In Vitro Imaging e quantificazione della Drug Targeting efficienza di fluorescente GnRH analoghi

Summary

Selettivamente l'etichetta fluorescente GnRH-I, -II e -III derivati sono strumenti affidabili per il monitoraggio e la quantificazione loro assorbimento cellulare. Questo manoscritto introduce esperimenti di visualizzare, quantificare e confrontare l'efficienza di assorbimento di questi coniugati GnRH in diverse linee cellulari.

Abstract

analoghi del GnRH sono efficaci frazioni di targeting e in grado di fornire agenti antitumorali selettivamente nelle cellule tumorali maligne che i recettori del GnRH altamente espresso. Tuttavia, l'analisi quantitativa di assorbimento cellulare GnRH analoghi 'ei tipi di cellule indagati in sistemi di drug delivery GnRH-based sono attualmente limitati. In precedenza introdotto, fluorescente selettivamente etichettato GnRH I, -II e -III derivati ​​fornire grande rilevabilità, e hanno gli immobili chimici per esperimenti riproducibili e robusti. Abbiamo anche trovato che i metodi appropriati up-to-date con questi analoghi del GnRH etichettati potrebbero offrire nuove informazioni sui sistemi di somministrazione dei farmaci a base di GnRH. Questo manoscritto introduce alcuni esperimenti semplici e veloci per quanto riguarda l'assorbimento cellulare di [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-II e [Lys ⁸ (CIC)] - GnRH -III sulla EBC-1 (polmone), la BxPC-3 (pancreas) e sul Detroit-562- (faringe) maligno tumor cellule. Parallelamente a queste coniugati GnRH-FITC, il livello della superficie cellulare dei recettori GnRH-I è stato esaminato anche su queste linee cellulari, prima e dopo il trattamento GnRH dal microscopio confocale a scansione laser. L'assorbimento cellulare di coniugati GnRH-FITC è stato quantificato con la fluorescenza-attivato l'ordinamento delle cellule. In questi esperimenti è stata osservata piccole differenze tra analoghi del GnRH e le principali differenze tra i tipi di cellule. Le differenze significative tra le linee cellulari sono correlati con il loro livello distinto di recettori di superficie delle cellule GnRH-I. Gli esperimenti introdotti contengono metodi pratici per visualizzare, quantificare e confrontare l'efficienza di assorbimento di coniugati GnRH-FITC in un tempo e modo dipendente dalla concentrazione su varie colture cellulari aderenti. Questi risultati potrebbero prevedere il drug targeting efficienza dei coniugati GnRH sulla data coltura cellulare, e di offrire una buona base per ulteriori esperimenti in esame dei sistemi di somministrazione dei farmaci a base di GnRH.

Introduction

Sistemi di drug delivery mirati a base di peptidi sono diventati un rapido sviluppo e la zona promettente nella terapia del cancro negli ultimi anni ^{1, 2.} Gonadotropina umana di tipo rilasciando recettore dell'ormone I (GnRH-IR) si trova principalmente nella ghiandola pituitaria, ma è presente anche in molti altri tessuti che sono responsabili per l'auto-riproduzione ^3. GnRH-IR si esprime anche in un certo numero di tessuti tumorali, collegate o indipendenti per il sistema riproduttivo ^{4, 5.} L'elevata espressione di GnRH-IR in diverse cellule tumorali maligne rispetto ai tessuti sani prevede la possibilità per la terapia mirata ^{5, 6.}

Molti dell'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH) analoghi sono stati sviluppati negli ultimi decenni, che potrebbero essere utilizzati come target porzionif "> ^{7, 8, 9.} Questi peptidi sono in grado di rilasciare agenti antitumorali con elevata selettività in cellule tumorali maligne che over-esprimono GnRH-IR ^6. Diversi GnRH farmaci anti-tumorali coniugati con elevata selettività e migliore efficienza rispetto al corrispondente coniugato droga libera sono stati segnalati ^{7, 8, 9.}

