Isolamento Droplet per l'analisi quantitativa dei lipidi Spettrometria di Massa

Goccioline lipidiche sono altamente dinamici organelli cellulari citoplasmatiche (e nucleari) composte da un nucleo di lipidi neutri (trigliceridi (TG) e esteri del colesterolo (CE)) racchiusa da un monostrato di fosfolipidi con proteine incorporate ^1. Tutti i tipi di cellule producono goccioline lipidiche, ma sono di dimensioni variabili, composizione lipidica, e la decorazione delle proteine. goccioline lipidiche svolgono diverse funzioni, tra cui quella di serbatoi di energia e precursori membrana o come depositi di proteine. Inoltre, attraverso l'assorbimento dei lipidi, proteggono le cellule da lipotossicità, lipidi rilascio come molecole di segnalazione, e sono coinvolti nella degradazione delle proteine e reticolo endoplasmatico (ER) di stress risposte ^2. Come tale, una serie di proteine ​​si legano a gocce lipidiche e governare la loro generazione, il degrado, il traffico, e l'interazione con altri organelli. Tra loro ci sono la famiglia perilipin di buona fede proteine leganti dei lipidi delle gocce (PLIN1-5)f "> 3.

Lipidi droplet biogenesi probabile inizia al ER, in cui gli enzimi ER residente catalizzano la sintesi dei lipidi neutri che si accumulano all'interno del doppio strato di membrana, formando una lente di lipidi neutri, un processo che è stato recentemente visualizzato bene in lievito ^4. Membrana piegatura e livelli elevati di acido e diacilglicerolo fosfatidici vengono quindi pensato di ottenere proteine coinvolte nella biosintesi dei fosfolipidi, come la sintesi simultanea di lipidi neutri core e fosfolipidi schermatura necessaria per la generazione dei lipidi droplet ^5. Gli enzimi che ospitano domini transmembrana che risiedono presso il pronto soccorso catalizzano questo processo. Espansione a grandi goccioline lipidiche richiede l'attività di una diversa classe di enzimi lipidi sintetizzare che ospitano un'elica anfipatica e possono quindi viaggiare dal ER goccioline lipidiche. La mobilitazione dei lipidi dal goccioline lipidiche avviene attraverso l'attivazione locale del triglicerideee diacilglicerolo lipasi lipasi adiposo trigliceridi (ATGL) e ormone-sensibile lipasi (HSL) oppure differenti vie autofagici, come macro e microlipophagy o autofagia ⁶ chaperone-mediata. Goccioline lipidiche interagiscono con altri organelli cellulari, come i mitocondri (per beta-ossidazione e sintesi dei lipidi) e ER (per la sintesi dei lipidi e proteina trafficking), ma anche con i lisosomi, endosomi, e vacuoli intracellulari indotte da batteri ^7. Infatti batteri, virus, parassiti e persino indirizzare goccioline lipidiche per la replica e persistenza, tra i quali HCV ^8.

L'infezione da HCV è una delle principali cause di morbilità correlata al fegato e la mortalità in tutto il mondo, che rappresentano circa 0,5 milioni di morti all'anno ^9. Il vero numero di infezioni da HCV è sconosciuta, ma recenti stime suggeriscono che 130 - 150 milioni di persone sono cronicamente infette. No vaccine esiste, ma i farmaci antivirali ad azione diretta recentemente approvate drammaticamente aumentare le risposte terapeutiche rispetto alla terapia standard a base di interferone. Tuttavia, a livello mondiale, il trattamento di pazienti sarà probabilmente limitato a causa degli elevatissimi costi delle nuove terapie. Circa la metà di tutti gli individui cronicamente infettati con HCV sviluppano la malattia del fegato grasso (steatosi), una condizione caratterizzata da un accumulo eccessivo di gocce lipidiche in epatociti. Curiosamente, gocce lipidiche sono emerse anche organelli cellulari come essenziali per la replicazione di HCV, putatively servire come siti di assemblaggio virale ^{10, 11.}

