Articolo metodologico

Isolamento Droplet per l'analisi quantitativa dei lipidi Spettrometria di Massa

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DOI:

10.3791/55585

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17 aprile 2017

 ,  ,  , 
1Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology, 2Core Facility Mass Spectrometric Proteomics, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

In questo articolo

Sommario

gocce lipidiche sono organelli importanti per la replicazione di diversi agenti patogeni, tra cui il virus dell'epatite C (HCV). Si descrive un metodo per isolare le goccioline lipidiche per la spettrometria di massa quantitativa delle proteine ​​associate; può essere utilizzato in una varietà di condizioni, come l'infezione da virus, stress ambientale, o di trattamento farmacologico.

Abstract

gocce lipidiche sono vitali per la replica di una varietà di diversi agenti patogeni, il più prominente il virus dell'epatite C (HCV), come il sito putativo di virione morfogenesi. Quantitativa analisi proteomica lipidico gocciolina può essere utilizzato per identificare proteine ​​che localizzano o sono spostati da goccioline lipidiche in condizioni come le infezioni virali. Qui, descriviamo un protocollo che è stato usato con successo per caratterizzare i cambiamenti nel proteoma lipidi goccioline dopo l'infezione da HCV. Usiamo isotopo stabile scrittura con amminoacidi in coltura cellulare (SILAC) e quindi identificarla proteoma completo di una popolazione di cellule con acidi "pesanti" amminoacidi per quantificare le proteine ​​mediante spettrometria di massa. Per l'isolamento di lipidi gocciolina, le due popolazioni cellulari (cioè / amminoacidi "leggeri" infezione da HCV e / amminoacidi "pesanti" non infetti controllo) vengono mescolati 1: 1 e lisate in tampone ipotonico meccanicamente. Dopo aver rimosso i nuclei e cellule debris mediante centrifugazione a bassa velocità, lipidi proteine ​​gocciolina-associata si arricchiscono di due fasi successive ultracentrifugazione seguiti da tre fasi di lavaggio in tampone isotonico. La purezza delle frazioni goccioline lipidiche viene analizzato mediante western blotting con anticorpi che riconoscono differenti compartimenti subcellulari. Lipidi proteine ​​gocciolina associate sono quindi separati mediante elettroforesi su gel di SDS-poliacrilammide (SDS-PAGE), seguita da colorazione con Coomassie. Dopo triptica digest, i peptidi vengono quantificati mediante cromatografia spettrometria di massa elettrospray-ionizzazione-tandem liquida (LC-ESI-MS / MS). Usando questo metodo, abbiamo identificato proteine ​​reclutati goccioline lipidiche upon HCV che potrebbero rappresentare fattori dell'ospite pro o antivirali. Il nostro metodo può essere applicato a una varietà di diverse cellule e condizioni di coltura, come l'infezione da agenti patogeni, stress ambientale, o di trattamento farmacologico.

Introduzione

Goccioline lipidiche sono altamente dinamici organelli cellulari citoplasmatiche (e nucleari) composte da un nucleo di lipidi neutri (trigliceridi (TG) e esteri del colesterolo (CE)) racchiusa da un monostrato di fosfolipidi con proteine incorporate 1. Tutti i tipi di cellule producono goccioline lipidiche, ma sono di dimensioni variabili, composizione lipidica, e la decorazione delle proteine. goccioline lipidiche svolgono diverse funzioni, tra cui quella di serbatoi di energia e precursori membrana o come depositi di proteine. Inoltre, attraverso l'assorbimento dei lipidi, proteggono le cellule da lipotossicità, lipidi rilascio come molecole di segnalazione, e sono coinvolti nella degradazione delle proteine e reticolo endoplasmatico (ER) di stress risposte 2. Come tale, una serie di proteine ​​si legano a gocce lipidiche e governare la loro generazione, il degrado, il traffico, e l'interazione con altri organelli. Tra loro ci sono la famiglia perilipin di buona fede proteine leganti dei lipidi delle gocce (PLIN1-5)f "> 3.

