuove strategie terapeutiche per questa malattia. Sono stati creati diversi modelli di mouse transgenici che ricapitolano vari aspetti dell'AD ^{1 , 2} , inclusi i disordini nei domini cognitivi interrotti nei pazienti ³ . Questi modelli di topo rappresentano uno strumento utile per facilitare lo screening efficiente in vivo .

Nel valutare un composto per un'efficacia potenziale in vivo occorre prendere in considerazione un approccio graduale che controlla l'efficacia nei domini cognitivi appropriati e controlla anche comportamenti che potrebbero influenzare gli endpoint specifici utilizzati perCognizione ssess. Molti modelli di topi transgenici di AD mostrano iperattività e altri comportamenti che possono interferire con un particolare test cognitivo e vietare il suo utilizzo nello screening della droga ⁴ . Inoltre, per un approccio da attuare in un ambiente di screening di droga, i particolari test utilizzati dovrebbero sostenere almeno un rendimento medio, avere punti definiti chiaramente e una procedura che richiede un minimo intervento da parte degli investigatori. Utilizzando questi criteri, possono essere implementati schermi comportamentali che presentano la riproducibilità, la bassa varianza intra-e inter-assay e le dimensioni degli effetti necessari per lo screening composto. In dettaglio qui sono i metodi che abbiamo utilizzato per la ricerca di composti efficaci per mitigare i fenotipi cognitivi e motori presenti nei modelli di topi transgenici di β-amiloidosi e tauopatia ^{5 , 6} . I metodi descritti sono adattati da paradigmi comportamentali comunemente usati nel lIteratura ⁷ , con ottimizzazioni specifiche e controlli di controllo della qualità in modo che possano essere utilizzati nei modelli di topi transgenici pertinenti all'AD. Questo protocollo può essere utilizzato con una varietà di sistemi di acquisizione dati e di analisi e suppone che l'investigatore ha una conoscenza di lavoro del software associato.

Protocollo

I metodi descritti in questa pubblicazione sono stati riesaminati dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) presso i laboratori di Hilltop Laboratory per garantire la corretta cura, l'uso e il trattamento umano degli animali in conformità alle leggi e regolamenti federali, statali e locali applicabili. Come i regolamenti federali del benessere degli animali o gli AWR (CFR 1985) e la politica sanitaria pubblica sulla cura e l'uso umano di animali da laboratorio o la politica PHS (PHS 1996).

1. Linee guida generali per tutte le valutazioni comportamentali

1. Prima di ogni manipolazione degli animali, coprire le gabbie esistenti con una nuova gabbia che indica solo l'identificatore animale unico e cieco.
   NOTA: Gli investigatori che gestiscono i topi durante il dosaggio composto / placebo di routine non sono autorizzati a gestire i topi per la valutazione comportamentale.
2. Spegni o spegni le luci di soffitto e regola l'illuminazione in modo che l'illuminazione al pavimento dell'arena o il labirinto sia di 30-35 lux.
3. FO studi che durano diverse settimane, registrano pesi del corpo settimanalmente come misura indiretta di salute generale.
   NOTA: Ulteriori controlli a gabbia per la qualità del cappotto, la postura, l'andatura e la locomozione spontanea possono essere inclusi se sono più garantiti i controlli sanitari più robusti.

2. Mouse abituale a gestire dagli investigatori

1. Due giorni prima di qualsiasi test comportamentale, abituate i topi alla manipolazione. Rimuovere la gabbia dal rack e posizionare su una superficie di livello.
2. Rimuovere il coperchio dalla gabbia. Maneggiare il mouse esattamente come gestire durante la prestazione del prossimo test comportamentale. Posizionare il mouse in una mano cupped sopra la gabbia di casa.
3. Misurare la latenza per saltare dalla mano del ricercatore nella gabbia di casa. Tenere i topi per un massimo di 5 s.
   NOTA: I topi che presentano latenze di ≥2 s sono considerati "abituati". I topi che presentano latenze <2 s durante la prima prova subiscono 2 ulteriori abitudiniN sessioni quel giorno.
4. Avere i topi sottoposti a 2 giorni consecutivi di trattamento di abitudini. Nota qualsiasi mouse che non sia abituato entro la fine del giorno 2.

