L'uso di un venoso Central Line per fluidi, farmaci e nutrienti Administration in un modello murino di malattia critica

Sommario

Questo protocollo descrive un modello murino cateterizzato centralmente di malattia critica prolungata. Combiniamo il metodo della legatura e della puntura cecale per indurre la sepsi con l'uso di una linea venosa centrale per la somministrazione di fluidi, farmaci e nutrienti per imitare l'ambiente clinico umano.

Abstract

Questo protocollo descrive un modello di topo cateterizzato centrale di malattia critica prolungata. Uniamo legatura cecale e metodo puntura per indurre sepsi con l'uso di un catetere venoso centrale per fluidi, farmaci e somministrazione di nutrienti per imitare l'impostazione clinica umana. I pazienti critici richiedono il supporto medica intensiva per poter sopravvivere. Mentre la maggior parte dei pazienti si riprenderà in pochi giorni, circa un quarto dei pazienti ha bisogno di una prolungata terapia intensiva e sono ad alto rischio di morire di non risolvere insufficienza multiorgano. Inoltre, la fase di prolungata malattia critica si caratterizza per una profonda debolezza muscolare, ed endocrino e cambiamenti metabolici, la cui patogenesi è attualmente completamente compresa. Il modello animale più ampiamente utilizzati nella ricerca di terapia intensiva è la legatura e la puntura modello cecal per indurre la sepsi. Questo è un modello molto riproducibile, con alterazioni infiammatorie ed emodinamici acuti simili alla SEP umanasis, che è stato progettato per studiare la fase acuta della malattia critica. Tuttavia, questo modello si caratterizza per una elevata letalità, che è diversa dalla situazione clinica umana, e non è sviluppato per studiare la prolungata fase di malattia critica. Pertanto, abbiamo adattato la tecnica posizionando un catetere venoso centrale nella vena giugulare che ci permette di amministrare clinicamente rilevante terapia di supporto, per simulare meglio la situazione clinica umana della malattia critica. Questo modello di topo richiede un ampio intervento chirurgico e terapia intensiva quotidiana degli animali, ma si traduce in un modello rilevante della fase acuta e prolungata della malattia critica.

Introduzione

malattia critica è uno stato di malattia in cui la funzione di uno o più sistemi di organi è ostacolato nella misura in cui il paziente muore, a meno che il supporto mediche intensive viene somministrato. Considerando che la causa iniziale per l'ammissione al reparto di terapia intensiva (ICU) può variare, che vanno da traumi, interventi chirurgici complicati, le ustioni, le riacutizzazioni della malattia a sepsi, tutti i pazienti critici soffrono di danni cellulari, causati da ipoperfusione, ipossia e l'infiammazione eccessiva tra gli altri , che porta a insufficienza d'organo. La maggior parte dei pazienti sopravvivono loro insulto acuto, ma una frazione importante dei pazienti non immediatamente recuperare e hanno bisogno di una prolungata terapia intensiva. Essi sono ad alto rischio di morte a causa di non risolvere insufficienza multiorgano. Inoltre, la fase di prolungata malattia critica si caratterizza per una profonda debolezza muscolare e endocrino e cambiamento metabolico, la cui patogenesi è attualmente completamente compresa.

