Articolo metodologico

Utilizzando la trasmissione ottica straordinaria per quantificare i biomarcatori cardiaci nel siero umano

DOI:

10.3791/55597

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13 dicembre 2017

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1NUS Nanoscience and Nanotechnology Initiative, National University of Singapore, 2Cardiovascular Research Institute, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 3Department of Electrical and Computer Engineering, National University of Singapore, 4Institute of Materials Research Engineering, A*STAR (Agency for Science, Technology and Research)

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro descrive un metodo di Litografia nanoimprinting per fabbricare matrici di sensori di alta qualità che funzionano sul principio della trasmissione ottica straordinaria. Il biosensore è basso costo, robusto, facile da usare e in grado di rilevare la troponina cardiaca I nel siero a concentrazioni clinicamente rilevanti (99th percentile taglio ∼10-400 pg/mL, a seconda del dosaggio).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per una piattaforma di biosensori avere rilevanza clinica nelle impostazioni di point-of-care (POC), sensibilità, riproducibilità e capacità di monitorare in modo affidabile analiti contro lo sfondo di siero umano sono cruciali.

Nanoimprinting Litografia (NIL) è stato usato per fabbricare, a basso costo, rilevamento aree grandi come 1,5 x 1,5 mm. La superficie di rilevamento è stata effettuata di matrici ad alta fedeltà di nanoholes, ciascuno con una superficie di circa 140 nm2. La grande riproducibilità di NIL ha permesso di impiegare una strategia one-chip, misura di uno su 12 superfici fabbricate singolarmente, con minime variazioni di truciolo-truciolo. Questi chip di (LSPR) risonanza plasmonica di superficie nanoimprinted localizzato sono stati ampiamente testati sulla loro capacità di misurare in modo affidabile un bioanalyte alle concentrazioni che variano da 2,5 a 75 ng/mL in mezzo sullo sfondo di un complesso biofluid-in questo caso siero umano. L'alta fedeltà del NIL consente la generazione di grandi aree di rilevamento, che a sua volta elimina la necessità di un microscopio, come questo biosensore è facilmente interfacciabile con una sorgente di luce di laboratorio comunemente disponibili. Questi biosensori in grado di rilevare troponina cardiaca nel siero con un'alta sensibilità, a un limite di rilevabilità (LOD) di 0,55 ng/mL, che è clinicamente rilevante. Essi mostrano anche bassa varianza di truciolo-truciolo (grazie all'alta qualità del processo di fabbricazione). I risultati sono commensurabili con ampiamente usato enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA)-base di saggi, ma la tecnica mantiene i vantaggi di una piattaforma di rilevamento basata su LSPR (cioè, disponibilità alla miniaturizzazione e multiplexing, che lo rende più fattibile per le applicazioni POC).

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sensori chimici basati su matrici ordinata sono stati oggetto di numerose indagini dato che la prima relazione sulla trasmissione ottica straordinaria (EOT) è stata pubblicata da Ebbesen et nel 19981. Quando la luce incide sulle matrici periodiche di ordinata strutture di dimensioni sub-lunghezza d'onda, la trasmissione avanzata avviene alle lunghezze d'onda specifiche. Ciò si verifica quando la luce incidente coppie con Bloch-onda superficiale polaritone (BW-SPP) e/o i plasmoni di superficie localizzata (LSP)2.

Il principio fisico sottostante sfruttato quando biosensoristica con tali matrici periodiche è semplice. Adsorbimento di molecole su o vicino all'interfaccia di metallo cambia la costante dielettrica del mezzo a contatto con il metallo, a sua volta spostando la posizione delle bande di trasmissione nello spettro. Lo spettro di sé può essere regolato da nano-ingegneria la forma, dimensione e separazione distanza3,4,5. Per impostazione predefinita, sensori basati su EOT hanno bande caratteristici nei loro spettri che facilitano le assegnazioni specifiche6,7,8 durante l'inchiesta di associazione molecolare di eventi. Si tratta di un vantaggio cruciale sopra le piattaforme di resonance (SPR) del plasmone di superficie disponibili in commercio.

Sensori utilizzando EOT in genere coinvolgono una sorgente di luce otticamente allineata a tale che un fascio collimato è incidente sulla superficie del sensore. Tecniche per generare ordinata di grandi superfici, quali modelli di co-polimero e interferenza e Litografia nanosphere, hanno scarsa riproducibilità9. A causa di queste limitazioni nella fabbricazione accuratamente grandi superfici che presentano il fenomeno EOT, un microscopio ottico è stato richiesto per posizionare correttamente la sorgente luminosa ed il rivelatore. Per semplificare la tecnica, l'alta qualità nanoimprinting Litografia (NIL)10 è stato impiegato. Questo ha permesso la produzione di grandi dimensioni sensore superfici11 (mm-scala), eliminando la necessità di un microscopio cercare la superficie di rilevamento su un chip. Invece, questo sensore potrebbe essere facilmente interfacciato con una fibra ottica standard.

