Studi struttura-funzione nel topo cellule staminali embrionali Uso ricombinasi mediata Cassette Scambio

Summary

Le proteine ​​contengono spesso più domini che possono esercitare diverse funzioni cellulari. Gene knock-out (KO) non considerano questa diversità funzionale. Qui riportiamo un cambio cassette ricombinazione mediata (RMCE) approccio basato lo struttura-funzione in cellule staminali embrionali KO che consente la dissezione molecolare dei vari domini funzionali o varianti di una proteina.

Abstract

ingegneria gene in embrioni di topo o cellule staminali embrionali (mESCs) permette per lo studio della funzione di una data proteina. Le proteine ​​sono i cavalli della cellula e spesso costituiti da più domini funzionali, che possono essere influenzate da modificazioni post-traduzionali. La riduzione dello intera proteina in condizionale o costitutiva knock-out (KO) topi non tiene conto di questa diversità funzionale e regolazione. Una linea Mesc e un modello di topo derivato, in cui è stato inserito un sito di attracco per FLPE scambio cassette ricombinazione mediata (RMCE) all'interno del locus ROSA26 (R26), è stato riportato in precedenza. Qui riportiamo un approccio struttura-funzione che permette di dissezione molecolare delle diverse funzionalità di una proteina multidominio. A tal fine, i topi RMCE-compatibili devono essere incrociati con topi KO e mESCs KO quindi compatibili con RMCE devono essere isolati. Successivamente, un gruppo di costrutti di soccorso putativi può essere introdotto nel locus R26 via RMCE targeting. I cDNA di soccorso candidati possono essere facilmente inseriti tra i siti RMCE del vettore targeting utilizzando la ricombinazione clonazione. Successivamente, mESCs KO sono transfettate con il vettore targeting in combinazione con un'espressione ricombinasi plasmide FLPE. RMCE riattiva il gene neomicina-resistenza promotore-meno negli attracco siti ROSA26 e consente la selezione della manifestazione di targeting corretto. In questo modo, l'efficienza elevata di targeting vicino al 100% si ottengono, consentendo l'inserimento di diversi costrutti salvataggio putativi in ​​modo semi-alta produttività. Infine, un gran numero di costrutti di soccorso R26-driven possono essere testati per la loro capacità di salvare il fenotipo che è stato osservato in parentali mESCs KO. Presentiamo uno studio struttura-funzione a prova di principio in p120 catenina (p120ctn) mESCs KO utilizzando differenziazione endoderma in corpi embrionali (EBS) come la lettura fenotipica. Questo approccio consente l'identificazione di domini importanti vie a valle putativi, e punto malattie rilevantimutazioni che sono alla base fenotipi KO per una data proteina.

Introduction

Si stima che i genomi dei mammiferi contengono circa 20.000 geni codificanti proteine. Lo splicing alternativo e modificazioni post-aumentare ulteriormente il repertorio di proteine. Proteine hanno una struttura modulare ¹ e spesso contengono più domini di interazione, che permettono la loro assunzione in diversi complessi proteici e la loro partecipazione molteplici processi cellulari ^2. Un esempio è la proteina multi-funzionale chiamato p120ctn. p120ctn è codificata dal gene Ctnnd1 e consiste in una grande dominio centrale armadillo ripetizione affiancato da un N-terminale ed una regione C-terminale. Il domin....

Protocol

Tutti gli esperimenti sui topi sono stati condotti secondo le norme animali istituzionali, nazionali, ed europei.

1. Isolamento di mESCs KO-compatibili RMCE

1. Razza topi eterozigoti KO con i topi RMCE-compatibile, come ad esempio i topi ROSALUC ¹⁰ o topi ROSA26-IPSC ^21. Entrambi i topi RMCE-compatibili sono stati mantenuti su un 129 / C57BL6 / sfondo misto svizzero.
   NOTA: L'incrocio con topi KO eterozigoti si consiglia di superare letalità embrionale nei topi KO omozigoti.
2. Utilizzare PCR per selezionare topi KO eterozigoti che contengono una cassetta RMCE nel locus R26 ^1....

Results

La procedura di isolare linee KO Mesc RMCE-compatibile è illustrato nella figura 2. Due allevamenti consecutivi devono ottenere RMCE compatibile blastocisti KO. In primo luogo, i topi KO eterozigoti sono incrociate con i topi RMCE-compatibile, per ottenere topi KO eterozigoti RMCE-compatibili. Questi topi sono poi utilizzati per accoppiamenti a tempo con altri topi KO eterozigoti per ottenere 3,5-DPC, compatibile con RMCE, omozigoti blastocisti KO. La possibilità di otte.......