Diversi rmodelli Odent vengono utilizzati in ambito di ricerca di terapia intensiva. I due modelli più utilizzati sono la somministrazione esogena di lipopolisaccaride (LPS) e legatura cecale e puntura (CLP). Entrambi i modelli sono sviluppati per simulare la fase acuta della sepsi, definita come una disfunzione organo pericolo di vita causato da una risposta dell'ospite dysregulated alle infezioni, e uno dei principali motivi per l'ammissione al ICU universalmente ^{1, 2.} Il modello LPS ha diversi svantaggi, poiché colpisce solo transitoriamente il rilascio di citochine e lo stato emodinamico dell'animale ^3. Differenza di esseri umani, roditori sono anche particolarmente resistenti alle endotossine e l'utilizzo di 'alte dosi' di endotossina è necessario produrre ipotensione e mortalità, con ciò aumentando ulteriormente preoccupazioni della validità di questo metodo ^{4, 5.} L'altro modello, la legatura del cieco e il modello di puntura (CLP)presenta una legatura di una porzione del cieco seguita da una foratura ago attraverso-e-through. Questa procedura causa un'infezione addominale polimicrobica con danno tissutale, seguita da una traslocazione dei batteri nel comparto sangue. Ciò attiverà una risposta infiammatoria sistemica e lo sviluppo della sepsi. Il modello CLP è stato ampiamente riconosciuto come un modello animale di malattia critica acuta che riproduce le caratteristiche principali di sepsi: hyperinflammation, vasodilatazione, ipotensione e aumento della gittata cardiaca ^{6, 7.} Tuttavia, questo modello non permette lo studio del fallimento non risolvere multipla d'organo, atrofia muscolare, ed endocrino e cambiamenti metabolici, che sono tipici per la prolungata fase di malattia critica. Inoltre, di recente la validità dei modelli murini per malattie gravi sono stata messa in discussione, dal momento che i risultati di modelli murini non possono sempre essere tradotti a impostare l'umano ^{8, 9, 10.} Una possibile spiegazione potrebbe essere che la terapia di supporto che viene fornito a pazienti critici umani differisce sostanzialmente dalla cura che viene fornito a topi critici.

Pertanto, per assomigliare l'impostazione umana più vicino e permettere indagine della fase prolungata di malattia critica, abbiamo sviluppato un modello di topo che imita la rianimazione acuta come dato agli esseri umani, come vasta somministrazione di fluidi per via endovenosa e trattamento antibiotico, e che permette per amministrare terapia di supporto, al fine di sopravvivere, la prolungata fase di malattia critica, come il supporto nutrizionale. A questo scopo, abbiamo adattato il modello murino di sepsi CLP-indotta, essendo lo standard d'oro per sepsi, e collocato una linea venosa centrale che permette la somministrazione di fluidi, nutrizione e droghe.

Protocollo

Il protocollo è stato approvato dalla University of Leuven Ethical Review Board per la ricerca sugli animali.

1. Preparazione della linea venosa

1. Preparare la punta del catetere venoso immergendo rapidamente la parte centrale di 60 cm microrenathane (MRE) tubi in caldo olio di sesamo (> 220 ° C). Successivamente allungare la parte centrale del tubo per produrre un diametro ristretto (diametro esterno (OD) <0,5 mm) delicatamente spostando le estremità del tubo distanti.
2. Utilizzare una lama di bisturi per tagliare il tubo in due parti di 30 cm ciascuno (vedere Figura 1, Tabella 1).
3. Collegare il tubo MRE al polietilene tubo PE10 usando connettore polietilene PE50 e collegare questi tubi PE10 alla parte inferiore dello snodo. Collegare la parte superiore della parte girevole per tubi PE10, e collegarlo ad una stub ago Luer con PE50 tubo connettore di cui alla figura 1.
4. Applicare forte fast-acting colla adesiva a tutte le connessioni e testare il catetere per perdite mediante lavaggio con aria. Gas sterilizzare il catetere prima dell'uso.

Figura 1: La costruzione della linea venosa. Linee venose sono preparati stirando il tubo MRE ad un piccolo diametro e collegandolo tramite tubo di polietilene ad un dispositivo roditore girevole. Vedere la Tabella 1 per le istruzioni su lunghezze delle varie parti. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Leggenda	Lunghezza	Volume
1) Luer stub ago 22sol
2) PE50 - polietilene 0,023" x 0,038"	5 cm	13 microlitri
3) PE10 - polietilene .011" x .024”	50 cm	30 microlitri
4) roditore girevole 20 G
5) PE-10	15 cm	9 ml
6) PE-50 (connettore)	5 cm	13 microlitri
7) MRE025 Tip allungato microrenathane .025" x .012"	30 cm	27 microlitri
Somma totale	105 cm	92 microlitri

Tabella 1: Costruzione di venoso linea. Questa tabella fornisce una legenda per la Figura 1.