Poiché i picchi di trasmissione per questa matrice ordinata sono contenuti nella parte visibile alla regione di vicino infrarosso (NIR), è perfettamente adatto per gli eventi di associazione per biomolecole in ambiente acquoso di rilevamento. È stato simulato il comportamento ottico previsto della matrice ordinata. Il risultato è stata poi verificato attraverso studi con liquidi di indici di rifrazione standard (RI). Questa matrice è stata poi utilizzata per misurare la concentrazione di troponina cardiaca I (cTnI) nel complesso background di siero umano. cTnI è il gold standard clinici per la diagnosi di infarto miocardico acuto.

Utilizzando questo sensore, è possibile rilevare e quantificare la cTnI in siero umano a un limite di rilevabilità (LOD) di 0,55 ng/mL, che è clinicamente rilevante. La rilevazione è molto più veloce di quanto il più comunemente usato tecnologia in questo settore, analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA). Inoltre, la superficie di rilevamento può facilmente essere rigenerato e quindi riutilizzato. Quindi, questo lavoro dimostra la promessa di matrici ordinata come una valida tecnologia di (POC) point-of-care per biosensori all'interno del complesso biofluidi.

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Protocollo

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1. montaggio del sensore e acquisizione dei dati

  1. Preparazione dello stampo nichel
    1. Cappotto uno strato di 220 nm di spessore del fascio di elettroni negativi resistere su un wafer di 600 µm di spessore 4-in silicio. Scrivere la matrice ordinata progettato su questo wafer utilizzando un sistema di Litografia del fascio di elettroni.
      1. Per accelerare la trave e scrivere, scrivere i modelli con un basso dotmap (N) di 20k per ogni dimensione di campo di 300 µm (A) (cioè, ci sono mappati su ogni zona di2 300 µm 0,4 miliardi di punti, e ogni punto o sarà esposti dal e-fascio o non a seconda del design del modello). Impostata la dose di esposizione di resistere e-fascio per il resist 110 µC cm− 2 e scrivere ad una corrente (I) di 800 PA.
        Nota: Nella scrittura del fascio elettronico, la dose di esposizione (D) è controllata dal tempo di esposizione per ogni punto (Tdot), calcolato da figure-protocol-1 . Per la dose di esposizione alle 110 µC cm− 2, il tempo di abitazione del fascio elettronico su ogni punto esposto è 0,5 µs12. Poiché la matrice consente di acquisire un'area di 1.8 mm2, ci sono un totale di 36 patch delle zone di campo2 300 µm cuciti insieme a una matrice ordinata di oro, grande forma.
    2. Sviluppare il resistere immergendo la lastra di silicio 4 pollici nella soluzione di sviluppatore per 10 s e lasciando la cialda asciugare all'aria.
    3. Deposito di uno strato di seme di un metallo, quali nichel, rame o alluminio, sul wafer di silicio.
    4. Placcare la cialda in un sistema di placcatura in un bagno di nichel sulfamate. Svolgere l'elettrodeposizione in due passaggi. Nella prima fase, durata 95 min, utilizzare una densità di corrente di 0,7 A dm− 2; questo riempie completamente la nanopatterns con nichel. Nella seconda fase, durata 125 min, utilizzare 12 A dm− 2 per raggiungere 300 µm come lo spessore di stampo finale nichel (20 nm). Assicurarsi che il valore di pH è a 3,5-3,8 e che la temperatura sia a 52-54 ° C.
    5. Separare lo stampo di nichel dal substrato di silicio mediante l'applicazione di forza meccanica delicata. Immergere lo stampo di nichel in circa 100 mL di reagente rimozione photoresist positivo durante la notte per lavare via il residuo da resistere il fascio elettronico.
    6. Alimentare lo stampo di nichel in un forno e secco a 100 ° C per 3 h. pulirlo in un plasma etching sistema con O2 gas alle 10 sccm e 100 W per 3 min.
  2. Fabbricazione della nanostruttura oro
    1. Cappotto di 150 µ l di triclorosilano heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrodecyl (FDTS) sul calco di nichel in una macchina di rivestimento di autoassemblaggio monostrato (SAM) a 80 ° C.
      Nota: Questo formerà uno strato anti-adesivo, che permetterà la separazione dello stampo dal photoresist ("sformatura") dopo il completamento del passaggio nanoimprinting. Il tempo di vaporizzazione dovrebbe essere 180 s e il tempo di reazione dovrebbe essere 900 s.
    2. Imprimere la nanopatterns su un 4 - in wafer di vetro che è stato rivestito con uno strato di 300 nm di spessore di foto-curabile NIL resistere utilizzando un nano-imprinter ad una pressione di 10 bar e una temperatura di 40 ° C per 10 min.
    3. Trasferire lo stampo, il photoresist e la cialda di vetro di una lampada a luce UV sistema e photocure con 75 mW cm-2 di esposizione ai raggi UV per 30 s.
      Nota: Se tutti i passaggi siano stati eseguiti correttamente, la muffa di nichel dovrebbe essere estarre facilmente da photoresist.
    4. In un ione reattivo acquaforte sistema (RIE), eseguire un vuoto etch di photoresist sul substrato di vetro, con un flusso di gas di2 O di 10 sccm, a 50 W per 2 s per esporre il vetro sulle zone frastagliate.
    5. Depositare uno strato di 5 nm di spessore di cromo (Cr) per adesione metallo e uno strato di 100 nm di oro (Au) per il sensore plasmonico sul wafer di vetro in una macchina di deposizione del fascio di elettroni. Utilizzare una velocità di deposizione di 1 Å s− 1 per Cr e 2 Å s− 1 per Au.
    6. Eseguire a sollevamento di photoresist di incisione per 3 min seguita da una fase di sonificazione 15-s in acetone al plasma di O2 .
    7. Tagliare a dadini il campione nei circuiti integrati di 5 × 5 mm. La matrice ordinata occuperà il centrale 2 × 2 mm del chip.
  3. Acquisizione dei dati
    1. Impostare l'apparecchio per fare le misurazioni ottiche, tale che un fascio di luce bianca uscendo attraverso l'estremità della fibra ottica trasmettitore è collimato e incide sulla superficie del sensore (matrice ordinata) a 90°.
      Nota: La luce è trasmessa attraverso la matrice ordinata tutta.
    2. Raccogliere il segnale trasmesso con la fibra ottica ricevitore e registrarlo con uno spettrometro UV-visibile di funzionamento nell'intervallo da 300 a 1.000 nm.
    3. Impostare il tempo di acquisizione per ogni fotogramma di 20 ms media 100 fotogrammi per ottenere lo spettro finale per abbassare il rumore nelle misurazioni.
    4. Utilizzare software di tracciato per analizzare i dati basati sui picchi di trasmissione precedentemente identificato (utilizzando un metodo basato su Lorentz).