Precedenti pubblicazioni su peptidi GnRH e dei loro recettori hanno riferito che il GnRH-IR può assumere diverse conformazioni che hanno selettività diverso per GnRH analoghi della ^10. Il GnRH-IR altamente variabile ha vie di segnalazione complesse e varie sono dotati di diversa attività contro i loro ligandi naturali e artificiali ^11. Questi fatti fanno indagini di sistemi basati su GnRH impegnativo. D'altra parte, la y possiedono potenziale terapeutico promettente. Diversi esperimenti con peptidi radiomarcati GnRH sono stati precedentemente riportati ^{12, 13, 14, 15,} ma esperimenti in cui sono stati usati gli analoghi del GnRH fluorescente sono ancora limitate. Mentre marcatura radioattiva offre alta sensibilità, marcatura fluorescente ha diversi altri vantaggi, ad esempio la maneggevolezza e la capacità di colorazione di contrasto con differenti fluorofori. Tre analoghi del GnRH comuni che sono stati usati con successo per somministrazione di farmaci sono i [D-Lys ^6] -GnRH-I, [D-Lys ^6] -GnRH-II e III-GnRH, ma l'efficacia di questi peptidi come porzioni di targeting è raramente rispetto ^{16, 17.} D'altro canto, i risultati di esperimenti separati in cui sono stati utilizzati differenti cellule tumorali e analoghi GnRH è varia.

S copi "> Sulla base di queste considerazioni, si concentra sul tumore targeting e potenziale drug delivery di questi peptidi GnRH, e così sintetizzato e caratterizzato [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys ⁶ (FITC )] - GnRH-II e [Lys ⁸ (FITC)] - GnRH-III coniugati peptide ¹⁸ Questi analoghi sono selettivamente etichettati con FITC sulla catena laterale di loro (rapporto peptide-FITC Lys o D-Lys 1: 1 in ogni. coniugato). l'idea era che l'etichettatura fluorescente selettivo in grado di offrire nuove informazioni su questi peptidi, e permette loro buon monitoraggio e la quantificazione affidabile. questi coniugati hanno una manipolazione sicura e rilevabilità affidabile, che rendono più facile per confrontare il loro tumore efficienza targeting e la proiezione di numerosi tipi di cellule tumorali maligne. speriamo che fino a esperimenti data con questi coniugati peptide potrebbe contribuire allo sviluppo del cancro romanzo mira coniugati GnRH-droga, e contribuire ad individuare nuove tar terapeuticoottiene pure.

Il presente manoscritto dimostra alcuni esperimenti ben riproducibili e veloci con coniugati GnRH-FITC. L'espressione superficie cellulare di GnRH-R è una condizione determinante per quanto riguarda l'assorbimento del GnRH, quindi abbiamo studiato contemporaneamente il livello della superficie cellulare di GnRH-IR sulle linee cellulari testate. Abbiamo visualizzato il coniugati GnRH-IR e GnRH-FITC da confocale a scansione laser microscopia (CLSM) e quantificato l'assorbimento cellulare di coniugati GnRH-FITC utilizzando celle a fluorescenza-attivato (FACS).