Nelle cellule con infezione da HCV, il nucleo proteina virale e NS5A localizzano di goccioline lipidiche in un processo che dipende biosintesi trigliceridi, come inibitori di diacilglicerolo aciltransferasi-1 (DGAT1) compromettere la tratta di goccioline lipidiche e produzione di particelle successiva HCV ¹² >, ^{13, 14, 15.} Inoltre, mutazioni nei lipidi domini goccioline di legame di entrambi core o NS5A sopprimono assemblaggio di HCV ^{16, 17.} Core e NS5A quindi assumere tutte le altre proteine virali, e anche complessi replicazione RNA virale, alle membrane strettamente associati lipidi goccioline ^16. È necessaria un'azione concertata di tutte le proteine virali per la produzione di successo infettiva progenie virale ^{10, 11.} Le proteine ​​strutturali sono parte dei virioni, e le proteine ​​non strutturali promuovono le interazioni proteina-proteina necessari per questo processo. Curiosamente, la bona fide lipidi droplet-binding protein PLIN3 / TIP47 è necessario sia per HCV RNA replicazione e il rilascio di virioni ^{18, 19} 20. Nonostante questi recenti progressi, i dettagli meccanicistici, in particolare di interazione virus-ospite durante le ultime fasi della replicazione di HCV, restano mal definita, e la funzione precisa delle gocce lipidiche è sconosciuta.

Qui, si descrive un metodo per isolare le goccioline lipidiche per la spettrometria di massa quantitativa delle proteine ​​associate. Usando questo metodo, abbiamo trovato profondi cambiamenti nel proteoma lipidi droplet durante l'infezione da HCV e identificato annessina A3 come proteina ospite che co-fraziona con goccioline lipidiche e richiesto per una efficiente HCV maturazione ^21.

1. Preparazione di supporti per isotopo stabile scrittura con amminoacidi in coltura cellulare (SILAC)

NOTA: Qui, la quantificazione Kit SILAC Protein - DMEM integrato con 50 mg di ¹³ C ₆ L-Arginina-HCl è stato utilizzato per l'etichettatura SILAC. Il dializzato siero di vitello fetale (FCS) è fornito con il kit di quantificazione SILAC proteine.

1. Rimuovere 50 ml da ciascuna bottiglia di terreno DMEM e aggiungere 50 ml di dializzato FCS.
2. Disciogliere 50 mg di ¹³ C ₆ L-lisina-2HCl e 50 mg di ¹³ C ₆ L-Arginina-HCl in 1 ml di terreno. Mescolare bene e aggiungere gli aminoacidi al mezzo DMEM + FCS.
3. Aggiungere 1x Pen / Strep e 1x sostituto L-glutammina. Sterile filtro medio usando un filtro da 0,45 um. Etichettare la bottiglia come mezzo SILAC "pesante".
4. Per preparare il mezzo "luce", ripetere i punti 1.1 - 1.3 Uso 50 mg di L-arginina-HCl e 50 mg di L-lisina-2HCl. Etichettare la bottiglia come ""Medio SILAC luce.