Lipidi droplet biogenesi probabile inizia al ER, in cui gli enzimi ER residente catalizzano la sintesi dei lipidi neutri che si accumulano all'interno del doppio strato di membrana, formando una lente di lipidi neutri, un processo che è stato recentemente visualizzato bene in lievito 4. Membrana piegatura e livelli elevati di acido e diacilglicerolo fosfatidici vengono quindi pensato di ottenere proteine coinvolte nella biosintesi dei fosfolipidi, come la sintesi simultanea di lipidi neutri core e fosfolipidi schermatura necessaria per la generazione dei lipidi droplet 5. Gli enzimi che ospitano domini transmembrana che risiedono presso il pronto soccorso catalizzano questo processo. Espansione a grandi goccioline lipidiche richiede l'attività di una diversa classe di enzimi lipidi sintetizzare che ospitano un'elica anfipatica e possono quindi viaggiare dal ER goccioline lipidiche. La mobilitazione dei lipidi dal goccioline lipidiche avviene attraverso l'attivazione locale del triglicerideee diacilglicerolo lipasi lipasi adiposo trigliceridi (ATGL) e ormone-sensibile lipasi (HSL) oppure differenti vie autofagici, come macro e microlipophagy o autofagia 6 chaperone-mediata. Goccioline lipidiche interagiscono con altri organelli cellulari, come i mitocondri (per beta-ossidazione e sintesi dei lipidi) e ER (per la sintesi dei lipidi e proteina trafficking), ma anche con i lisosomi, endosomi, e vacuoli intracellulari indotte da batteri 7. Infatti batteri, virus, parassiti e persino indirizzare goccioline lipidiche per la replica e persistenza, tra i quali HCV 8.

L'infezione da HCV è una delle principali cause di morbilità correlata al fegato e la mortalità in tutto il mondo, che rappresentano circa 0,5 milioni di morti all'anno 9. Il vero numero di infezioni da HCV è sconosciuta, ma recenti stime suggeriscono che 130 - 150 milioni di persone sono cronicamente infette. No vaccine esiste, ma i farmaci antivirali ad azione diretta recentemente approvate drammaticamente aumentare le risposte terapeutiche rispetto alla terapia standard a base di interferone. Tuttavia, a livello mondiale, il trattamento di pazienti sarà probabilmente limitato a causa degli elevatissimi costi delle nuove terapie. Circa la metà di tutti gli individui cronicamente infettati con HCV sviluppano la malattia del fegato grasso (steatosi), una condizione caratterizzata da un accumulo eccessivo di gocce lipidiche in epatociti. Curiosamente, gocce lipidiche sono emerse anche organelli cellulari come essenziali per la replicazione di HCV, putatively servire come siti di assemblaggio virale 10, 11.

Nelle cellule con infezione da HCV, il nucleo proteina virale e NS5A localizzano di goccioline lipidiche in un processo che dipende biosintesi trigliceridi, come inibitori di diacilglicerolo aciltransferasi-1 (DGAT1) compromettere la tratta di goccioline lipidiche e produzione di particelle successiva HCV 12 >, 13, 14, 15. Inoltre, mutazioni nei lipidi domini goccioline di legame di entrambi core o NS5A sopprimono assemblaggio di HCV 16, 17. Core e NS5A quindi assumere tutte le altre proteine virali, e anche complessi replicazione RNA virale, alle membrane strettamente associati lipidi goccioline 16. È necessaria un'azione concertata di tutte le proteine virali per la produzione di successo infettiva progenie virale 10, 11. Le proteine ​​strutturali sono parte dei virioni, e le proteine ​​non strutturali promuovono le interazioni proteina-proteina necessari per questo processo. Curiosamente, la bona fide lipidi droplet-binding protein PLIN3 / TIP47 è necessario sia per HCV RNA replicazione e il rilascio di virioni 18, 19 , 20. Nonostante questi recenti progressi, i dettagli meccanicistici, in particolare di interazione virus-ospite durante le ultime fasi della replicazione di HCV, restano mal definita, e la funzione precisa delle gocce lipidiche è sconosciuta.

Qui, si descrive un metodo per isolare le goccioline lipidiche per la spettrometria di massa quantitativa delle proteine ​​associate. Usando questo metodo, abbiamo trovato profondi cambiamenti nel proteoma lipidi droplet durante l'infezione da HCV e identificato annessina A3 come proteina ospite che co-fraziona con goccioline lipidiche e richiesto per una efficiente HCV maturazione 21.

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Protocollo

1. Preparazione di supporti per isotopo stabile scrittura con amminoacidi in coltura cellulare (SILAC)

NOTA: Qui, la quantificazione Kit SILAC Protein - DMEM integrato con 50 mg di 13 C 6 L-Arginina-HCl è stato utilizzato per l'etichettatura SILAC. Il dializzato siero di vitello fetale (FCS) è fornito con il kit di quantificazione SILAC proteine.