Protocol

1. Preparazione di colture cellulari e reagenti

1. Mantenere le colture cellulari in terreno raccomandato dal produttore, supplementato con 10% (v / v) di siero fetale bovino e antibiotici (chiamato mezzo completo). Mantenere il matraccio di coltura cellulare in un umidificata, 5% un'atmosfera incubatore CO ₂ a 37 ° C. Seguire la proliferazione e la confluenza delle cellule mediante microscopio invertito (utilizzando 10X obiettivo contrasto di fase).
2. Quando le cellule raggiungono un adeguato confluenza, rimuovere il supporto, e lavare la cultura con 2-3 ml, soluzione fisiologica sterile tampone fosfato (PBS). Rimuovere il PBS e aggiungere 0,5 ml, 0,25% soluzione di tripsina-EDTA sterili per la coltura cellulare e incubare a 37 ° C finché le cellule staccano (circa 10 min).
3. Sospendere le cellule in 3-4 ml sterile terreno completo per fermare tripsina e trasferirli in una provetta da centrifuga sterile. Centrifugare le cellule a 150 xg per 4 minuti a temperatura ambiente (RT). Eliminare con cura il surnatante e sospendere la pEllet in 2-3 ml di sterile terreno completo.
4. Togliere 100 ml di sospensione cellulare e mescolare con 100 ml 0,4% (m / V) trypan blu soluzione, a macchiare le cellule morte. Carico 10 ml di questa miscela in un emocitometro e determinare il numero di cellule vitali di microscopio invertito.
5. Diluire la quantità richiesta di sospensione cellulare preparato secondo il punto 1.3 a 10 mL con sterile terreno completo, contenente 4 x 10 ⁴ cellule / mL.
6. Aggiungere 250 ml di sospensione cellulare (preparata al punto 1.5) per pozzo (10 ⁴ cellule / pozzetto) in sette pozzi del primo fondo di vetro da 8 pozzetti vetrino microscopico. Utilizzare questa diapositiva nel metodo assorbimento GnRH.
7. Aggiungere 250 ml di sospensione cellulare (preparata al punto 1.5) per pozzo (10 ⁴ cellule / pozzetto) in cinque pozzi della seconda slitta 8-bene microscopica. Questa diapositiva verrà utilizzato nel metodo di espressione GnRH-IR.
8. Aggiungere 1 ml di sospensione cellulare (preparata al punto 1.5) per bene (4 x 10 ⁴ cellule / pozzetto) in sette wells di un 12-pozzetti. Questa piastra sarà utilizzata nel metodo di quantificazione GnRH.
9. Lasciate che le cellule aderiscono sui due preparati microscopici e la piastra. Incubare in un umidificata, 5% un'atmosfera incubatore CO ₂ a 37 ° C per 48 h.
10. Dopo l'incubazione controllare le cellule microscopio invertito (usando 10 volte obiettivo contrasto di fase). Se le cellule sono sane e attaccato, continuare con i seguenti passaggi.
11. Preparare 10 soluzione madre mM GnRH-FITC in dimetilsolfossido (DMSO) da ciascuno dei tre coniugati ^18. (Usare queste concentrazioni di diluizione: 16.43 mg / mL [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-I, 16.97 mg / mL [D-Lys ⁶ (FITC)] - GnRH-II e 16.47 mg / mL [Lys ⁸ ( FITC)] - GnRH-III) Conservare queste soluzioni madre in un luogo buio a temperatura ambiente e utilizzarli entro poche settimane.
12. Diluire 1,7 ml ciascuno dei tre 10 soluzioni madre mM GnRH-FITC in 1,7 ml terreno completo. Agitare queste soluzioni. (These sono il 10 micron GnRH-FITC trattamento dei media.) Diluire 150 ml ciascuna delle tre 10 micron GnRH-FITC medio trattamento a 1,35 ml di mezzo completo. Agitare queste soluzioni così (questi sono i 1 micron GnRH-FITC medio trattamento).
    NOTA: Tutti i GnRH-FITC terreno contenente il trattamento deve essere protetto dalla luce e utilizzata entro pochi h.
13. Preriscaldare il sei GnRH-FITC medio trattamento (preparata al punto 1.12) e 4 ml di terreno completo a 37 ° C.
14. Diluire 3 ml di 5 mm soluzione sonda fluorescente (di contrasto nucleare menzionata nella lista dei materiali) in 3 ml di PBS a 5 micron. Questa soluzione deve essere protetta dalla luce, tenerlo a RT e usarla entro poche ore.