2. Anestesia e Manipolazione di pre-intervento chirurgico

1. Utilizzare 24 settimane vecchio maschio C57BL 6J / (27-32 g).
   NOTA: Usiamo 24 settimane di età topi (in età matura) come questa età corrisponde meglio con l'età media dei pazienti in terapia intensiva. Usiamo solo topi maschi per evitare l'influenza ciclica di estrogeni. La tecnica può essere utilizzata anche su animali giovani (testato a 16 settimane di età topi) e le femmine, se si preferisce.
2. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici prima dell'uso. Lavare il catetere venoso sterile fatta in casa con soluzione salina per rimuovere eventuali bolle d'aria e per verificare la pervietà e perdite potenziali.
3. Tagliare un filo metallico (diametro 0,8 mm) di 80 cm di lunghezza, raddoppiare piegando e fare un ciclo. Piombo 3 perle sopra il filo raddoppiato al loop. Collegare il catetere al filo metallico guidando la punta del catetere attraverso le 3 perle.
   NOTA: Il filo metallico di fissaggio è necessaria per la rotazione della parte girevole al quale è collegato il catetere. Come tale, il mouse può muoversi liberamente, senza bloccare la linea venosa.
4. Anestetizzare il mouse da un intraperitoneale (IP) iniezione di una miscela di 0,03 ml di ketamina (100 mg / kg) e 0,02 mL xilazina (13 mg / kg). Assicurarsi che l'anestesia sia adeguata verificando l'assenza di riflessi. tirare delicatamente la linguetta mouse all'esterno con una pinza per evitare soffocamento deglutizione della lingua.
   NOTA: Se dopo 10 minuti, il mouse tenta ancora di ritirare le sue membra danno ketamina supplementare come mL bolus 0,01.
5. Radere l'area chirurgica compreso addome, parte ventrale del collo (triangolo tra mento, sterno e clavicola), e tra le scapole alla base della testa).
6. Posizionare il mouse in posizione prona su una piastra elettrica pre-riscaldato, disinfettare la pelle con 70% etanolo e applicare una piccola quantità di lubrificante oftalmica per proteggere gli occhi secchi. Infiltrarsi nelle siti chirurgici (addome, collo, anteriore e posteriore) con 0,2 mL ropivacaina (0,67 mg / kg).
7. Mentre il mouse è ancora in posizione prona, fare una piccola incisione alla base del lato dorsaledella testa con bisturi o forbici. Esporre i muscoli cervicali posteriori, e legare il muscolo al loop del filo allegato con 3.0 nylon conducendo un filo di nylon 3.0 sotto il muscolo.
8. Posizionare il mouse sul lato destro. Fare una piccola incisione verticale nella pelle del collo ventrale con un bisturi o forbici. Sotto guida visiva, tunnel un ago calibro 18 sottocutanea attraverso questa incisione ventrale verso l'incisione sul retro effettuata in precedenza e infilare il catetere attraverso l'ago di esteriorizzare in corrispondenza del lato ventrale.
9. Posizionare il mouse sul dorso. Passare un filo di nylon 3.0 dietro ai denti incisivi del mouse e nastro fino al pad riscaldamento. Fissare la testa in una maschera per l'erogazione di ossigeno (2 L / min). Fissare il mouse in una posizione allungata con nastro adesivo lungo la coda e le due arti anteriori.
   NOTA: se solo l'anestesia ketamina-xilazina non è sufficiente, isoflurano per via inalatoria (0,5-1,5%) possono essere consegnati durante l'intervento chirurgico.