2. Test di sensibilità di massa sensore

  1. Depositare il liquido RI standard nella cellula liquida, con il RI varia da 1.31 a 1,39.
  2. Immergere il chip sensore nel liquido RI standard e allinearla con il fascio di luce bianca. Ottenere lo spettro di trasmissione.
  3. Pulire il chip del sensore dopo ogni misurazione con un reagente pulizia tensioattivo e asciugarlo con gas azoto.

3. sensore modificazione superficiale

  1. Prima di eventuali modificazioni chimiche, pulire i chip sensore ad immersione sequenziale in isopropanolo, acetone e acqua deionizzata. Asciugare a temperatura ambiente in un flusso di gas di azoto secco.
  2. Incubare i chip del sensore in una soluzione etanolica di 0,4 mM 10-carboxy-1-decanethiol e 1,6 mM 1-octanethiol per 12 h a temperatura ambiente.
    Nota: Questo si formerà un'ammina-reattivo autoassemblaggio monostrato (SAM).
  3. Utilizzare etanolo per sciacquare bene e asciugare a temperatura ambiente.
  4. Fare un miscuglio di 75mm sulfo-N-Idrossisuccinimide (sulfo-NHS) e 15 mM 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC). Immergere i chip in questa miscela per 15 min.
    Nota: Questo attiverà il gruppo carbossilico del SAM.
  5. Spot di 50 µ l di soluzione di anticorpo anti-troponina µ g/mL 200 realizzata in un tampone di acetato pH 4,5 sulla superficie del sensore e incubare per 30 min.
  6. Disattivare gli esteri non reagiti immergendo il chip sensore nella soluzione di etanolammina-HCl 1 M per 15 min.
  7. Sciacquare il chip con acqua deionizzata e asciugare in un flusso di gas di azoto secco a temperatura ambiente.

4. cTnI Assay

  1. Bloccare qualsiasi legame aspecifico spotting 100 µ l di soluzione di albumina di siero bovino (BSA) 1% sulla superficie.
Incubare per 15 min.
  • Sciacquare i chip sensore tre volte in soluzione tampone fosfato salino (PBS). Inserire il chip nella cella di misura per registrare lo spettro di trasmissione.
    Nota: Questo è lo spettro di riferimento.
  • Spot di 50 µ l di standard sulla superficie del chip di cTnI e incubare in un ambiente umido per 30 min.
  • Risciacquare i chip sensore tre volte in soluzione PBS e inserire la cella di misura per registrare lo spettro di trasmissione.
    Nota: Questo è lo spettro di After-associazione.
  • Immergere i chip in 50 mM glicina-HCl (pH 2) per 1 min e risciacquare in soluzione PBS, tre volte per rigenerare la superficie del chip. Misurare lo spettro di trasmissione in PBS per verificare il successo della fase di rigenerazione.