2. Microscopia confocale a scansione laser (CLSM)

1. GnRH metodo di assorbimento
   1. Prendere la prima diapositiva microscopica preparata al punto 1.6 e pipettare il terreno completo da ciascuno dei sette bene. Aggiungere 250 ml di preriscaldata Medi completoum nel primo pozzo. Utilizzare questo come un controllo negativo. Aggiungere 250 microlitri della preriscaldato GnRH-FITC trattamento supporto (da 1.13) per ciascuno dei prossimi sei pozzetti (3 pozzetti con 1 mM e 3 con 10 pM). Incubare il vetrino in una umidificata, 5% un'atmosfera incubatore CO ₂ a 37 ° C per 5 ore.
   2. Pipetta fuori il medium da ogni pozzetto e lavare le cellule con 250 microlitri di PBS. Aggiungere 250 ml di soluzione di fissaggio (10% formalina neutra tamponata) in ciascun pozzetto e incubare il vetrino a temperatura ambiente, per 10 minuti.
   3. Pipettare la soluzione di fissaggio da ciascun pozzetto e lavare le cellule con 250 microlitri di PBS. Aggiungere 250 ml di PBS contenente 5 mM soluzione sonda fluorescente preparata al punto 1.14 in ciascun pozzetto e incubare il vetrino a temperatura ambiente, per 10 minuti.
   4. Pipettare la soluzione sonda fluorescente da ogni pozzetto e lavare le cellule due volte con 250 microlitri di PBS con attenzione. Aggiungere 3-4 gocce di mezzo di montaggio in tutti i pozzetti, finalmente. Conservare il vetrino al buio a RT, fino alla imaging.
2. Metodo di espressione GnRH-IR
   1. Prendere la seconda slitta microscopica 8-ben preparato al punto 1.7 e pipettare il terreno completo da ciascuno dei cinque pozzi.
   2. Aggiungere 250 ml di terreno completo preriscaldato nel primo pozzo, utilizzare questo controllo come negativo. Aggiungere 250 ml di terreno completo preriscaldato nella seconda bene anche, e usare questa espressione per esaminare GnRH-IR prima del trattamento GnRH.
   3. Aggiungere 250 ml ciascuno dei tre preriscaldato 10 micron GnRH-FITC supporti trattamento nei prossimi tre pozzi. Utilizzare questi pozzi per pretrattare le cellule con coniugati GnRH-FITC prima di esaminare l'espressione GnRH-IR. Incubare il vetrino in una umidificata, 5% un'atmosfera incubatore CO ₂ a 37 ° C per 1 h.
   4. Pipettare il mezzo trattamento da ciascuno dei tre pozzi che verranno utilizzati per esaminare l'espressione GnRH-IR dopo il trattamento GnRH e lavare questi pozzetti con 250 ml di terreno completo preriscaldato. Aggiungere 250ml di mezzo completo preriscaldato in ciascuno dei tre pozzi. Incubare il vetrino in una umidificata, 5% un'atmosfera incubatore CO ₂ a 37 ° C per 1 h.
   5. Pipettare il mezzo da ciascuno dei cinque pozzetti e lavare le cellule con 250 microlitri di PBS. Aggiungere 250 ml di soluzione di fissaggio in ciascun pozzetto e incubare il vetrino a temperatura ambiente, per 10 minuti.
   6. Pipettare la soluzione di fissaggio da ciascun pozzetto e lavare le cellule con 250 ml di PBS. Aggiungere 250 ml di PBS contenente albumina 5% di siero bovino (BSA) soluzione di bloccaggio in ogni pozzetto e incubare il vetrino a temperatura ambiente, per 1 ora.
   7. Diluire 10 ml di anticorpo primario GnRH-IR in 1 ml di PBS (1: 100 ratio). Tenerlo a RT e usarla entro poche ore.
   8. Pipettare la soluzione bloccante BSA da ogni bene, tranne il controllo negativo (primo pozzo). Lavare le cellule con 250 microlitri di PBS (ad eccezione del controllo negativo). Aggiungere 250 ml di PBS contenente GnRH-IR anticorpo primario pronto al passo 2.2.7 in each pozzetto (ad eccezione del controllo negativo). Incubare il vetrino a temperatura ambiente, per 1 ora, in un luogo buio.
   9. Diluire 2,5 ml di Alexa 546 anticorpo secondario marcato a 1,25 ml di PBS (1: 500 ratio).
      NOTA: Questa soluzione deve essere protetta dalla luce, tenerlo a temperatura ambiente e usarla entro poche ore.
   10. Pipettare soluzioni da ciascuno dei cinque pozzetti e lavare le cellule con 250 microlitri di PBS. Aggiungere 250 ml di PBS contenente AF 546 marcato anticorpo secondario pronto al passo 2.2.9 in tutti i pozzetti. Incubare il vetrino a temperatura ambiente, per 1 ora al buio.
   11. Pipettare la soluzione da ciascun pozzetto e lavare le cellule con 250 microlitri di PBS. Aggiungere 250 ml di PBS contenente 5 mM soluzione sonda fluorescente preparata al punto 1.14 in ciascun pozzetto e incubare il vetrino per 10 minuti, a temperatura ambiente.
   12. Pipettare la soluzione sonda fluorescente da ogni pozzetto e lavare le cellule due volte con 250 microlitri di PBS con attenzione. Aggiungere 3-4 gocce di mezzo di montaggio in tutti i pozzetti, dopo. Tenere il vetrino nel buioa RT fino immagini microscopiche.
3. Imaging
   1. Immagine le cellule confocale invertito microscopio a scansione laser (utilizzando 63X obiettivo ad immersione)
      1. Utilizzare le seguenti lunghezze d'onda di eccitazione / emissione. coniugati GnRH: 488/514 nm, Alexa 546 anticorpo marcato: 488/546 nm (utilizzare solo per il metodo di espressione GnRH-IR), sonda fluorescente DRAQ5: 633/680 nm.
      2. Impostare i parametri di imaging utilizzando le cellule di controllo negativo. Utilizzare questi parametri per celle di immagine trattata (figura 3). Re-regolare i parametri di imaging su ciascun vetrino microscopico all'inizio dell'analisi. Ottimizzare ed esportare le immagini con il software fornito dal produttore, se necessario.

