Qui si descrive un metodo rapido equilibrio di dialisi (RED) per misurare farmaco legame caseum da lesioni tubercolosi polmonare e cavità. Il protocollo viene utilizzato anche con una matrice macrofagi derivato schiumosa che è un surrogato efficace caseum.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
L'eradicazione della malattia di tubercolosi richiede regimi farmacologici che possono penetrare negli strati multipli di lesioni polmonari complesse. La distribuzione dei farmaci nei corpi caseosi delle cavità e delle lesioni è particolarmente cruciale perché ospitano sottopopolazioni di batteri tolleranti ai farmaci comunemente indicati come persistenti. I metodi esistenti per la misura della penetrazione di farmaci nelle lesioni della tubercolosi comportano costi costosi e che richiedono molto tempo gli studi farmacocinetici in vivo accoppiati a tecniche bioanalitiche o di imaging. La misura in vitro della legame di farmaci a macromolecole di caso è stata proposta come un'alternativa a tali tecniche in quanto tale legame ostacola la diffusione passiva delle molecole di farmaco attraverso il caso. La dialisi di equilibrio rapido è un sistema veloce e affidabile per eseguire studi di legame tra proteine plasmatiche e tessuti. In questo protocollo abbiamo usato un dispositivo rapido di dialisi di equilibrio (RED) per misurare il legame dei farmaci a homogenati del casoDalle lesioni e dalle cavità dei conigli infetti da tubercolosi. Il protocollo descrive anche come generare una matrice surrogata da macrofagi THP-1 caricati da lipidi da utilizzare in sostituzione del caso. Questo test di associazione di caso / surrogato è uno strumento importante nella scoperta di droga della tubercolosi e può essere adattato per aiutare a studiare la distribuzione dei farmaci nelle lesioni o negli ascessi causati da altre malattie.
Introduzione
Il trattamento della malattia della tubercolosi polmonare richiede una distribuzione efficace di farmaci in diversi tipi di lesioni. Le lesioni e le cavità nocrotiche contengono centri caseosi che ospitano sottopopolazioni di batteri tolleranti o "persistenti". 1 , 2 La malattia cavitaria è associata a tassi di cura inferiori e prognosi scarsa. 3 , 4 Precedenti studi hanno mostrato, utilizzando tecniche quantitative e di imaging, che la capacità di penetrare nel caso è significativamente diversa da una classe di medicinali all'altra.
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Protocollo
Tutti gli studi sugli animali sono stati eseguiti in conformità alla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio degli Istituti Nazionali di Salute con l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della NIAID (NIH) di Bethesda, MD. Tutti gli studi riguardanti la M. tuberculosis sono stati eseguiti in un laboratorio con livello di contenimento della biosicurezza 3 (BSL-3).
1. Modello di infezione del coniglio e collezione di Caseum
- Infettare conigli bianchi della Nuova Zelanda con M. tuberculosis utilizzando un sistema di esposizione agli aerosol so....
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Risultati
Usando questo protocollo, abbiamo testato centinaia di composti di sviluppo della droga della tubercolosi per la loro efficacia prevista a penetrare nel caso. La figura 1 mostra i concetti base del test RED. La membrana di dialisi degli inserti RED permette alle piccole molecole non legate di diffondere dal pozzo del donatore al pozzo del ricevitore, raggiungendo infine un equilibrio tra i due compartimenti. Piccole molecole che sono legate a macromolecole come proteine .......
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Discussione
lesioni necrotiche polmonari e cavità in pazienti infettati tuberculosis contengono sottopopolazioni di batteri che sono recalcitranti al trattamento farmacologico. I nuclei caseosi di queste strutture sono particolarmente responsabili per ospitare queste persistenti in un ambiente extracellulare. 16 la distribuzione favorevole di agenti anti-batterici in questi luoghi remoti si crede di essere un importante determinante di efficacia della tubercolosi farmaco. Prima della convalida di questo prot.......
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Dichiarazioni
Non ci sono interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Desideriamo ringraziare Johnson & Johnson, la TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X e Trius Therapeutics per la fornitura di bedaquiline, PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid e tedizolid, rispettivamente. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li e Danielle Weiner fornito supporto con analisi MALDI, metodi bioanalitici, preparazione del surrogato caseum, sintesi chimica, e l'isolamento di coniglio caseum. Questo lavoro è stato condotto con il finanziamento del Fondazione Bill e Melinda, premio # OPP1044966 e OPP1024050 a V. Dartois, NIH Shared Strumentazione di Grant S10OD018072, così come il finanziamento congiunto ....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Conigli bianchi della Nuova Zelanda | |||
| Mycobacterium tuberculosis | BEI Risorse | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamina) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xilazina) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodico e fenitoina sodica) Soluzione | Virbac | 710101 | |
| linea cellulare monocitica THP-1 | ATCC | ATCC TIB-202 | |
| 175 cm² Pallone trattato con TC (T175) | Fisher Scientific | T-3400-175 | |
| RPMI 1640 terreni senza glutammina | Fisher Scientific | MT-15-040-CV | |
| Siero fetale bovino iclonato, irradiato con gamma | Fisher Scientific | SH3091003IR | |
| Iclone L-glutammina, 200 mM | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| Piastra TC Cellstar, 145 mm x 20 mm, ventilato | Fisher Scientific | T-2881-1 | |
| Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA) | Fisher Scientific | BP685-1 | |
| Acido etilendiamminotetraacetico | Sigma | E6758 | |
| Acido oleico | Fisher Scientific | ICN15178101 | |
| Piastra di base riutilizzabile per dispositivo Pierce RED | Fisher Scientific | PI-89811 | |
| Inserti per dispositivi Pierce RED, 50/scatola | Fisher Scientific | PI-89809 | |
| Strumento di rimozione dell'inserto Pierce RED | Fisher Scientific | 89812 | |
| Guarnizione adesiva | Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| PBS, pH 7,4, 10x 500 mL (Gibco) | Tecnologie per la vita | 10010-049 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | |
| Acetonitrile | Sigma | 34998 | |
| Metanolo | Sigma | 34860 | |
| Verapamil cloridrato | Sigma | V4629 | |
| Diclofenac sale sodico | Sigma | 93484 | |
| Soluzione di tripano blu, 0,4% | Fisher Scientific | 15-250-061 | |
| Etanolo, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| 2010 Geno/Grinder | SPEX SamplePrep | 2010 | |
| Omogeneizzatore per mulino di perline, perline di metallo sfuse Fisher | Scientific | 15-340-158 | |
| 484R Cobalto 60 Irradiatore | JL Shepard | 7810-484-1 | |
| INCYTO Ematocitometri monouso C-Chip | Fisher Scientific | 22-600-100 | |
| Microscopio ottico verticale | Leica | DM1000 | |
| Sistema binario di cromatografia liquida | Agilent | 1260 | di massa multi-compenente |
| AB Sciex | 4000 |
Riferimenti
- Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis. Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).
- Zhang, Y. Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis. Fron....
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Ristampe e permessi