2. SILAC-etichettatura e Amino Acid incorporazione di controllo

1. Trypsinize cellule (1x Tripsina-EDTA) e Split 1 x 10 ⁵ cellule in Huh7.5 2 pozzetti di una piastra di coltura a 6 pozzetti contenente 2 ml di mezzo, un pozzetto con il mezzo "pesante" SILAC e uno con la "luce" media SILAC.
2. Coltura le cellule per almeno 6 passaggi (rapporto di divisione: 1: 6); dopo 6 passaggi, l'incorporazione degli amminoacidi "pesanti" dovrebbe essere superiore al 95%.
3. Harvest 1 x 10 ⁶ cellule del "pesante" - popolazione di cellule -labeled e "luce" per analizzare l'efficacia di incorporazione. Lavare le cellule in PBS 1x e agglomerare le cellule per centrifugazione per 5 min a 160 xg e 4 ° C.
4. Risospendere il pellet cellulare in 150 ml di MS-tampone (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, e 1 mM EDTA supplementato con 1x cocktail di inibitori delle proteasi) e incubare le cellule in ghiaccio per 30 min. Lyse la cells di sonicazione a 4 ° C.
   NOTA: Le seguenti sono le impostazioni utilizzate sonicazione qui: timer, tenere; controllo dell'uscita, 8; duty cycle, 80%; e 2 x 30 impulsi.
5. Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione per 10 min a 11.000 xg e 4 ° C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e determinare la concentrazione di proteina con un saggio proteico detersivo-compatibile.
6. Mescolare 75 ug di proteina con tampone campione 6x (375 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25,8% glicerolo, 123 mg / ml SDS, 600 ug / mL blu di bromofenolo e 60 microlitri / ml β-mercaptoetanolo), ebollizione a 95 ° C per 5 minuti, e separare le proteine ​​mediante SDS-PAGE in SDS tampone di corsa (3,02 g / base L Tris, 18,8 g / L di glicina, e 1 g / L SDS) a 180 V per circa 1 ora o secondo i produttori ' Istruzioni.
7. Trasferire il gel in colloidale soluzione colorante Coomassie. Asportare la stessa banda di proteina da ogni corsia. Digerire le proteine ​​con tripsina e analizzare l'efficacia di incorporazione da MS analysis, come descritto ^22.