3. Valutazione della memoria di lavoro spaziale misurando l'alternanza spontanea in un labirinto Y

1. Prima dell'uso iniziale, pulire accuratamente il labirinto Y con un detersivo germicida candeggiante, 70% EtOH, seguito da dH ₂ O ⁹ . Definire chiaramente le braccia del labirinto come 'A', 'B' & 'C' o altri identificatori univoche simili.
2. Prima dell'avvio di una sessione di test, impostare il sistema di acquisizione dati o videocamere e impostare il monitoraggio appropriato dei topi nel labirinto. Calibrare la distanza nel labirinto utilizzando immagini video catturate di un righello o di un altro oggetto di lunghezza nota.
   NOTA: i metodi comportamentali di questa procedura funzioneranno con una varietà di sistemi di acquisizione dati e gli autori assumono alcunoL'esecuzione di questa procedura è competente nell'utilizzo del sistema di acquisizione dati scelto. Le analisi di potenza indicano che sono richiesti campioni di 10-15 mouse per gruppo per un β ≤0.2.
3. Rimuovere la gabbia dal rack e metterla delicatamente su un tavolo in prossimità del labirinto Y. Togliere il mouse dalla sua gabbia e posizionarla delicatamente in un braccio del labirinto Y, rivolto verso il centro. Fai che il detective passi abbastanza lontano dal labirinto in modo che il mouse non riesca a vedere l'investigatore.
4. Attivare il sistema di acquisizione dati / video immediatamente dopo il posizionamento del mouse nel labirinto.
5. Premere il gioco e registrare il comportamento spontaneo per ogni mouse per un periodo di 10 minuti. Una volta completata una sessione, mettere delicatamente il mouse nella sua gabbia di casa e restituire la gabbia alla cremagliera.
6. Pulire completamente il labirinto tra ciascuna sessione con una spazzola germicida candeggiante, 70% EtOH, seguita da dH ₂ O. Ripetere dalla fase 3.4 per valutare tutti i mice.
7. Una volta che tutti i topi hanno completato l'esplorazione del labirinto Y, analizzare i dati dal sistema di acquisizione o individuare manualmente i video delle sessioni. Una entrata del braccio si verifica quando tutte le 4 zampe del mouse attraversano la soglia della zona centrale e nel braccio e il naso dell'animale è orientato verso la fine del braccio.
   NOTA: Gli endpoint che verranno analizzati includono: la distanza totale percorsa nel labirinto, la distanza totale percorsa all'interno di ciascun braccio (compresa la zona centrale), il tempo totale speso in ciascun braccio (compresa la zona centrale), il numero totale di voci di braccio, Le voci fatte in ogni braccio e un elenco sequenziale di armi inserito per valutare il numero di alterazioni effettuate.
8. Una alternanza spontanea avviene quando un topo entra in un diverso braccio del labirinto in ognuna delle tre entrate consecutive. L'alternanza spontanea% viene quindi calcolata con la seguente formula.
   
   NOTA: Ad esempio, iF l'ordine di inserimento del braccio è stato: ABCCBABCABC, il ricercatore avrebbe ottenuto un totale di 6 alterazioni spontanee (in ordine: ABC, CBA, ABC, BCA, CAB, ABC). Con un totale di 11 bracci, l'alternanza spontanea% sarebbe stata del 67%.
9. Eseguire i seguenti controlli di controllo di qualità per assicurare che i dati rappresentino una valutazione imparziale di alternanza spontanea.
   1. Esegui una correlazione di Pearson di alternanza spontanea% sia alla distanza totale percorsa che al numero di voci di arma effettuate.
      NOTA: Se esiste una correlazione significativa dell'alternanza spontanea% a ciascun parametro, i dati dovrebbero essere ulteriormente esaminati a causa della potenziale influenza della locomozione iperdinamica sull'apposito endpoint cognitivo ¹⁰ .
   2. Analizzare il numero di voci fatte in ciascun braccio con un test ANOVA a 1 via.
      NOTA: se questa analisi è significativa, ciò indica la presenza di segnali nell'ambiente che hanno attirato topi a un particolare regiSul labirinto.

4. Valutazione della memoria di riconoscimento intermedio mediante misurazione del riconoscimento di oggetti novelli ^{11 , 12 , 13}