3. Il posizionamento di un catetere cronica Indwelling

1. Posizionare il mouse sotto il microscopio da dissezione. Nel incisione fatta precedentemente nel collo ventrale, giro delicatamente tessuto grasso e ghiandole via con pinza finché la vena giugulare può essere visualizzato.
2. Mezzi termini sezionare per liberare la vena giugulare dal tessuto connettivo sottocutaneo e sopra e attorno al vaso posizionando la punta della pinza tra la vena e il tessuto connettivo e aprendo la pinza ripetutamente in parallelo con la vena. Come tali, i danni alla vena sarà evitata.
3. Isolare la vena giugulare mettendo forcipe smussato sotto la vena. Sfamare tre pezzi di filo di seta 3.0 sotto la vena, posizione di un pezzo prossimale alla biforcazione della vena giugulare (legatura cranico) e un pezzo vicino al muscolo sternocleidomastoideo (caudale legatura). Stringere la legatura cranica e la legatura caudale per allungare la vena e prevenire un eccessivo sanguinamento durante l'inserimento del catetere. Tcioè una legatura sciolto con il filo centrale per garantire un facile fissaggio del catetere in seguito.
4. Utilizzando forbici micro, fare un'incisione lungo la vena tra le legature craniale e caudale e abbastanza grande per passare il catetere. Afferra il catetere con una pinza, ed inserire il catetere 11 mm nella vena. Liberamente fissare il catetere legando fuori la legatura centrale e confermare il corretto posizionamento da vampate di calore delicatamente con soluzione salina sterile.
5. Fissare il catetere con fermezza legando fuori la legatura centrale e caudale intorno alla nave e catetere. Tie finisce di legatura caudale e medio insieme per fissare saldamente il catetere. Assicurarsi che i nodi non occludono la vena, irrigando il catetere dopo ogni nodo fatto. Infine, legare il caudale e legature cranici. Chiudere l'incisione con punti di sutura 5.0 seta.

4. del cieco legatura e puntura

1. Fare un 1-cm incisione mediana attraverso la pelle della metà inferiore dell'addome con bisturi o forbici;fare attenzione a non penetrare nella cavità peritoneale.
2. Identificare la linea alba della muscolatura addominale e fare un'incisione intramuscolare per ottenere l'ingresso nella cavità peritoneale. Individuare il cieco, e utilizzare pinze anatomiche smussato per isolare il cieco e esteriorizzare esso.
3. Legare il cieco al 50% della sua lunghezza con suture 3.0 seta. Assicurarsi di non legare la valvola ileocecale in modo che la continuità intestinale viene mantenuta.
4. Perforare la cieco con un ago calibro 18 da un singolo passante e passante a metà strada tra puntura legatura e la punta del cieco. Dopo aver rimosso l'ago, estrudere una piccola quantità di feci dal foro per assicurare la pervietà.
5. Riposizionare l'intestino nella cavità addominale, e chiudere il peritoneo e la pelle con punti di sutura 5.0 seta.
   NOTA: In media, una nuova tirocinante richiede dai 10 ai 15 animali per essere in grado di collocare agevolmente il catetere venoso ed eseguire CLP all'interno di 45 min. Dopo il periodo di formazione, un'anestesia / chirurgia related mortalità del 10% può essere previsto.

Il trattamento 5. post-chirurgica e Rianimazione Fluid

1. Posizionare il mouse in posizione supina e fissare il catetere al filo allegato con nastro. Muovi il mouse per una gabbia individuale. Utilizzare un supporto con morsetto regolabile per tenere il dispositivo girevole 25 cm sopra il mouse e il nastro saldamente la parte libera del filo metallico attaccamento al punto di rotazione della parte girevole.
2. Attaccare una siringa contenente la miscela di colloidi e cristalloidi bilanciati (1: 4) alla linea venosa per iniziare rianimazione fluido.
3. Posizionare la gabbia in temperatura controllata (27 ° C) mobile animale con 12 ore di luce e cicli scuri e iniziare rianimazione fluido endovenoso (10 mL / kg / h) mediante una pompa di infusione accurata siringa-driven. Fornire arricchimento gabbia, come materiale di nidificazione e un blocco di legno.

