Preparazione e caratterizzazione di novel nanoparticelle che imitano HDL per l'incapsulamento del fattore di crescita del nervo

Sommario

L'omogeneizzazione semplice è stata usata per preparare nanoparticelle nuove, ad alta densità, che simulano lipoproteine ​​per incapsulare il fattore di crescita del nervo. Le sfide, i protocolli dettagliati per la preparazione di nanoparticelle, la caratterizzazione in vitro e gli studi in vivo sono descritti in questo articolo.

Abstract

L'obiettivo di questo articolo è quello di introdurre metodi di preparazione e caratterizzazione per le nanoparticelle (NP) di carico di NFF-caricato, ad alta densità, lipoproteine ​​(HDL). Le HDL sono NPs endogene e sono state esplorate come veicoli per la consegna di agenti terapeutici. Sono stati sviluppati diversi metodi per preparare NPs che imitano HDL. Tuttavia, sono generalmente complicate, richiedono molto tempo e sono difficili per la scala industriale. In questo studio, l'omogeneizzazione in un passo è stata usata per mescolare gli eccipienti e formare i prototipi NP. NGF è una proteina solubile in acqua di 26 kDa. Per facilitare l'incapsulamento di NGF nell'ambiente lipidico dei NP NPN che imitano HDL, la protamina USP è stata usata per formare un complesso di ioni-coppia con NGF per neutralizzare le cariche sulla superficie NGF. Il complesso NGF / protamina è stato quindi introdotto nei prototipi NP. Apolipoproteina AI è stata finalmente ricoperta sulla superficie dei NP. NGF HDL-imitando NP hanno mostrato preferibili proprietà in terminiS di dimensione delle particelle, distribuzione delle dimensioni, efficienza di entrapment, rilascio in vitro , bioattività e biodistribuzione. Con l'accurata progettazione e l'esplorazione dell'omogeneizzazione in NPs che imitano HDL, la procedura è stata notevolmente semplificata e gli NP sono stati resi scalabili. Inoltre, sono state superate diverse sfide, come la separazione di NGF scaricati dai NP, che conduce affidabili studi di rilascio in vitro e misurando la bioattività dei NP.

Introduzione

Macromolecole, come proteine, peptidi e acidi nucleici, stanno emergendo come farmaci promettenti e hanno guadagnato una notevole attenzione negli ultimi decenni ^{1 , 2} . A causa della loro elevata efficacia e modalità di azione specifica, essi presentano un grande potenziale terapeutico per i trattamenti del cancro, della malattia immunitaria, dell'HIV e delle condizioni correlate ^{3 , 4} . Tuttavia, le proprietà fisiochimiche, come la loro grande dimensione molecolare, la struttura tridimensionale, le cariche superficiali e la natura idrofila, rend....

Protocollo

NOTA: Gli studi sugli animali inclusi in tutte le procedure sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università di North Texas Health Science Center.

1. Preparazione delle nanoparticelle NGF HDL-imitanti

1. Sciogliere gli eccipienti, fosfatidilcolina (PC), sfingomielina (SM), fosfatidilserina (PS), colestero olio (CO) e D-a-tocoferil polietilenglicol-succinato (TPGS) in etanolo per preparare soluzioni a 1 mg / ml.
   NOTA: Le soluzioni di stock sono state sottoposte a aliquota e conservate a -20 ° C. L'oleato di colesterilico è stato conservato in bottiglie scure. Le soluzioni PC, SM, P....

Risultati

Nella figura 1 è mostrato lo schema di ingegnerizzazione dei NPs NGF rivestiti con α-tocoferolo emulsionati in HDL preparati da una strategia di ioni-coppia. Per neutralizzare le cariche superficiali di NGF, la protamina USP è stata usata come agente di ioni-coppia per formare un complesso con NGF. Per proteggere la bioattività, sono stati progettati prototipi NPs che imitano HDL, in primo luogo utilizzando l'omogeneizzazione; Quindi il complesso NGF / protamina è st.......

Discussione

In questo studio dimostriamo un metodo semplice per preparare NPs imitanti HDL per l'incapsulamento di NGF. Sono stati studiati diversi sistemi di erogazione di NP per fornire proteine. Attualmente, molti preparati NP coinvolgono la dialisi, la precipitazione dei solventi e l'idratazione del film. Questi processi sono generalmente complessi e impegnativi in ​​termini di scalabilità. Durante questo sviluppo di NP, è stato determinato che i lipidi avevano una forte adesione alla parete di vetro del contenitore, ch.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Beta-NGF umano ricombinante	Biomart creativo	NGF-05H
L-&alfa;-fosfatidilcolina (PC)	Avanti	131601P	95%, uovo,
sfingomielina di pollo (SM)	Avanti	860062P	cervello,
fosfatidilserina suina (PS)	Avanti	840032P	cervello,
colesteril oleato suino (CO)	Sigma	C9253
D-&alfa;-Tocoferil polietilenglicole succinato (TPGS)	BASF	9002-96-4	Vitamina E Polietilenglicole Succinato Protamina
solfato	Sigma	P3369	soddisfa le specifiche dei test USP
Apolipoproteina A1, Plasma umano	Atene Ricerca & Tecnologia	16-16-120101	1 mg in 671 µ L 10 mM NH4HCO3, pH 7,4
Sepharose 4B-CL	Sigma	CL4B200	Agarosio reticolato,  materiale di riempimento della colonna per cromatografia con filtrazione su gel
Kit ELISA a sandwich per NGF	R& Sistema D	DY008
Siero bovino Albumina Sigma		A2153
RPMI-1640 medio	GE Healthcare Life Science	SH30096.02
Siero di cavallo	GE Healthcare Life Science	SH30074.03
Siero fetale bovino	Gibco	10082147
PC12 cellule	ATCC	CRL-1721
Coda di ratto collagene tipo I	Sigma	C3867
Acetato di sodio	Sigma	S2889
Cloruro di sodio	Sigma	31414
Triton X-100	Sigma	T8787
Fenilmetanosulfonilfluoruro (PMSF)	Sigma	P7626
Cloruro di benzetonio	Sigma	B8879
Nome	Azienda	Numero di catalogo<	strong>Comments
Equipment
Omogeneizzatore	Tekmar	T 25-S1
Delsa Nano HC	analizzatore di particelle Beckman-Coulter	Delsa Nano HC
Float-A-Lyzer G2 Dispositivo per dialisi	Spectrum Laboratories	G235036	Molecule Cutoff 300 kDa
Centrifuga	Eppendoff	5424R
Omogeneizzatore Polytron	Kinematica	PT 1200C
DecapiCone	Braintree Scientific Inc.	DC-M200