1. Per ogni fase di questo test, pulire accuratamente l'arena del campo aperto con un detersivo germicida candeggiante, 70% EtOH seguito da dH2O prima dell'uso iniziale.
2. Un giorno prima dell'esposizione dell'oggetto, abituate i topi all'arena a campo aperto.
   1. Prima dell'inizio della sessione di abitudine, impostare il sistema di acquisizione dati o videocamere e confermare il corretto monitoraggio dei topi nel labirinto. Calibrare la distanza nell'arena usando immagini video acquisite di un righello o di un altro oggetto di lunghezza nota. Segna gli angoli dell'arena nel software per consentire il punteggio dei limiti di posizione.
      NOTA: I metodi comportamentali in questa procedura funzioneranno con una varietà di dati di acquisizione datiStems e gli autori suppongono che chiunque effettua questa procedura è abile nell'utilizzo del loro sistema di acquisizione dati scelto. Le analisi di potenza indicano che sono richiesti campioni di 15-20 topi per gruppo per un β ≤0.2.
   2. Rimuovere la gabbia dalla cremagliera e mettere delicatamente su un tavolo in prossimità dell'arena.
   3. Rimuovere il mouse dalla gabbia di casa e mettere delicatamente il mouse nel centro dell'arena. Accendere il software di monitoraggio e / o il sistema di registrazione video immediatamente dopo aver inserito il mouse nell'arena.
   4. Consentite ai topi di esplorare liberamente l'arena per 30 min.
      NOTA: Durante questo periodo, gli investigatori non disturberanno i topi.
   5. Dopo la sessione di abitudine, posizionare i topi nella gabbia di casa e pulire bene l'arena con un detersivo germicida candeggiante, 70% EtOH seguito da dH ₂ O.
   6. Ripetere la fase 4.2.2 fino a quando tutti i topi sono stati abituati all'arena.
   7. Dopo che tutti i topi sono stati abitudiniRata all'arena, analizza il video.
      NOTA: Gli endpoint da analizzare includono la distanza totale percorsa nell'arena e il tempo trascorso nei pressi di ogni angolo. Se pertinenti al modello del mouse, sono inclusi comportamenti stereotipati in queste analisi ( ad es . Salto angolo mioclonico, circolazione, ecc. ). I topi che mostrano biasioni nel tempo trascorso in regioni particolari dell'arena sono escluse dall'esperimentazione in quanto ciò influenza l'esplorazione dell'oggetto.
      NOTA: la prima fase del nuovo riconoscimento di oggetti consiste nel familiarizzare i topi con un oggetto. In questa parte della procedura di riconoscimento dell'oggetto novello verrà indicata la fase di campionamento.
   8. Prima dell'inizio di una sessione di campionamento campioni, posizionare gli oggetti nell'arena e fissarli al pavimento con un mastice di montaggio in modo che gli animali non possano spostare gli oggetti. Allinei due oggetti identici a una parete particolare con una distanza sufficiente tra le pareti e gli oggetti in modo che i topi possano esplorare liberamente gli oggetti da ogni angololes.
   9. Impostare il sistema di acquisizione dati o videocamere e confermare la corretta traccia di topi e oggetti nel labirinto. Calibrare le distanze nell'arena usando immagini video catturate di un righello o di un altro oggetto di lunghezza nota.
   10. Segna gli angoli dell'arena nel software per consentire il punteggio dei limiti di posizione. Contrassegnare gli oggetti nel software e individuare separatamente i loro comportamenti esplorativi per ogni oggetto ( es . "Oggetto A" e "Oggetto B").
   11. Rimuovere la gabbia dal rack e metterla delicatamente su un tavolo in prossimità dell'arena.
   12. Rimuovere il mouse dalla gabbia di casa e metterlo delicatamente nel centro dell'arena, di fronte agli oggetti.
   13. Consentite al mouse di esplorare liberamente gli oggetti per 15 minuti. Durante questo periodo non disturbare i topi.
   14. Alla fine della seduta, mettere delicatamente il mouse nella sua gabbia. Pulire l'arena e gli oggetti con il 70% di EtOH e dH ₂ O. Posizionare questi oggetti in thE arena.
   15. Ripetere il passaggio 4.2.11 fino a quando tutti i topi vengono familiarizzati con un oggetto.
   16. Una volta che tutti i topi sono stati familiarizzati con un oggetto, analizzare i video.
       NOTA: Le esplorazioni di oggetti vengono contate una volta soddisfatti i seguenti criteri: il mouse è orientato verso l'oggetto, il muso è entro 2 cm dall'oggetto, il centro del corpo animale è oltre 2 cm dall'oggetto e i criteri precedenti Sono stati rispettati per almeno 1 s. Inoltre, se un animale ha soddisfatto i criteri di esplorazione ma presenta immobilità per> 10 s allora l'esplorazione è considerata terminata.
   17. Calcola un punteggio di bias degli oggetti per ogni mouse come segue.
       
