Un metodo per preparare le cellule degli insetti e infettare con baculovirus per la produzione di ricombinante proteinand mCD1d generare tetrameri mCD1d.
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Articolo metodologico
Un metodo per la produzione di proteine ricombinanti mCD1d in cellule di insetto.
In questo articolo
Sommario
Abstract
CD1 proteine costituiscono una terza classe di molecole presentanti l'antigene. Si tratta di glicoproteine della superficie cellulare, espresso in circa 50-kDa glicosilata catene pesanti che sono associati con noncovalently beta2-microglobulina. Si legano i lipidi piuttosto che peptidi. Anche se la loro struttura conferma la somiglianza dei CD1 proteine MHC di classe I e molecole di classe II che presentano l'antigene, il groove mCD1d è relativamente stretta, profonda e altamente idrofoba e ha due tasche vincolanti anziché le tasche diverse superficiale descritto per la classica MHC- codificati che presentano l'antigene molecole. In base al loro sequenze di aminoacidi, come un solco hydrobphobic fornisce un ambiente ideale per il legame di antigeni lipidici.
Il Natural Killer T (NKT) le cellule utilizzano per riconoscere il loro TCR glicolipidi legato o presentato da CD1d. Cellule T reattive di lipidi presentati da CD1 sono stati coinvolti nella protezione contro le malattie autoimmuni e infettive e nel rifiuto del tumore. Così, la capacità di identificare, purificare e tenere traccia la risposta del CD1-reattiva delle cellule NKT è di grande importanza. La generazione di tetrameri di alfa galattosiltransferasi ceramide (a-Galcer) con CD1d ha una visione significativa sulla biologia delle cellule NKT. Tetrameri costruite da altre molecole CD1 sono stati generati e questi nuovi reagenti hanno notevolmente ampliato la conoscenza delle funzioni di lipidi cellule T reattive, con un potenziale utilizzo nel monitoraggio della risposta ai vaccini a base di lipidi e nella diagnosi delle malattie autoimmuni e di altre trattamenti.
Protocollo
I. Scongelare le cellule
Prendere il flacone ghiacciato di TN5 cellule, e scongelare in un bagno d'acqua a 37 ° C. Aggiungere 5 ml di media insetti Express (Invitrogen, numero di catalogo-10486) a 25 centimetri 2 fiasco TC. Si noti che cinque viene espresso senza Glutammina; bisogno di aggiungere 10 ml di streptococco penna 100X glutammina o glutammina da sola a 1 lt dei media. Aggiungi TN5 cellule in esso e incubare per 30 minuti in un incubatore 27 ° C. Poi, aspirare il terreno con DMSO delicatamente senza disturbare le cellule attaccato al fondo del pallone. Aggiungere 5 ml di terreno fresco.
II. C....
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Discussione
In questa procedura, viene mostrato come iniziare, crescere, infettare cellule di insetto e come titolo il baculovirus utilizzando queste cellule. Gli aspetti più importanti di questa procedura sono la manutenzione delle celle e di conoscerne il titolo esatto del baculovirus. Una volta che avete generato CD1 tetrameri, possono essere utilizzati come un potente strumento per l'analisi dei glicolipidi cellule T reattive. Baculovirus sistemi sono ampiamente utilizzati anche per la produzione di proteine ricombinanti, compresa tetrameri M.......
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Express Five SFM | Mezzo privo di siero | Invitrogen | 10486025 | |
| High Five TM | Cellule di insetto | Invitrogen | B855-02 | |
| Glutamine Pen strep | Antibiotici | Invitrogen | 10378-016 | |
| 25cm2 TC Flask | Flacone in plastica | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| 175 cm2 TC Flask | Flacone con tappo sigillante | Fisher Scientific | 10-126-8 | |
| Beuta di Erlenmeyer | Flacone per coltura cellulare | Fisher Scientific | 07 200 672 | |
| Concentratore YM 30 | 30,000 MWCO | EMD Millipore | UFC 903096 | |
| Attrezzatura FPLC | GE Healthcare | |||
| Enzima BrA e tampone | Kit per biotinilazione | Avidity | BIRA500 | |
| Colonna Ni-NTA Agarosio | Colonna per purificazione proteine con tag His | GE Healthcare | ||
| Colonna di desalazione | Per rimuovere il sale dalla proteina | GE Healthcare | ||
| Colonna MonoQ | Cromatografia a scambio anionico | GE Healthcare | ||
| Colonna S200 | Cromatografia di esclusione molecolare | GE Healthcare | ||
| alpha-Galcer | Glicolipide | |||
| Streptavidina-PE | Per coniugare la proteina | Molecular Probes, Life Technologies | S-866 |
Riferimenti
- Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers. J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).
- Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M.
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Ristampe e permessi