  1. Rimuovere 50 ml da ciascuna bottiglia di terreno DMEM e aggiungere 50 ml di dializzato FCS.
  2. Disciogliere 50 mg di 13 C 6 L-lisina-2HCl e 50 mg di 13 C 6 L-Arginina-HCl in 1 ml di terreno. Mescolare bene e aggiungere gli aminoacidi al mezzo DMEM + FCS.
  3. Aggiungere 1x Pen / Strep e 1x sostituto L-glutammina. Sterile filtro medio usando un filtro da 0,45 um. Etichettare la bottiglia come mezzo SILAC "pesante".
  4. Per preparare il mezzo "luce", ripetere i punti 1.1 - 1.3 Uso 50 mg di L-arginina-HCl e 50 mg di L-lisina-2HCl. Etichettare la bottiglia come ""Medio SILAC luce.

2. SILAC-etichettatura e Amino Acid incorporazione di controllo

  1. Trypsinize cellule (1x Tripsina-EDTA) e Split 1 x 10 5 cellule in Huh7.5 2 pozzetti di una piastra di coltura a 6 pozzetti contenente 2 ml di mezzo, un pozzetto con il mezzo "pesante" SILAC e uno con la "luce" media SILAC.
  2. Coltura le cellule per almeno 6 passaggi (rapporto di divisione: 1: 6); dopo 6 passaggi, l'incorporazione degli amminoacidi "pesanti" dovrebbe essere superiore al 95%.
  3. Harvest 1 x 10 6 cellule del "pesante" - popolazione di cellule -labeled e "luce" per analizzare l'efficacia di incorporazione. Lavare le cellule in PBS 1x e agglomerare le cellule per centrifugazione per 5 min a 160 xg e 4 ° C.
  4. Risospendere il pellet cellulare in 150 ml di MS-tampone (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, e 1 mM EDTA supplementato con 1x cocktail di inibitori delle proteasi) e incubare le cellule in ghiaccio per 30 min. Lyse la cells di sonicazione a 4 ° C.
    NOTA: Le seguenti sono le impostazioni utilizzate sonicazione qui: timer, tenere; controllo dell'uscita, 8; duty cycle, 80%; e 2 x 30 impulsi.
  5. Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione per 10 min a 11.000 xg e 4 ° C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e determinare la concentrazione di proteina con un saggio proteico detersivo-compatibile.
  6. Mescolare 75 ug di proteina con tampone campione 6x (375 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25,8% glicerolo, 123 mg / ml SDS, 600 ug / mL blu di bromofenolo e 60 microlitri / ml β-mercaptoetanolo), ebollizione a 95 ° C per 5 minuti, e separare le proteine ​​mediante SDS-PAGE in SDS tampone di corsa (3,02 g / base L Tris, 18,8 g / L di glicina, e 1 g / L SDS) a 180 V per circa 1 ora o secondo i produttori ' Istruzioni.
  7. Trasferire il gel in colloidale soluzione colorante Coomassie. Asportare la stessa banda di proteina da ogni corsia. Digerire le proteine ​​con tripsina e analizzare l'efficacia di incorporazione da MS analysis, come descritto 22.