3. cellulare fluorescenza-attivato Sorting (FACS)

1. Metodo di quantificazione GnRH
   1. Prendere il piatto preparato al punto 1.8 e pipettare il mezzo completo da EAch dei sette pozzi. Aggiungere 1 ml di terreno completo preriscaldato nel primo pozzo. Utilizzare questo come un controllo negativo. Aggiungere 1 ml ciascuna delle sei preriscaldato trattamento dei media (3 pozzi con 1 micron e 3 pozzi con 10 micron) nei prossimi sei pozzi. Incubare la piastra in una umidificata, 5% un'atmosfera incubatore CO ₂ a 37 ° C per 5 ore.
   2. Pipetta fuori il medium da ogni pozzetto. Lavare le cellule due volte con 2 ml di PBS con attenzione. Aggiungere 500 ml di soluzione di tripsina-EDTA in ogni pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C finché le cellule staccano (circa 10 min).
   3. Aggiungere 1 ml di terreno completo in ciascun pozzetto per arrestare tripsina. Agitare la piastra. Sospendere le cellule delicatamente con una pipetta, e trasferire la sospensione da ogni pozzetto in tubi FACS. Centrifugare le provette a 150 xg per 4 minuti, a 4 ° C.
   4. Riversa il surnatante con cura, con una sola mossa. Aggiungere 500 ml di PBS ghiacciato in ciascuna provetta FACS e delicatamente risospendere le cellule. Mantenere i tubi in ghiaccio fino alla finedell'esperimento.
2. Analisi e calcolo
   1. Analizzare le cellule mediante citometria di flusso. Per l'eccitazione, usare 488 nm di lunghezza d'onda del laser ad argon e per il rilevamento di usare 530 nm di lunghezza d'onda. Impostare il citofluorimetro parametri eseguendo le cellule di controllo negativo. Utilizzare questi parametri per analizzare cellule trattate (Figura 4A). Valutare i dati con il software del produttore, determinare i valori di intensità fluorescente mediana (MFI), e calcolare i valori di MFI relativi.