       NOTA: I topi che presentano un punteggio di bias dell'oggetto inferiore al 20% o superiore all'80% sono esclusi dall'analisi di ulteriori esperimenti.
3. La fase finale del nuovo riconoscimento di oggetti implica la valutazione del comportamento esplorativoDiretto verso un oggetto romanzo e familiare nell'ambiente, qui indicato come fase di prova. Questa fase viene eseguita 2-3 ore dopo la fase di campionamento.
   1. Prima dell'inizio di una sessione di fase di prova, posizionare gli oggetti nell'arena e fissarli al pavimento in modo che gli animali non possano spostare gli oggetti.
      1. Posizionare gli oggetti nella stessa posizione nell'arena rispetto alla fase del campione ¹³ .
      2. Bilancia la posizione relativa di oggetti nuovi e familiari tra genotipi e gruppi di trattamento.
      3. Assicurarsi che vi sia una distanza sufficiente tra le pareti e gli oggetti in modo che i topi possano esplorare liberamente gli oggetti da tutti gli angoli.
   2. Imposta il sistema di acquisizione dati e / o videocamere. Confermare il corretto monitoraggio di topi e oggetti nel labirinto. Calibrare le distanze nell'arena usando immagini video catturate di un righello o di un altro oggetto di lunghezza nota.
   3. Segna gli angoli dell'arena nel softwConsentono di valutare i limiti di posizione. Segna oggetti nel software e comporta il comportamento esplorativo per ogni oggetto individualmente ( ad esempio , "Novel" e "Familiar").
   4. Rimuovere la gabbia dal rack e metterla delicatamente su un tavolo in prossimità dell'arena.
   5. Mettere delicatamente gli animali al centro dell'arena, di fronte agli oggetti. Registri i topi esplorando liberamente oggetti per 10 min.
   6. Al termine della seduta di prova, togliere i topi dall'arena e posizionare i topi nella propria gabbia. Arena e oggetti con una spazzola germicida candeggiante, 70% EtOH e dH ₂ O dopo ogni sessione.
   7. Ripetere la procedura dal punto 4.4.3 finché non sono stati valutati tutti gli animali.
   8. Una volta esplorata l'oggetto per tutti i topi, i video vengono analizzati.
      NOTA: Le esplorazioni di oggetti vengono conteggiate una volta soddisfatti i seguenti criteri: il mouse è orientato verso l'oggetto, il muso è entro 2 cm dall'oggetto, il punto medio diIl corpo dell'animale è oltre 2 cm dall'oggetto e i criteri precedenti sono stati soddisfatti per almeno 1 s. Inoltre, se un animale ha soddisfatto i criteri di esplorazione ma presenta immobilità per> 10 s allora l'esplorazione è considerata terminata.
   9. Valuta il riconoscimento di oggetti nuovi confrontando il tempo trascorso esplorando il romanzo all'oggetto familiare. Tre metodi sono comunemente riportati in letteratura.
      1. Analizza il tempo grezzo impiegato per esplorare oggetti nuovi e familiari usando un test di misura ripetuta. Questo metodo è meglio utilizzato quando il genotipo e / o il trattamento non influenzano il tempo totale di esplorazione.
      2. Calcola la preferenza di novità, utilizzando l'equazione:
         
         NOTA: Questa fornisce la percentuale di tempo trascorso all'esplorazione dell'oggetto nuovo rispetto agli oggetti esplorativi complessi. I valori vanno da 0% (nessuna esplorazione di nuovi oggetti) al 100% (solo esplorazione del romanzo obJect), con un valore del 50% che indica la stessa durata dell'esplorazione di oggetti nuovi e familiari.
      3. Calcolare l'indice di discriminazione ¹¹ utilizzando l'equazione:
         
         NOTA: Questo produce la differenza nel tempo trascorso esplorando i nuovi oggetti familiari relativi al tempo totale esplorato. I valori vanno da -1 (solo esplorazione dell'oggetto familiare) a +1 (solo esplorazione dell'oggetto nuovo, con un valore di 0 che indica la stessa durata dell'esplorazione di oggetti nuovi e familiari.
   10. Rimuovere gli animali che non partecipano alla sessione di prova a causa di locomozione iperdinamica o altre stereotipi, a partire dalla considerazione ¹¹ .
       NOTA: I criteri utilizzati per la rimozione devono essere oggettivi e determinati a priori per il modello del mouse ( cioè <5 ^° percentile per il tempo totale di esplorazione e> 100 mediaL'angolo di svolta durante la sessione di prova o il 50 ^° tempo percentile che presenta il salto d'angolo myoclonico).

5. Valutazione della funzionalità corticospinale nei topi con l'attacco degli arti ¹⁴

1. Video documenta l'intera sessione. Registrare il video utilizzando un dispositivo portatile ( ad es . Smartphone o equivalente).
   NOTA: le analisi di potenza indicano che le dimensioni del campione di 10-15 mouse per gruppo sono necessarie per un β ≤0.2.
2. Rimuovere la gabbia da casa dal rack e posizionarla su un tavolo. Documentare l'ID animale nel video prima del passo successivo.
3. Rimuovere delicatamente il mouse dalla sua gabbia e sospendere dalla coda per 5-10 secondi. Il video deve registrare le zampe e le zampe anteriori dell'animale mentre sono sospese.
4. Dopo aver catturato almeno 5 s di video, posizionare il mouse nella sua gabbia di casa e restituire la gabbia alla cremagliera.
5. Pulisci il tavolo. Ripetere la fase 5.2 finché tutti i topi sono stati registrati d.
6. L'arto di punteggio si aggrappa ai video dei topi sospesi dalla loro coda su una scala da 0 a 4 (vedi tabella 1 per la descrizione del punteggio). Ispezionare i video dei topi sospesi e quindi assegnare un punteggio in base ai seguenti criteri.
   1. Nessun arto che si aggrappa. Estensione normale di fuga. Un arto posteriore mostra splay incompleto e perdita di mobilità. Le dita dei piedi mostrano normale splay.
   2. Entrambe le arterie posteriori presentano splay incomplete e perdita di mobilità. Le dita dei piedi mostrano normale splay.
   3. Entrambe gli arti posteriori presentano una stretta con le dita piegate e l'immobilità.
   4. I forelimbs e gli arti posteriori presentano chiusura e sono incrociate, punte arricciate e immobilità.
7. Tutti i topi sono classificati da 2 investigatori indipendenti. Ogni mouse in cui i due punteggi differiscono per più di un punto viene ripristinato ancora una volta.
   1. I punteggi che differiscono sono mediati.