3. Lipid Droplet Isolamento di cellule Huh7.5 SILAC marcato

  1. Infettare una popolazione di cellule (cioè quelli etichettati con amminoacidi "leggere") con un virus reporter di HCV incubando con riserve di virus (ad esempio, Jc1 NS5AB-mKO2-BSD, MOI 1) per 4 ore a 37 ° C, come descritto 21 .
    NOTA: Jc1 NS5AB-mKO2-BSD è un virus HCV che porta una giornalista di fluorescenza (monomerico Kusabira Orange 2, mKO2) per monitorare i tassi di infezione seguita da una Blasticidin Resistance Gene (BSD) tra un sito di taglio duplicato NS5A-NS5B, descritto in precedenza 21, 23. Lavora con HCV richiede BSL2 + (USA) o S3 ** (Germania) a livello di biosicurezza contenimento e pratiche. Invece di infezione da HCV, le cellule possono essere infettati da diversi agenti patogeni.
  2. Espandere le cellule con infezione da HCV "luce" e non infetto & #34;. Cellule pesanti" Durante il passaggio in delle culture, fissare un'aliquota con 4% paraformaldeide (PFA) in PBS e determinare i tassi di infezione da HCV mediante citometria di flusso della proteina marcatore fluorescente (per esempio, mKO2), come descritto 21; la i tassi di infezione dovrebbe essere superiore al 90% per i lipidi goccioline di isolamento. NOTA: Se si utilizza il Jc1 NS5AB-mKO2-BSD ceppo HCV, aggiungere 10 mg / ml blasticidin S al mezzo "leggero" per selezionare le cellule HCV-positivi.
  3. 1 d prima dell'isolamento lipidi gocciolina, lavare le cellule con PBS, trypsinize, risospendere in "luce" e "pesante" medio, e contare le cellule utilizzando una camera di conteggio Neubauer. Seme 7 x 10 6 cellule di ciascuna popolazione di 150 cm 2 cella piatto di coltura. Preparare almeno 5 piatti per popolazione di cellule "luce" e "pesante". Coltivare le cellule in 30 ml di mezzo / piatto O / N.
  4. Rimuovere il supporto e lavare le cellule in PBS 1x. Staccare le cellule a 1xPBS usando un raschietto cellulare.
  5. Numero di entrambe le popolazioni cellulari usando una camera di Neubauer conteggio e piscina numero uguale di cellule in una provetta da centrifuga 50. Agglomerare le cellule per centrifugazione per 5 min a 160 xg e 4 ° C.
  6. Rimuovere il PBS e risospendere il pellet di cellule in 1 ml di tampone saccarosio (0.25 M saccarosio, 1 mM EDTA, e 1 mM DTT, supplementato con cocktail di inibitori delle proteasi). Trasferire la sospensione cellulare ad un aderente Dounce omogeneizzatore e lisare le cellule con 200 corse su ghiaccio.
    NOTA: Confermare completa lisi cellulare utilizzando trypan colorazione blu.
  7. Trasferire il lisato in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e centrifugare i nuclei e detriti cellulari per 10 min a 1000 xg e 4 ° C.
  8. Dopo centrifugazione, memorizzare un'aliquota di 25 microlitri della frazione post-nucleare (PNS) a -20 ° C come controllo di input.
  9. Posizionare il resto della frazione PNS sul fondo della provetta da centrifuga (11 x 60 mm) e sovrapporre con tampone di lavaggio gocciolina lipidica (~ 3 mL; 4 mL total) (50 mM tampone fosfato di potassio pH 7,4, 100 mM di cloruro di potassio, 1 mM EDTA, e 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoruro).
  10. Centrifuga per 2 ore a 100.000 xg e 4 ° C. Raccogliere la frazione lipidica gocciolina mobile usando un piegato cannula smussata dalla parte superiore del tubo (circa 250 - 500 microlitri, a seconda della quantità di goccioline lipidiche). Posizionare la frazione lipidica gocciolina in un tubo da centrifuga (11 x 60 mm), ricoprire con tampone di lavaggio gocciolina lipidica (~ 3,5 ml; 4 mL totale), e ripetere la fase di centrifugazione.
  11. Raccogliere la frazione lipidica gocciolina mobile usando un piegato cannula smussata dalla parte superiore del tubo e trasferire le goccioline lipidiche in un 1,5 mL provetta da microcentrifuga. Aggiungere 500 ml di tampone di lavaggio lipidi droplet e centrifugare per 20 min a 21.000 xg e 4 ° C.
    NOTA: goccioline lipidiche appaiono come una banda bianca galleggia sulla parte superiore del tampone.
  12. Rimuovere il tampone di lavaggio soggiacente utilizzando un puntale gel loading e ripetere questa fase di lavaggio tre volte.
  13. Dopo la rimozione finale del tampone di lavaggio utilizzando una punta di pipetta caricamento del gel, mescolare 5 ml di frazioni goccioline lipidiche con 10 ml di NP-40 tampone di lisi (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, e 1% NP-40 , integrato con cocktail di inibitori della proteasi). Incubare il campione in ghiaccio per 1 h per inattivare il virus se si lavora con materiale infetto. Determinare il livello di proteina con un saggio proteico detergenti-compatibili; almeno 35 ug di proteine ​​è necessario per MS-analisi.
  14. Conservare le frazioni lipidi droplet a -20 ° C.
  15. Mescolare il corrispondente volume della frazione lipidica gocciolina con colorante di caricamento 4x. Incubare in ghiaccio per 1 ora per inattivare il virus se si lavora con materiale infetto. Far bollire a 95 ° C per 5 minuti.
  16. Separare le proteine ​​usando SDS-PAGE secondo il protocollo dei costruttori. Trasferire il gel in colloidale soluzione colorante Coomassie. Asportare tutte le bande di proteine ​​dal gel. Dopo triptica in gel digestione 24 </ Sup>, evaporare i campioni e dissolvono in acido formico 0,1%. Analizzare mediante LC-MS / MS.
    NOTA: Qui, LC-MS / MS analisi sono state effettuate su un quadrupolo-Time-of-Flight spettrometro di massa (Q-TOF) o su una trappola lineare Quadrupole (LTQ) Orbitrap spettrometro di massa. Entrambi gli strumenti sono stati accoppiati con un ESI-source di un sistema di nano-UPLC. Analizza i dati e LC-MS / MS analisi sulla Q-TOF e sullo spettrometro di massa Orbitrap sono stati eseguiti come descritto 21, 22. Fare molta attenzione a non contaminare il campione con la cheratina umana. Usare sempre suggerimenti e pipetta senza cheratina. Preparare buffer sotto cappa a flusso laminare con prodotti chimici privo di cheratina. Prima dell'uso, pulire tutte le superfici e dispositivi con acqua distillata ed etanolo. Indossare sempre guanti e un camice da laboratorio.