Results

Le immagini ottenute mediante scansione laser confocale microscopio (CLSM) offrono informazioni spettacolare circa l'assorbimento di coniugati GnRH-FITC sulla data coltura cellulare in un tempo e concentrazione modo dipendente. In parallelo con questi coniugati GnRH-FITC, la presenza del GnRH-IR sulla superficie cellulare è anche verificabile dall'esperimento CLSM. Inoltre, utilizzando una sonda fluorescente colorazione DNA rosso lontano, è possibile colorazione di contrasto nuclei delle...

Discussion

Gli esperimenti descritti nel presente documento utilizzare analoghi del GnRH selettivamente etichettati per lo screening aderenti colture cellulari in vitro. La microscopia confocale e citometria a flusso metodi sono adatti per il monitoraggio e la quantificazione l'assorbimento cellulare di questi coniugati GnRH-FITC in un tempo e concentrazione modo dipendente. Questi esperimenti hanno i seguenti passaggi critici: 1) mantenere una cultura di cellule sane sterili; 2) peptidi GnRH devono essere ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
EBC-1	JCRB Cell Bank	JCRB0820	Carcinoma polmonare umano a cellule squamose
BxPC-3	ATCC	CRL-1687	Adenocarcinoma pancreatico umano
Detroit-562	ATCC	CCL-138	Carcinoma faringeo umano
RPMI-1640 Terreno con L-glutammina	Lonza	BE12-702F	Terreno di coltura per cellule BxPC-3
Eagle's Minimum Essential Medium	Lonza	BE12-611F	Terreno di coltura per cellule EBC-1 e completato con piruvato di sodio allo 0,1% per cellule Detroit-562
Siero fetale bovino	Euro Clone ECS0180L		Completa il terreno di coltura
MycoZap Plus-CL	Lonza	VZA-2012	Completa il terreno di coltura (antibiotici)
Palloni per colture cellulari della linea standard	VWR	10062-872	Fornisce un ambiente di crescita costante e sterile per le cellule
Miscela tripsina-EDTA	Lonza	BE17-161E	Rimuovere le cellule attaccate
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Lonza	BE17-516F	Solvente
Dimetil solfossido	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	Soluzione solvente
di tripano blu, 0,4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	Utilizzato per contare le cellule
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I	prodotto da noi	-	Purezza ≥ 98% (HPLC)
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II	prodotto da		us-Purity ≥ 98% (HPLC)
[Lys8(FITC)]-GnRH-III	prodotto da		noi-Purezza ≥
Vetrino microscopico a 8 pozzetti con fondo in vetro	Ibidi	80826	Utilizzo nell'esperimento CLSM
Piastra per coltura cellulare Corning Costar, 12 pozzetti	Sigma-Aldrich	CLS3513-50EA	Utilizzo nell'esperimento FACS
Soluzione di fissaggio (10% di formalina tamponata neutra)	Bio-Optica	01V60P	Fissare le cellule aderenti
Albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich	A7906-10G	Prevenire il legame aspecifico degli anticorpi
GnRHR Antibody	Proteintech	19950-1-AP	Reagente di immunocitochimica, legarsi ai recettori umani del GnRH di tipo I
Anticorpo secondario, coniugato Alexa Fluor 546	Reagente di immunocitochimica Thermo Fisher Scientific	A11035	legarsi all'anticorpo primario
Soluzione di sonda fluorescente (Draq5)	Thermo Fisher Scientific	62254	Nuclei di controcolorazione
Fluoromount Mezzo di montaggio acquoso	Sigma-Aldrich	F4680-25ML	Uso nell'esperimento CLSM, preservando la fluorescenza
Microscopio invertito	Elektro-Optika Ltd.	Alpha XDS-2T	Controlla il fenotipo e la confluenza delle colture cellulari
Microscopio a scansione laser confocale invertito	Zeiss	LSM-710	Uso nell'esperimento CLSM
Citometro a flusso	BD Biosciences	BD FACSCalibur	Uso nell'esperimento FACS