P_upload / 55523 / 55523table1.jpg "/>
Tabella 1: Descrizione dei punteggi di attacco degli arti.

Risultati

I topi invecchiati Tg2576 presentano deficit robusti in alterazioni spontanee effettuate all'interno di un labirinto Y ^{15 , 16} , un fenotipo che può essere replicato utilizzando i metodi qui descritti ( figura 1A ). Mentre in questi topi è stata osservata una tendenza per aumentare le entrate di braccio ( Figura 1B ), l'iperattività osservata in questa linea di topi non ha influenzato il tasso di alterazione spontanea ( Figura 1C ). Al contrario, i topi rTg4510 invecchiati sembrano mostrare una maggiore alternanza spontanea quando vengono posizionati in un labirinto Y ( Figura 1D ). Ciò è dovuto all'iperattività estrema ( figura 1E ) e stereotipia ¹⁰ , che interferisce in modo significativo con la misura dell'alternanza spontanea ( Figura 1F ). Quando si valutano inizialmente i topi in questa attività, è fondamentale assicurarsi che le voci del braccio e / o la distanza percorsa non sianoSignificativamente correlati con il tasso di alternanza spontaneo.

Prima della valutazione del nuovo riconoscimento di oggetti, i topi sono abituati all'arena in cui verrà eseguita la prova. Durante l'abitudine, l'iperattività ( Figura 2A ) e altri comportamenti stereotipati rilevanti per il modello del topo possono essere valutati. Durante la fase di campionamento, è fondamentale misurare l'esplorazione di ciascun oggetto separatamente in modo che i topi che presentino significativi biasioni nel comportamento esplorativo possano essere esclusi dalla valutazione ulteriore ( figura 2B , cerchi aperti). Il riconoscimento di oggetti nuovi viene valutato confrontando l'esplorazione di un oggetto familiare e nuovo e viene comunemente analizzato in tre modi diversi. Se il tempo totale esplorativo è paragonabile a tutti i genotipi e / oi gruppi di trattamento, allora il tempo grezzo che esplora ogni oggetto e le appropriate misure di misurazione ripetuta possono essere utilizzate per determinare se vi siano differenze nel nuovo oggetto rEcognizione ( figura 2C ). Se un particolare ceppo del mouse presenta differenze nel tempo totale esplorativo, il nuovo riconoscimento di un oggetto può essere valutato utilizzando una preferenza di novità ( figura 2D ) o un indice di discriminazione ( figura 2E ).

Il clasping dell'arto è un test motore funzionale che quantifica i deficit nella funzione corticospinale. L'attacco degli arti, che non è una misura cognitiva, è osservato in diversi modelli di topi tumor transgenici ^{6 , 17 , 18 , 19} e ricapitola alcuni dei deficit motori funzionali osservati nei pazienti AD di fase avanzata. La sospensione dei topi dalla coda induce una risposta di fuga ( Figura 3A , "0"). Deficit nella capacità di spingere gli arti posteriori e estendere le dita dei piedi vengono valutati in base alla loro severità su una scala da 0 a 4 ( Figura 3A). Utilizzando la procedura qui descritta, si può osservare un significativo attacco degli arti in topi rTg4510 ( Figura 3B ).