4. Analisi dei lipidi Droplet Purezza

  1. Diluire aliquote di lipidi goccioline frazioni 1: 2 e frazioni di ingresso (vedi passo 3.9) 1:10 con NP-40 lysè buffer. Incubare i campioni in ghiaccio per 1 ora per inattivare il virus se si lavora con materiale infetto. Determinare il livello di proteina con un saggio proteico detergente-compatibili.
  2. Mescolare quantità uguali di proteina con tampone campione 6x e incubare i campioni in ghiaccio per 1 h per inattivare il virus se si lavora con materiale infetto. Procedere con SDS-PAGE e trasferire le proteine ​​su una membrana di nitrocellulosa da blotting a 80 V per 90 minuti.
    NOTA: Dopo aver bloccato la membrana in tampone bloccante (5% nonfat latte in polvere in TBS-T (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, e 0,05% Tween 20)), incubare con anticorpi diretti contro marcatori goccioline lipidiche (es , PLIN1, PLIN2 o PLIN3) e marcatori di altri compartimenti subcellulari (ad esempio, CALR, MnSOD o tubulina), seguito da anticorpi HRP-accoppiato secondarie. Utilizzare chemiluminescenza per la rilevazione delle proteine.

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Risultati

gocce lipidiche sono vitali per infezione da HCV come i siti putativi di assemblaggio del virione, ma i meccanismi molecolari della morfogenesi e di uscita di virioni sono in gran parte sconosciuti. Per identificare nuovi fattori di dipendenza ospitante coinvolti in questo processo, abbiamo effettuato lipidi droplet analisi quantitativa proteoma di cellule con infezione da HCV 21 (Figura 1A). Abbiamo stabilito un protocollo per purificare goccioli...

