Isolamento simultaneo di cardiomiociti di alta qualità, cellule endoteliali e fibroblasti da un cuore di ratto adulto

Summary

Sono stati sviluppati e descritti diversi protocolli per l'isolamento di diversi tipi di cellule cardiache da un cuore del topo. Qui viene descritto un protocollo ottimizzato che consente l'isolamento di tipi di cellule cardiache di elevata qualità (cardiomiociti, cellule endoteliali e fibroblasti) da una singola preparazione, riducendo i costi sperimentali.

Abstract

Il ratto è un importante modello di animali utilizzato nella ricerca cardiovascolare e le cellule cardiache del ratto vengono usate in maniera routinaria per l'analisi in vitro dei meccanismi molecolari della progressione della malattia cardiovascolare come l'ipertrofia cardiaca, la fibrosi e l'aterosclerosi. Sebbene siano stati fatti diversi tentativi con successo variabile per sviluppare linee cellulari immortalizzate dal sistema cardiovascolare per comprendere questi meccanismi cellulari, le cellule primarie offrono un ambiente più naturale e vicino all'ambiente in vivo per tali studi. Pertanto, diversi laboratori che lavorano su un particolare tipo di cellule hanno sviluppato protocolli per isolare singoli tipi di cellule cardiache di ratto di interesse. Manca un protocollo che consente l'isolamento di più di un tipo di cella. Qui viene descritto un protocollo ottimizzato che consente l'isolamento di tipi di cellule cardiache di elevata qualità (cardiomiociti, cellule endoteliali e fibroblasti) da una singola preparazione e consente diR per l'analisi cellulare. Ciò consente l'uso più efficiente delle risorse disponibili, che possono risparmiare tempo e ridurre i costi di ricerca.

Introduction

I modelli di roditori sono da tempo usati come strumenti per ampliare la nostra comprensione della fisiologia cardiovascolare in salute e malattie. ¹ Anche se questi modelli animali ci permettono di comprendere la fisiopatologia di una malattia a livello di organo e di analizzare la farmacocinetica e la farmacodinamica di vari agenti farmacologici utilizzati per il trattamento delle malattie cardiovascolari, la comprensione dei meccanismi molecolari dello sviluppo delle malattie cardiovascolari e il contributo di un particolare Tipo di cellule richiede l'uso di modelli di coltura cellulare in vitro . A tal fine sono state sviluppa....

Protocol

L'indagine è conforme alla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio pubblicata dall'Istituto Nazionale di Salute degli Stati Uniti (NIH Publication No. 85-23 1985) ed è stata approvata dal comitato etico locale dell'Università di Giessen. In questo studio sono stati utilizzati ratti maschi Wistar adulti di peso da 200 a 250 g.

1. Autoclave

1. Almeno un giorno prima della procedura deve essere eseguito, autoclave tutti gli strumenti chirurgici, i pipette e le pipette Pasteur da utilizzare in fase di isolamento a 121 ° C per 30 minuti.

2. Preparazione di supporti e soluz....

Results

La procedura di isolamento comporta una resa del 70-80% di cardiomiociti vivi, a forma di stelo e striato ( figure 2A e 2C ) che possono essere utilizzati per esperimenti pianificati. Nel nostro laboratorio i cardiomiociti vengono utilizzati abitualmente per l'analisi della segnalazione Ca ²⁺ . La Figura 5A mostra oscillazioni intracellulari di calcio [Ca ²⁺ ] _i in risposta all'ischemia / reperfu.......

Discussion

In questo articolo viene descritto un protocollo riproducibile per l'isolamento e la coltura di miociti cardiaci, cellule endoteliali e fibroblasti. Questo protocollo descrive l'isolamento simultaneo e di alta qualità dei principali tipi di cellule del tessuto cardiaco, vale a dire cardiomiociti, cellule endoteliali e fibroblasti, a differenza di un solo tipo di cellula. Un passo critico nella procedura di isolamento è la corretta digestione del tessuto cardiaco. Se la digestione è incompleta, può ancor.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-vWF	Santa Cruz Biotech.	SC-14014
Cloruro di calcio	Merck	102378
Carnitina	Sigma-Aldrich	C0283
Collagenasi tipo II	Worthington	LS004176
Creatina	Sigma-Aldrich	C0780
D-Glucosio		Merck 108342
Dil-Ac-LDL	Thermo Scientific	L3484
Soluzione EDTA (0,2 M)	Biochrome AG	L2113
Soluzione di inclusione	Citiflour	AF1-25
Terreno cellulare endoteliale MV2	PromoCell	C-22022
Siero fetale di vitello (FCS)	Biochrome AG	S0615
Gentamicin	Serva Chemicals	47991
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887
Isoflurano	Abbott	TU 061219
Laminina	Roche/Sigma	11243217001
M199 medium	Thermo Scientific	11150059
M199 medium (Polvere)	Biochrome AG	T061
Solfato di magnesio	Sigma-Aldrich	63138
Anticorpo CD31 anti-ratto di topo (TLD-3A12)	Thermo Scientific	MA1-81051
Soluzione di NaCl (0,9%), Sterile	B. Braun
Perle di IgG di topo Pan (Dynabeads)	Thermo Scientific	11041
Paraformaldeide (PFA) Soluzione al 4%	Santa Cruz Biotech.	sc-281692
Penicillina-streptomicina	Thermo Scientific	15070-063
Soluzione salina tampone fosfato (PBS) 1x	PAN-Biotech	P04-36500
Materiali di consumo in plastica	Greiner Bio-One
Cloruro di potassio	Merck	4933
Diidrogeno fosfato di potassio	Merck	7873
Cloruro di sodio	Merck	6404
Soluzione di idrossido di sodio (2 N)	Merck	109136
sterile sistema di filtrazione	Thermo Scientific	5660020
Taurina	Sigma-Aldrich	T8691
TO-PRO	Thermo Scientific	T3605
Soluzione di tripsina-EDTA (10x)	Sigma-Aldrich	T4174
Acqua, sterile	B. Braun