3. Lipid Droplet Isolamento di cellule Huh7.5 SILAC marcato

1. Infettare una popolazione di cellule (cioè quelli etichettati con amminoacidi "leggere") con un virus reporter di HCV incubando con riserve di virus (ad esempio, Jc1 ^{NS5AB-mKO2-BSD,} MOI 1) per 4 ore a 37 ° C, come descritto ²¹ .
   NOTA: Jc1 ^{NS5AB-mKO2-BSD} è un virus HCV che porta una giornalista di fluorescenza (monomerico Kusabira Orange 2, mKO2) per monitorare i tassi di infezione seguita da una Blasticidin Resistance Gene (BSD) tra un sito di taglio duplicato NS5A-NS5B, descritto in precedenza ^{21, 23.} Lavora con HCV richiede BSL2 + (USA) o S3 ** (Germania) a livello di biosicurezza contenimento e pratiche. Invece di infezione da HCV, le cellule possono essere infettati da diversi agenti patogeni.
2. Espandere le cellule con infezione da HCV "luce" e non infetto & #34;. Cellule pesanti" Durante il passaggio in delle culture, fissare un'aliquota con 4% paraformaldeide (PFA) in PBS e determinare i tassi di infezione da HCV mediante citometria di flusso della proteina marcatore fluorescente (per esempio, mKO2), come descritto ^21; la i tassi di infezione dovrebbe essere superiore al 90% per i lipidi goccioline di isolamento. NOTA: Se si utilizza il Jc1 ^{NS5AB-mKO2-BSD} ceppo HCV, aggiungere 10 mg / ml blasticidin S al mezzo "leggero" per selezionare le cellule HCV-positivi.
3. 1 d prima dell'isolamento lipidi gocciolina, lavare le cellule con PBS, trypsinize, risospendere in "luce" e "pesante" medio, e contare le cellule utilizzando una camera di conteggio Neubauer. Seme 7 x 10 ⁶ cellule di ciascuna popolazione di 150 cm ² cella piatto di coltura. Preparare almeno 5 piatti per popolazione di cellule "luce" e "pesante". Coltivare le cellule in 30 ml di mezzo / piatto O / N.
4. Rimuovere il supporto e lavare le cellule in PBS 1x. Staccare le cellule a 1xPBS usando un raschietto cellulare.
5. Numero di entrambe le popolazioni cellulari usando una camera di Neubauer conteggio e piscina numero uguale di cellule in una provetta da centrifuga 50. Agglomerare le cellule per centrifugazione per 5 min a 160 xg e 4 ° C.
6. Rimuovere il PBS e risospendere il pellet di cellule in 1 ml di tampone saccarosio (0.25 M saccarosio, 1 mM EDTA, e 1 mM DTT, supplementato con cocktail di inibitori delle proteasi). Trasferire la sospensione cellulare ad un aderente Dounce omogeneizzatore e lisare le cellule con 200 corse su ghiaccio.
   NOTA: Confermare completa lisi cellulare utilizzando trypan colorazione blu.
7. Trasferire il lisato in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e centrifugare i nuclei e detriti cellulari per 10 min a 1000 xg e 4 ° C.
8. Dopo centrifugazione, memorizzare un'aliquota di 25 microlitri della frazione post-nucleare (PNS) a -20 ° C come controllo di input.
9. Posizionare il resto della frazione PNS sul fondo della provetta da centrifuga (11 x 60 mm) e sovrapporre con tampone di lavaggio gocciolina lipidica (~ 3 mL; 4 mL total) (50 mM tampone fosfato di potassio pH 7,4, 100 mM di cloruro di potassio, 1 mM EDTA, e 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoruro).
10. Centrifuga per 2 ore a 100.000 xg e 4 ° C. Raccogliere la frazione lipidica gocciolina mobile usando un piegato cannula smussata dalla parte superiore del tubo (circa 250 - 500 microlitri, a seconda della quantità di goccioline lipidiche). Posizionare la frazione lipidica gocciolina in un tubo da centrifuga (11 x 60 mm), ricoprire con tampone di lavaggio gocciolina lipidica (~ 3,5 ml; 4 mL totale), e ripetere la fase di centrifugazione.
11. Raccogliere la frazione lipidica gocciolina mobile usando un piegato cannula smussata dalla parte superiore del tubo e trasferire le goccioline lipidiche in un 1,5 mL provetta da microcentrifuga. Aggiungere 500 ml di tampone di lavaggio lipidi droplet e centrifugare per 20 min a 21.000 xg e 4 ° C.
    NOTA: goccioline lipidiche appaiono come una banda bianca galleggia sulla parte superiore del tampone.
12. Rimuovere il tampone di lavaggio soggiacente utilizzando un puntale gel loading e ripetere questa fase di lavaggio tre volte.
13. Dopo la rimozione finale del tampone di lavaggio utilizzando una punta di pipetta caricamento del gel, mescolare 5 ml di frazioni goccioline lipidiche con 10 ml di NP-40 tampone di lisi (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, e 1% NP-40 , integrato con cocktail di inibitori della proteasi). Incubare il campione in ghiaccio per 1 h per inattivare il virus se si lavora con materiale infetto. Determinare il livello di proteina con un saggio proteico detergenti-compatibili; almeno 35 ug di proteine ​​è necessario per MS-analisi.
14. Conservare le frazioni lipidi droplet a -20 ° C.
15. Mescolare il corrispondente volume della frazione lipidica gocciolina con colorante di caricamento 4x. Incubare in ghiaccio per 1 ora per inattivare il virus se si lavora con materiale infetto. Far bollire a 95 ° C per 5 minuti.
16. Separare le proteine ​​usando SDS-PAGE secondo il protocollo dei costruttori. Trasferire il gel in colloidale soluzione colorante Coomassie. Asportare tutte le bande di proteine ​​dal gel. Dopo triptica in gel digestione ^{24 <}/ Sup>, evaporare i campioni e dissolvono in acido formico 0,1%. Analizzare mediante LC-MS / MS.
    NOTA: Qui, LC-MS / MS analisi sono state effettuate su un quadrupolo-Time-of-Flight spettrometro di massa (Q-TOF) o su una trappola lineare Quadrupole (LTQ) Orbitrap spettrometro di massa. Entrambi gli strumenti sono stati accoppiati con un ESI-source di un sistema di nano-UPLC. Analizza i dati e LC-MS / MS analisi sulla Q-TOF e sullo spettrometro di massa Orbitrap sono stati eseguiti come descritto ^{21, 22.} Fare molta attenzione a non contaminare il campione con la cheratina umana. Usare sempre suggerimenti e pipetta senza cheratina. Preparare buffer sotto cappa a flusso laminare con prodotti chimici privo di cheratina. Prima dell'uso, pulire tutte le superfici e dispositivi con acqua distillata ed etanolo. Indossare sempre guanti e un camice da laboratorio.