6. Terapia Intensiva

1. A 6 ore dopo l'operazione, per via sottocutanea iniettare dolore medication e antibiotici (0,3 mL buprenorfina (0,15 mg / kg) e 0,2 mL di imipenem (16.67mg / kg)). NOTA: Dopo pratica di medicina degli animali da laboratorio standard, la prima dose di antidolorifici è data prima della incisione chirurgica iniziale e poi come indicato dalle politiche veterinari dell'istituzione. iniezioni sottocutanee devono essere attentamente iniettati nello spazio sottocutaneo.
2. Dopo 20 - 24 h di rianimazione fluido, sostituire i cristalloidi / colloidi di nutrizione parenterale totale (6,67 mL / kg / h).
   NOTA: La nutrizione parenterale totale amministrato (5,8 kcal / 24 h) copre circa il 40% del fabbisogno calorico giornaliero di topi, simili ai primi apporto calorico dei pazienti nel reparto di terapia intensiva.
3. Sottocutanea somministrare farmaci antidolorifici e antibiotici (0,6 mL buprenorfina (0,3 mg / kg) e 0,2 mL di imipenem (16,67 mg / kg) ogni 12 ore durante l'intero periodo di malattia critica.
4. Controllare gli animali almeno ogni 3 ore durante il giorno. Valutare la sofferenza dando un dolorepunteggio basato sul mouse scala smorfia convalidato ^11. Intensificare il monitoraggio per gli animali con un punteggio elevato dolore.

7. fine dell'esperimento

NOTA: Approvazione e raccomandazioni sul livello di gravità del modello e le linee guida e le politiche per gli endpoint umani dovrebbe essere cercato dal Institutional Review Board etico locale per la ricerca sugli animali.

NOTA: In caso di una linea venosa non funzionali come catetere bloccato, delocalizzazione del catetere, problemi con la pompa a siringa, l'animale è escluso dallo studio e sacrificati.

1. Al termine del periodo sperimentale, profondamente anestetizzare il mouse usando una miscela di 0,03 ml di ketamina (100 mg / kg) e 0,02 ml (13 mg / kg) xilazina. Eutanasia il mouse ritirando sangue mediante puntura cardiaca. Conservare scatto campioni di tessuto congelati di interessi a -80 ° C.

Risultati

Topi C57BL / 6 sono state fatte in condizioni critiche come descritto sopra. Abbiamo eseguito due esperimenti per valutare la sopravvivenza post-CLP fino a due punti di tempo: la sopravvivenza fino al giorno 5 (n = 15) e la sopravvivenza fino al giorno 7 (n = 22) post-CLP. curve di sopravvivenza dei due esperimenti non erano significativamente differenti (rispetto fino al giorno 5), che indica la riproducibilità del setup sperimentale. gli animali non sopravvissuti sono stati trovati mor...

Discussione

Abbiamo sviluppato un modello murino più clinicamente rilevante di malattia critica, combinando il metodo di legatura e puntura cecale indurre sepsi con l'uso di un catetere venoso centrale per fluidi, farmaci e amministrazione nutrienti. Questo apparato sperimentale è riproducibile, permette di studiare la prolungata fase di malattia critica e si traduce in un tasso di mortalità stabile, con la presente imitando la situazione clinica umana ^1.

Legatura cecale e la...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Buprenorfina	Ecuphar		Vetergesic 0,3 mg/mL
C57BL/6	Janvier labs	C57BL/6JRj
colloidi	Fresenius Kabi		Volulyte 6%
crystalloids	Baxter		Plasmalyte a viaflo
Ethilon 3.0	Ethicon	F3211
Imipenem	MSD		Tienam 500  mg polvere per iniezione fluido
Isoflurano	Eurovet		Iso-vet
Ketamina	Eurovet		Nimatek 100 mg/mL
LocTite Super colla3 tutte le materie plastiche	Rectavit	119818
Mersilk 3.0	Ethicon	L192
Mersilk 5.0	Ethicon	F682
Microrenathane .025" O.D. x .012" I.D.	Bioseb	MRE-025
olimel N7E	Baxter
PE10 - Polietilene .011" x .024"	Instech Solomon	BTPE-10
PE-50 tubo .023" x.038"	Instech Solomon	BTPE-50
Roditore Girevole 20 G	Bioseb	RS-20G
Ropivacaï ne	Astrazenica		Naropin 2  mg/mL
di xilazina	VMD		xilazina cloridrato 2%