Figura 1: Alternanza spontanea nel labirinto Y. ( A ) Quando posizionati in un labirinto Y, i topi adottano una strategia di ricerca perdita di spostamenti che si traduce in un modello di esplorazione in cui ogni braccio viene esplorato una sola volta per ogni entrata a tre bracci. I topi Tg2576 invecchiati presentano un deficit significativo in alternanza spontanea. Utilizzando le procedure descritte in questo metodo, è stato osservato un significativo ripristino dell'alterazione spontanea dopo il trattamento con un composto proprietario. I dati sono stati analizzati utilizzando ANOVA a 1 vie e sono stati effettuati confronti post-hoc a Tg-PBS utilizzando il test di Dunnett. ** p <0.01. Le barre di errore indicano SEM. ( B ) Il numero di voci di braccio non è stato significativamente diverso tra tuttiDei gruppi monitorati in questo esperimento. I dati sono stati analizzati usando un test ANOVA a 1 via. Le barre di errore indicano SEM. ( C ) Non esiste alcuna correlazione tra l'alternanza spontanea e il numero di voci di arma, indicando che le differenze nell'attività locomotiva spontanea non hanno influito sulla quantificazione dell'alternanza spontanea. Il test di correlazione è stato eseguito utilizzando l'analisi di correlazione di Pearson. ( D ) Quando posizionati in un labirinto Y, i topi rTg4510 (6 mesi) sembrano mostrare un'alterazione significativamente più spontanea rispetto ai topi WT di littermate. I dati sono stati analizzati mediante ANOVA a 1 vie e sono stati effettuati confronti post-hoc a Tg-PBS utilizzando il test di Dunnett. ** p <0.01. Le barre di errore indicano SEM. ( E ) rTg4510 topi hanno fatto significativamente più entrate di braccio a causa della loro estrema locomozione iperdinamica. I dati sono stati analizzati mediante ANOVA a 1 vie e sono stati effettuati confronti post-hoc a Tg-PBS utilizzando il test di Dunnett. *** p <0,001. Le barre di errore indicano SEM. ( F ) Il comportamento alternativo spontaneo è significativamente correlato con le entrate del braccio, indicando che il fenotipo locomotore iperdinatico ha oscurato la vera alternazione spontanea. Il test di correlazione è stato eseguito utilizzando l'analisi di correlazione di Pearson (r = 0,7, p <0,0001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Novel Object Recognition. ( A ) L'abitudine dell'arena permette di misurare la locomozione spontanea e altri comportamenti stereotipati rilevanti per un determinato modello del topo. Qui, i topi Tg2576 invecchiati (22 mesi) presentano una locomozione più spontanea rispetto ai topi WT di littermate. I dati sono stati analizzati mediante ANOVA a 1 vie e sono stati eseguiti confronti post-hoc a Tg-Veh utilizzando Dunnett 'S test. ** p <0.01. Le barre di errore indicano SEM. ( B ) Durante la fase del campione, l'esplorazione di due oggetti identici è stata monitorata separatamente. I topi che presentano grandi bias verso l'esplorazione di uno dei due oggetti (cerchi aperti) sono stati esclusi dalla fase di prova. ( C - E ) Il riconoscimento di oggetti nuovi è stato valutato misurando l'esplorazione di un oggetto nuovo e familiare. Il riconoscimento di un nuovo oggetto è stato valutato utilizzando il tempo di esplorazione ( C ), ( D ) la preferenza di novità o l'indice di discriminazione ( E ). I dati nel pannello C sono stati analizzati utilizzando un ANOVA a due vie con misure ripetute e sono stati effettuati confronti a coppie usando il test di Sidak. I dati nei pannelli DE sono stati analizzati con un ANOVA a 1 via e sono stati effettuati confronti post-hoc a Tg-Veh utilizzando il test di Dunnett. * P <0,05, ** p <0,01. Le barre di errore indicano SEM. Fare clic suQui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Climbing dell'arto. ( A ) Immagini rappresentative di topi che presentano vari gradi di aggancio degli arti come descritti nella Tabella 1. ( B ) i topi rTg4510 (6 mesi) presentano un significativo attacco degli arti rispetto ai topi WT di littermate come valutati utilizzando questi metodi. I dati sono stati analizzati utilizzando un ANOVA a 1 vie e sono stati effettuati confronti post-hoc a Tg-PBS utilizzando il test di Dunnett. *** p <0,001, **** p <0,0001. Le barre di errore indicano SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Significato della tecnica nel rispetto dei metodi esistenti
Questa procedura è stata progettata per monitorare l'attività in vivo di composti nei modelli di topi transgenici di β-amiloidosi e tauopatia. L'approccio scelto qui impiegato assicura la rilevazione di composti efficaci nei domini cognitivi rilevanti per l'AD ³ . Inoltre, l'approccio dettagliato qui utilizza test comportamentali che dispongono di endpoint chiaramente definiti, controlli di controllo di qualità facilmente implementabili, possono essere eseguiti in un formato di throughput modesto e richiedono un piccolo intervento dell'investigatore. Queste caratteristiche portano a saggi che presentano una buona riproducibilità negli animali e nelle coorte, che provoca una bassa varianza intra-e inter-assay e dimensioni di effetto (2 ≤ f ≤ 6) sufficientemente robuste per supportare la profilazione comportamentale in un ambiente di scoperta di farmaco.