4. Analisi dei lipidi Droplet Purezza

1. Diluire aliquote di lipidi goccioline frazioni 1: 2 e frazioni di ingresso (vedi passo 3.9) 1:10 con NP-40 lysè buffer. Incubare i campioni in ghiaccio per 1 ora per inattivare il virus se si lavora con materiale infetto. Determinare il livello di proteina con un saggio proteico detergente-compatibili.
2. Mescolare quantità uguali di proteina con tampone campione 6x e incubare i campioni in ghiaccio per 1 h per inattivare il virus se si lavora con materiale infetto. Procedere con SDS-PAGE e trasferire le proteine ​​su una membrana di nitrocellulosa da blotting a 80 V per 90 minuti.
   NOTA: Dopo aver bloccato la membrana in tampone bloccante (5% nonfat latte in polvere in TBS-T (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, e 0,05% Tween 20)), incubare con anticorpi diretti contro marcatori goccioline lipidiche (es , PLIN1, PLIN2 o PLIN3) e marcatori di altri compartimenti subcellulari (ad esempio, CALR, MnSOD o tubulina), seguito da anticorpi HRP-accoppiato secondarie. Utilizzare chemiluminescenza per la rilevazione delle proteine.

gocce lipidiche sono vitali per infezione da HCV come i siti putativi di assemblaggio del virione, ma i meccanismi molecolari della morfogenesi e di uscita di virioni sono in gran parte sconosciuti. Per identificare nuovi fattori di dipendenza ospitante coinvolti in questo processo, abbiamo effettuato lipidi droplet analisi quantitativa proteoma di cellule con infezione da HCV 21 (Figura 1A). Abbiamo stabilito un protocollo per purificare goccioline lipidiche e regolarmente rilevato un forte arricchimento del lipide droplet-binding proteins PLIN2 / ADRP e PLIN3 / TIP47 e un impoverimento di marcatori di altri compartimenti cellulari, come β-tubulina per microtubuli, MnSOD per mitocondri, o calreticulin / calnexin per ER (Figura 1B, C). Abbiamo compilato una lista di proteine che cofractionate affidabile con goccioline lipidiche nelle cellule Huh7.5 (Figura 1D) e, utilizzando marcatura isotopica, proteine identificate che sono specificamente assuntio spostato dalla goccioline lipidiche nelle cellule con infezione da HCV (Figura 1E). I nostri risultati indicano che l'HCV disconnette gocce lipidiche dalla loro normale funzione e / o regolazione metabolica e identificano alcuni fattori di dipendenza host e di restrizione putativi.

Figura 1: (A) Schema dell'esperimento. cellule Huh7.5 naive sono stati etichettati con acidi "pesante" amminoacidi o amminoacidi "leggeri". Le cellule che trasportano gli aminoacidi "leggeri" sono stati infettati con un virus HCV giornalista (Jc1 NS5AB-mKO2-BSD). popolazioni acido ammino-marcato "leggeri" e "pesanti" sono stati mescolati, e goccioline lipidiche sono stati isolati da due successive ultracentrifugazione e tre fasi di lavaggio, separate mediante SDS-PAGE, e analizzati mediante LC-ESI-MS / MS. Si noti la frazione lipidica galleggiante bianco gocciolina (freccia rossa) dopo ultracentrifugati su e lavaggio in provette per microcentrifuga. (B) Analisi Western blot di frazioni gocciolina post-nucleari e lipidi mostra un arricchimento di lipidi proteine marker gocciolina in lipidi frazioni gocciolina e un impoverimento di marcatori di altri compartimenti cellulari. (C) Coomassie blue e argento colorazione del surnatante post-nucleare (PNS) e frazioni goccioline lipidiche separate mediante SDS-PAGE. colorazione argento è presentato solo per la visualizzazione. (D) Heatmap del numero di peptidi e proteine percentuale di copertura delle proteine identificate in frazioni lipidi goccioline di cellule Huh7.5 (cutoff: ≥5 peptidi e copertura ≥20%). (E) Heatmap raffigurante arricchito o impoverito lipidi proteine gocciolina associate dopo l'infezione da HCV (normalizzato alla mediana, cutoff di 1,5 volte, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001). Modificato da 21.et = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.