Discussion

Il nostro metodo di isolamento Mesc è user-friendly e non richiede competenze o attrezzature avanzate, come la microchirurgia della blastocisti. Così, questa tecnologia è accessibile a una larga parte della comunità scientifica. Chiunque abbia esperienza di base coltura cellulare può propagare escrescenze ICM e stabilire linee mESCs. Tuttavia, il lavaggio e la manipolazione di blastocisti richiede una certa pratica. Una pipetta bocca è usato per trasferire blastocisti e consiste di una micropipetta, un supporto micropip.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ROSALUC Topi	fatti in casa		sperma congelato disponibile su richiesta
Topi R26-iPSC	fatti in casa		sperma congelato disponibile su richiesta
Sonda per vasi	Fine Science Tools	10160-13	per verificare la presenza di tappi di copulazione
M2 medio	Sigma-Aldrich	M7167	fare aliquote e conservare a -20 ° C
Pinze fini (Dumont #5 Punta standard Pinze per studenti)	Fine Science Tools	11251-10	spruzzare con il 70% di EtOH prima dell'uso (non sterilizzare in autoclave)
Aghi da 23 G	Siringhe Fine-ject	8697
1 ml	Soft-ject	6680
Piastre di grado batterico da 60 mm (per il lavaggio)	Gosselin	BB60-01
Pipetta orale	prodotta in casa		vedi discussione
Fibroblasti embrionali di topo (MEF, TgN (DR4)1 ceppo Jae)	ATTC	SCRC-1045
TgN (DR4)1 Topi Jae	The Jackson Laboratory	3208
Mitomicina C	Sigma-Aldrich	M0503
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza calcio o magnesio	Gibco	14190-094
Tg(DR4)1Jae/J topi	JAX	3208	topi che contengono quattro geni selezionabili dal farmaco e DR4 MEFS conferisce resistenza a neomicina, puromicina, igromicina e 6-tioguanina
0,1% Gelatina	Sigma-Aldrich	G1393	Sciogliere 0,5 g in 500 ml di acqua distillata, sterilizzare in autoclave e conservare a 4 °C.
Tripsina (0,25%)	Gibco	25200-056
2 μ M pluripotin	Cayman Chemical	10009557
collezione pRMCE-DV1	BCCM/LMBP	LMBP 08870	pubblico disponibile dalla collezione BCCM/LMBP (http://bccm.belspo.be)
raccolta pRMCE-DV1 BCCM/LMBP cre-asportata		LMBP 08195	pubblico disponibile dalla collezione BCCM/LMBP (http://bccm.belspo.be)
pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA	Addgene	20733
termico competente DH5 e batteri alfa	fatto in casa
Gateway pDONR221 vettore	Thermo Fisher	12536-017	contiene gene di resistenza alla kanamicina
BP clonasi II mix	Thermo Fisher	11789-020
LR clonasi II mix	Thermo Fisher	11791-020
Brodo Luria (LB)
Anficillina
Applied Biosystems 3730XL Analizzatore di DNA	Thermo Fisher	3730XL
G418	Thermo Fisher	11811-023
Reagente di trasfezione Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	11668027
Reagente di trasfezione Lipofectamina LTX	Thermo Fisher	15338100
Reagente	di trasfezione EffecteneQiagen	301425
GATEWAY pENTR 1A vettore	Thermo Fisher	A10462	ricombinazione
anticorpo anti-p120ctn anticorpo	BD Transduction Laboratories	610134
monoclonale di topo anticorpo anti-Ecaderina	BD Transduction Laboratories	610181
General equipment
		sterili per la dissezione	forbici fini e pinze per la dissezione dell'utero
Pipette sterili: 5 mL, 10 mL e 25 mL
Provette
coltura a 96 pozzetti Fondo a V e fondo piatto.
Piastre di coltura: 24 pozzetti, 12 pozzetti e 6 pozzetti Pipette
multicanale (per pipettare 30, 50, 100 e 200 μ L)
Serbatoi sterili multicanale Accesso
a un flusso
Accesso a un incubatore a 37 gradi C con 5% di CO2
Accesso a un microscopio
Accesso a una centrifuga
Accesso a uno stereomicroscopio a luce trasmessa
Culture support
MEF Medium			immagazzinato a 4 gradi; C; caldo 30 min a 37 ° C prima dell'uso
Dulbecco' s Eagle modificato' s medium (DMEM)	Gibco	41965-062
10% siero fetale bovino (FBS)	Sigma-Aldrich	F-7524
L-glutammina (2 mM)	Gibco	25030-024
Piruvato di sodio  (0,4 mM)	Gibco	11360-039
penicillina (100 U/mL)	Gibco	15140-122
streptomicina (100 µ g/mL)	Gibco	15140-122
SR basato su mESC medium			conservato a 4 gradi; C; caldo 30 min a 37 ° C prima dell'uso
DMEM/F12	Gibco	31330-038	miscelato in un rapporto 1:1
15% sostituzione del siero knock-out (SR)	Gibco	10828... 028
L-glutammina (2 mM)	Gibco	25030-024
0,1 mM di aminoacidi non essenziali	Gibco	11140-050
penicillina (100 U/mL)	Gibco	15140-122
streptomicina (100 µ g/mL)	Gibco	15140-122
β-mercaptoetanolo (0,1 mM)	Sigma-Aldrich	M 3148
2.000 U/mL di topo ricombinante LIF	(IRC/VIB Protein Service facility)
Terreno mESC basato su FBS (simile al terreno mESC basato su SR)			immagazzinato a 4°; C; caldo 30 min a 37° C prima dell'uso
Knockout DMEM	Gibco	10829-018
15%	FBS Hyclone	SH30070.03E
Differention Medium			immagazzinato a 4 gradi; C; caldo 30 min a 37 ° C prima dell'uso
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Gibco	21980-032
15%	FBS Hyclone	SH30070.03E
5% CD Ibridoma Medio (1x) liquido	Gibco	11279-023
2 mM di L-glutammina	Gibco	25030-024
0,4 mM 1-tioglicerina	Sigma-Aldrich	M-6145
50 μ g/mL di acido ascorbico	Sigma-Aldrich	A-4544
penicillina (100 U/mL)	Gibco	15140-122
streptomicina (100 µ g/mL)	Gibco	15140-122
2i
1 μ M Erk inibitore PD0325901	Axon Medchem	Axon 1408
3 μ M Inibitore Gsk3 CHIR99021	Axon Medchem	Axon 1386