Passi critici all'interno del Protocol
Molti modelli di topi utilizzati per la scoperta di farmaci AD mostrano comportamenti coerenti con l'ansia e l'aggressività aumentati. Questo rende l'abitudine di manipolazione indispensabile per eseguire uno qualsiasi dei test comportamentali descritti qui. Poiché questi test si basano su comportamenti non motivati, la manipolazione ruvida da parte dell'investigatore a causa di un topo iperattivo ed ansioso o aggressivo può influenzare notevolmente le prestazioni. L'ansia aumentata potrebbe comportare la mancata esecuzione dell'attività, riducendo la potenza complessiva del test. Inoltre, i livelli di luce nell'arena sono essenziali per facilitare la locomozione spontanea necessaria per ogni prova. La luce luminosa tende ad aumentare l'ansia e sopprimere la locomozione nei roditori, pertanto è necessario prestare attenzione a regolare i livelli di luce ambientale a 30-35 lux nell'arena.

Un altro aspetto critico della procedura è la minimizzazione di forti segnali ambientali che potrebbero interferire con la capacità di un animale di svolgere i compiti. Pulizia dellaArena e oggetti tra le piste è essenziale perché i topi sono attratti da nuovi profumi nell'ambiente. La mancata pulizia accurata dell'arena e degli oggetti potrebbe comportare un disfacimento dell'attività spontanea del mouse e la maschera delle vere prestazioni cognitive. I ricercatori dovrebbero inoltre ridurre al minimo l'uso di prodotti igienici personali e di colonia / profumi durante l'esecuzione di queste procedure. Infine, i roditori mostrano robusti cambiamenti diurni e circadiani in molti comportamenti superiori ²⁰ tra cui l'apprendimento e la memoria ²¹ . Pertanto, per ridurre al minimo la varianza dovuta ai ritmi diurni nei comportamenti basali e nelle prestazioni cognitive, tutti i test devono essere eseguiti allo stesso tempo del giorno attraverso le coorti e gli studi.

Inoltre, specificamente per quanto riguarda il nuovo riconoscimento di oggetti, l'intervallo di ritardo tra il campione e la fase di test e la selezione e il posizionamento degli oggetti nell'ambiente sono parametri critici. La memoria esiste in tre forme distinte: mem. A breve termineOry (STM), memoria a termine intermedio (ITM) e memoria a lungo termine (LTM) ^{22 , 23} . Cambiare l'intervallo tra il campione e le fasi di test da minuti (STM) a ore (ITM) o giorni (LTM) cambierà il tipo di memoria testato dalla procedura ¹² . Inoltre, prima di eseguire il nuovo test di riconoscimento degli oggetti, molti oggetti dovrebbero essere sottoposti a screening in una coorte di test di topi per potenziali pregiudizi nell'esplorazione. Un oggetto che è eccessivamente attraente o repulsivo per la coorte di prova non può essere utilizzato per la valutazione di un nuovo oggetto di riconoscimento. Idealmente tutti gli oggetti che verranno impiegati nel test, quando messi in un arena, provocheranno tempi di esplorazione uguali da una coorte ingenuo di topi. Il test e l'ottimizzazione degli oggetti inadeguati possono ridurre significativamente la potenza di un nuovo riconoscimento di oggetti.

Modifiche e risoluzione dei problemi
Ci sono diversi fattori che potrebbero aumentare il valoreVariabilità apparente nei test cognitivi qui descritti. Molti modelli di topo di AD mostrano locomozione iperdinamica ³ che possono mascherare o alterare i comportamenti misurati come endpoint cognitivo. Inoltre, vi è una crescente evidenza che il sesso ^{24 , 25 , 26} e addirittura genotipo materno ²⁷ può influenzare lo sviluppo e la progressione della neuropatologia e dei fenotipi cognitivi nei modelli di topi AD. La variabilità imprevista o il mancato svolgimento di un'attività comportamentale potrebbe essere dovuta a uno di questi fattori. Quando si effettua prima una particolare prova comportamentale, i risultati devono sempre essere stratificati per sesso, età e, se applicabile, genotipo materno. Inoltre, i controlli di qualità indicati in questa procedura devono essere sempre eseguiti per garantire che iperattività o altri comportamenti stereotipati non interferiscano con la quantificazione degli endpoint cognitivi.

EnvLa stiratura può anche influenzare il comportamento esplorativo spontaneo dei roditori. Gli odori oi suoni che non sono rilevabili ai ricercatori potrebbero attirare o respingere i topi, spianando i risultati di test cognitivi che si basano sul comportamento spontaneo. Quando inizialmente stabilire un labirinto Y o un nuovo oggetto di riconoscimento, è essenziale eseguire le misure di controllo per assicurare che non ci siano pregiudizi posizionali nell'esplorazione di oggetti e / o dell'ambiente. Se si osservano biasioni posizionali, i ricercatori devono accuratamente esaminare l'ambiente e potenzialmente regolare l'illuminazione, il posizionamento dell'arena, la posizione della sala di prova rispetto ad altre sale dell'impianto ( cioè , non vicino ad un'area alta traffico o attrezzature pesanti) e alle procedure di pulizia dell'arena.