    • 5. surface Plasmon Resonance (SPR) misura

    1. Eseguire il multiplex chip sensore SPR sul sistema SPR con tampone PBS-T.
      Nota: La composizione del tampone PBS-T è Na-fosfato di 20 mM, 150 mM NaCl e 0.05% Tween 20. Il pH di 7,4.
    2. Utilizzare la cTnI standard e l'anticorpo, come descritto nel passaggio 4.
    3. Attivare 3 su 6 canali disponibili con una miscela di EDC (0,2 M) e sulfo-NHS (0,05 M) per 5 min, eseguire un'iniezione di 5 min di 50 µ g/mL di un anticorpo 560 e un'iniezione di 5 min di 1 M etanolammina-HCl soluzione.
    4. Ruotare il chip sensore di 90° e iniettare gli standard di cTnI alle concentrazioni differenti (75, 30, 7.5 e 2,5 ng/mL).
    5. Osservare la coniugazione per l'anticorpo in punti di interazione sul chip in tempo reale attraverso la lettura SPR.
    6. Rigenerare il chip iniettando 50 mM glicina-HCl (pH 2) per 1 min.

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    Risultati

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    L'installazione di ottica per le misurazioni è mostrato in Figura 1A. Un'immagine della matrice ordinata effettivo è dato in Figura 1B. Per capire la fisica che guida il processo di rilevamento, il software di simulazione COMSOL era utilizzato per simulare la distribuzione del campo plasmonica in ambiente acquoso. I risultati della simulazione sono stati collegati quindi la misura reale. Uno studio pubblicato in precedenza contie...

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    Discussione

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    Simulando l'interazione tra luce incidente e nanostrutture permette di identificare il picco appropriato (nello spettro di trasmissione), cui spostamento può essere registrato come una funzione della concentrazione dell'analita. È importante notare che la localizzazione delle bande rispetto alla struttura del sensore è fondamentale la scelta della fascia destra, cui MAIUSC possono essere monitorati per rilevare l'analita. La visualizzazione può essere raggiunto attraverso simulazioni. Questo è anche fondamentale per la p...

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    Dichiarazioni

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    Gli autori non hanno nessun concorrenti interessi finanziari.

    Ringraziamenti

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    AP riconosce il sostegno della Prof T Venkatesan, direttore, NUS nanoscienza e nanotecnologia iniziativa e ufficio del Vice Presidente (National University of Singapore) (R-398-000-084-646). CLD riconosce il sostegno di Singapore Ministero della salute National Medical Research Council sotto suo medico scienziato meccanismo di finanziamento, NMRC/CSA/035/2012 e la National University of Singapore. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.

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    Materiali

    Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
    NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
    Configurazione della litografia a fascio di elettroniElionix ELS 700
    o-XyleneSigma Aldrich95662
    EB resistSumitomoNEB-22A2
    Reagente sviluppatoreShipley CompanyMicroposit MF 321
    Macchina galvanicaTechnotrans AG RD 50
    Photoresist stripper Materiali elettronici Rohm and Haas  LLCMicroposit Remover 1165
    Sistema di incisioneTrion Phantom
    Heptadecafluoro-1,1,2,2-tetraidrodecil)triclorosilano Gelest (PA, USA)78560-44-8
    SAM coater Sorona Inc.AVC 150M
    Fotopolimerizzabile NIL resistmicro resist technology GmbHmr-UVCur21-300nm
    Sistema di fotopolimerizzazioneDymax Modello 2000 Flood
    E-beam deposition machineDenton Explorer
    spettrometro UV-visibile Ocean optic HR2000+ (Dunedin, FL, USA)
    Liquidi con indice di rifrazione standard Cargill Inc (Cedar Grove, USA)18032
    Software di tracciaturaOriginOrigin Pro 9
    10-carbossi-1-decanetiolo Dojindo Laboratories (Giappone)C385-10
    1-ottanotiolo Sigma-Aldrich, MO, USA471386
    Sulfo-N-idrossisuccinimide e 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide...BioRad (CA, USA)1762410
    Anticorpo anti-troponina 560Hytest (Finlandia)Soluzione 4T21
    di etanolammina-HClBioRad (CA, USA)1762450 Configurazione della
    risonanza plasmonica di superficieBioRad XPR36 (Haifa, Israele)
    Chip SPR multiplexatoBioRadGLC
    Human cTnI standardPhoenix Prodotti farmaceuticiEK -311-05
    Glicina-HClBioRad (CA, USA)1762221

    Riferimenti

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