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Discussione

Qui, descriviamo un protocollo per isolare goccioline lipidiche per l'analisi quantitativa dei lipidi droplet proteoma per confrontare l'arricchimento e l'esaurimento di proteine ​​associate con goccioline lipidiche in condizioni di coltura diversi, come le infezioni virali. Come metodo alternativo, l'analisi proteomica può essere eseguita con quantificazioni label-free basati sul totale intensità di picco. Questo metodo non ha limitazioni gamma dinamica ed evita problemi metabolici. Il vantaggio dell...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo R. Bartenschlager (Università di Heidelberg) per i costrutti Jc1, CM Rice (Rockefeller University) per le cellule Huh7.5, J. McLauchlan (Virologia Unità di Medical Research Council) per la costruzione, T. Wakita (Istituto Nazionale di JFH1 Malattie infettive, Giappone) per il JFH1, e B. Webster e WC Greene (Gladstone Istituto di Virologia e Immunologia) per i costrutti reporter HCVcc. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi della DFG (HE 6889 / 2-1 (EH), INST 337 / 15-1 2013 e INST 337 / 16-1 il 2013 (HS)). Il Heinrich Pette Institute, Istituto Leibniz per Sperimentale Virologia è sostenuto dalla Città Libera e Anseatica di Amburgo e il Ministero federale della sanità. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Kit di quantificazione delle proteine SILAC - DMEMThermo Fisher89983 
13C6 L-Arginina-HCl 50  mgThermo Fisher88210
Roti-Load 1Roth GmbHK929.1
Roti-Blue 5x ConcentratoRoth GmbHA152.2 
10x SDS-Tris-Glicina - TamponeGeyer Th. GmbH & Co.KG A1415,0250 
GlutaMAX (100x)Life Technologies GmbH 350500038 
Soluzione di penicillina/streptomicina per colture cellulariSigma-Aldrich Chemie GmbHP4333-100ml 
DPBS 1x Soluzione salina tamponata con fosfato di DulbeccoSigma-Aldrich Chemie GmbHD8537 
Tripsina-EDTASigma-Aldrich Chemie GmbHT3924-100ML 
Cloruro di sodio BioChemicaAppliChem GmbHA1149,1000
Tris Ultrapure   AppliChem GmbHA1086,5000A 
EDTA BioChemicaAppliChem GmbHA1103,0250
Cocktail di inibitori della proteasi 5 mLSigma-Aldrich Chemie GmbH P8340-5ML 
D(+)-Saccarosio BioChemicaAppliChem GmbHA3935,1000
Acido cloridrico (HCl) puro al 37% Ph. Eur., NFAppliChem GmbHA0625
DC Protein Assay Bio-Rad Laboratoris GmbH500-0116 
GlycerolAppliChem GmbH151339
SDS UltrapureAppliChem GmbHA1112
Blu di bromofenoloAppliChem GmbHA2331
β-MercaptoetanoloAppliChem GmbHA4338
BlasticidinaInvivogenant-bl-1 
Cloruro di potassio AppliChem GmbHA1039
FenilmetanosulfonilfluoruroAppliChem GmbHA0999
Fosfato di potassio monobasicoSigma-Aldrich Chemie GmbH 
Idrogenofosfato dipotassicoSigma-Aldrich Chemie GmbHP3786 
DTT AppliChem GmbHA2948
NP-40AppliChemA1694
TWEEN 20AppliChemA4974
Latte in polvere in polvere scrematoAppliChemA0830
Anti-ADFP/ ADRP abcamab52355
M6PRB1/TIP47 100 µ gabcamab47639
Calreticulina, pAb 200 µ gEnzo Life Science GmbHADI-SPA-600-F 
Anti-β-Tubulina Sigma-Aldrich Chemie GmbHT6074 200µ l  
Etanolo assoluto (EtOH)Geyer Th. GmbH & Co.KG A3678,0250
Anti-MnSODEnzo Life Science GmbHADI-SOD-110-F
Anti-topo HRPThermo Fisher Pierce32430
Anti-coniglio HRPThermo Fisher  Pierce32460
Amersham Hyperfilm ECLGE Healthcare28906836
Substrato di Western Blotting Lumi-LightSigma-Aldrich Chemie GmbH 
piastra per colture cellulari a 96 pozzettiGreiner Bio-One GmbH655 180 
Terumo Siringa 1 mLTerumoSS-01T
Filtropur BT 50, 500 mL, 0,45 & micro; m SARSTEDT 83.1823.100 
Gel prefabbricati Mini-PROTEAN TGX, qualsiasi gel risolutivo kDBio-Rad Laboratoris GmbH 456-9034 
piastra per coltura cellulare a 6 pozzettiGreiner Bio-One GmbHCodice 657160 
Piatti Nunclon 150/20 Fisher Scientific GmbH10098720 - 168381 
Raschietto cellulareneoLab Migge GmbHC-8120 
Provetta, 50 mLGreiner Bio-One GmbH227261 
Provetta SafeSeal senza RNasi SARSTEDT 72.706.400 
Provette da centrifuga ultra trasparenti 11 x 60 mmBeckman Coulter GmbH 344062 
Aghi di aspirazioneTranscodent6482
Biosphere Fil. Suggerimento 1000 SARSTEDT 70.762.211 
Biosfera Fil. Suggerimento 200SARSTEDT 70.760.211 
Biosfera Fil. Suggerimento 10SARSTEDT 70.1130.210 
Grinder per tessuti DounceFisher Scientific GmbH
Pestelli Per Dounce Smerigliatrici di Tessuti interamente in vetroFisher Scientific GmbH 
Orbitrap Fusion
Branson Sonifier 450
Thermomixer comfort, con Thermoblock 1,5 mLEppendorf5355  000.127
Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module e alimentatore di base PowerPac, BioRad165-8033
Mini-PROTEAN 3 Camera di colata multiplaBioRad165-4110
PowerPac HC AlimentatoreBiorad164-5052
Centrifuga Eppendorf5424R
Centrifuga Eppendorf5424
Optima L-90KBeckman Coulter GmbH365670
SW 60 Ti RotoreBeckman Coulter GmbH
Infinite M1000 PROTecan
221309120151960011188372210389444335649

Riferimenti

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