L'abituale all'ambiente di test è fondamentale per ottenere prestazioni ottimali nel nuovo test di riconoscimento degli oggetti. Ad esempio, i tempi di esplorazione bassi possono essere dovuti a un inadeguato abitudine. In alternativa al procLe istruzioni descritte qui per la manipolazione (sezione 2) e l'arena (sezione 4.2), l'abitudine alla manipolazione e l'ambiente di prova possono essere eseguite come sessioni di 3, 5 minuti al giorno per 2 giorni consecutivi.

Limitazioni della tecnica
Come per qualsiasi procedura, questi test comportamentali hanno limitazioni. Queste procedure sono state impiegate perché testano la funzione di varie regioni corticali e ippocampo. Se il modello del mouse non presenta deficit funzionali nelle regioni del cervello esaminate da questi test, queste tecniche non saranno utili. Inoltre, abbiamo scelto test cognitivi che sondano la memoria a breve termine. Se non si prevede che il meccanismo d'azione del composto sotto la valutazione preclinica possa influire sulla memoria a breve termine, queste procedure vanno modificate di conseguenza ( ad esempio , aumentando l'intervallo di fase di prova del campione per testare la memoria a lungo termine). Infine, questi test utilizzano comportamenti non motivati. Pertanto, se un modello del mouse è excesIngenue o visualizza altri comportamenti stereotipati che impediscono l'esplorazione dell'ambiente, allora queste procedure potrebbero non essere ottimali. In alternativa, si potrebbe usare il condizionamento della paura per Tg2576 o altri modelli di topi β-amiloidosi, o il labirinto dell'acqua spaziale per rTg4510 o altri modelli di topo della tauopatia ³ .

Applicazioni future
Una volta che queste procedure sono state adottate con successo nel laboratorio, diverse modifiche o estensioni possono essere effettuate per valutare ulteriori misure motorie cognitive e funzionali. Ad esempio, modificare l'attività di riconoscimento oggetto nuovo per determinare se un mouse può riconoscere una modifica nel posizionamento di un oggetto ¹³ . In alternativa, invece di utilizzare oggetti, si potrebbe usare altri topi e implementare una prova di riconoscimento sociale. Per quanto riguarda la chiusura degli arti e la funzione del motore, si potrebbe integrare tale prova con i test di tenuta e / o di forza della presa. I testDettagliate in questo metodo formano una base solida per schermare i composti che hanno efficacia in vivo nei modelli di topo di traslazione per AD e possono essere adattati o modificati in molti modi per interrogare meglio un particolare modello del mouse o soddisfare le esigenze di un unico programma di scoperta di droga .

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Topscan Lite-High Throughput	Cleversys		Analisi comportamentale automatizzata. Include telecamere e sistema di acquisizione video, computer portatile.
ObjectScan	Cleversys		Modulo software per la quantificazione accurata dell'esplorazione degli oggetti
Campo aperto per il mouse	Cleversys	CSI-OF-M	Arena per il riconoscimento di nuovi oggetti
Labirinto a Y per mouse	Bracci personalizzati: pareti lunghe 30 cm, larghe 10 cm, alte 20 cm, posizionate a 120 gradi di distanza.
Supporto per telecamera per campo aperto	Custom	Custom	76 cm di altezza, 115 cm di larghezza, telecamere montate @ 30 cm in da entrambi i lati. Due supporti, ciascuno copre due scatole.
Supporto per telecamera per Y-maze	Custom	Custom	76 cm di altezza, 115 cm di larghezza, telecamere montate @ 30 cm da entrambi i lati. Una montatura copre due labirinti.
Marbles	Inperial Toy	8565	Biglie di vetro standard (diametro 15,5 mm).
Dadi	Cardinal Industries	770	Standard (0.650 pollici) dadi bianchi con punti neri.
LOCTITE Fun-Tak	Henkel	B018A3AG0W	Standard blu appiccicoso tak
EtOH	Nexeo Solutions	82452	100% etanolo diluito al 70% utilizzando acqua distillata
dH2O	Tulpenhocken Spring Water Co.	-	PA D.E.P. #31, NJ D.O.H. #0049, NYSHD Cert. #320
Asciugamani di carta	Procter & Gamble	B019DM86LA	Bounty, bianco
videocamera portatile	Apple, Inc.	MKV92LL/A	Acquisizione di video di presa degli arti, Iphone 6S Plus (o equivalente funzionale).
Guanti	SafePOINT, L.L.C.	GL640-2	Standard, guanti in lattice senza polvere, misuratore di
luce	Dr. Meter	LX1330B	Illuminazione @ il fondo del campo aperto = 35 LUX, illuminazione @ fondo del labirinto a Y = 32 LUX
Salviette germicide con candeggina Clorox			Sterilizzazione dell'attrezzatura durante e dopo l'uso