Erba lievito è un modello vantaggioso per lo studio della dinamica dei microtubuli in vivo grazie ai suoi potenti genetica e la semplicità della sua citoscheletro microtubuli. Il seguente protocollo descrive come trasformare le cellule e la cultura di lievito, di acquisire immagini di microscopia confocale, e quantitativamente analizzare dinamica dei microtubuli in cellule di lievito viventi.
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Articolo metodologico
Ad alta risoluzione Imaging e analisi dei singoli microtubuli astrali Dynamics in germogliamento lievito
In questo articolo
Sommario
Abstract
microtubuli dinamiche sono fondamentali in molti processi cellulari, e misurazioni accurate della dinamica dei microtubuli possono fornire informazioni su come le cellule regolano questi processi e come mutazioni genetiche regolazione impatto. La quantificazione della dinamica dei microtubuli in modelli metazoi ha un certo numero di problemi connessi, compresi una densità microtubuli elevato e limitazioni manipolazioni genetiche. Al contrario, il modello di lievito in erba offre vantaggi che superano queste sfide. Questo protocollo descrive un metodo per misurare la dinamica dei singoli microtubuli in cellule di lievito viventi. Cellule che esprimono tubulina fluorescente contrassegnati sono rispettate camere di scorrimento assemblate, consentendo l'acquisizione di immagini time-lapse stabile. Una guida dettagliata per l'alta velocità, è prevista anche l'acquisizione di immagini a quattro dimensioni, così come un protocollo per quantificare le proprietà dei microtubuli dinamiche in pile di immagine confocale. Questo metodo, combinato con la genetica del lievito convenzionali, providi un approccio che è particolarmente adatto per valutare quantitativamente gli effetti regolatori microtubuli o mutazioni che alterano l'attività di subunità di tubulina.
Introduzione
I microtubuli sono polimeri del citoscheletro fatti di subunità proteiche αβ-tubulina e sono utilizzati in un'ampia varietà di contesti cellulari, compreso il trasporto intracellulare, la divisione cellulare, morfogenesi, e la motilità. Per costruire reti microtubuli per questi ruoli diversi, le cellule devono regolamentare con attenzione dove e quando modulo di microtubuli. Questa regolazione viene eseguita per mezzo di reazioni che o assemblare subunità αβ-tubulina in microtubuli polimeri o microtubuli smontare in subunità liberi; questo è noto come dinamica dei microtubuli.
Uno degli obiettivi principali del campo microtubulo è que....
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Protocollo
1. Preparazione Piastre -Leu Dropout
- Aggiungere 800 mL di acqua sterile deionizzata (DIH 2 O) in un pallone da 2 L. Aggiungere 26.71 g della base dropout (DOB) in polvere, 0,69 g di CSM-Leu, e 20 g di agar. Mescolare con un bastoncino magnetico. Portare a 1 L con DIH 2 O.
- Autoclave a 121 ° C e 19 psi per 30 min.
- Rimuovere la beuta dall'autoclave e lasciarla raffreddare a ~ 65 ° C con delicata agitazione.
- Versare 30 ml / piastra in piastre 100 mm di diametro. Siano questi riposare a temperatura ambiente per 36-48 ore prima della conservazione a 4 ° C.
2. L'integrazi....
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Risultati
Misurazione dinamica dei microtubuli in cellule di lievito viventi fornisce uno strumento valido per valutare come mutazioni in geni codificanti regolatori microtubuli o tubulina subunità polimerizzazione impatto e tassi di depolimerizzazione, così come la frequenza di transizione tra questi stati. La figura 1 mostra una serie temporale di dinamica dei microtubuli astrali in una cella wild-type e una cellula mutante con una mutazione nel β-tubulina (tub2- 430Δ)........
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Discussione
Il modello lievito gemmante offre importanti vantaggi per la raccolta di misurazioni ad alta risoluzione della dinamica dei microtubuli in un ambiente in vivo, compresa la capacità di immagini singole microtubuli nel tempo e la capacità di manipolare tubuline e regolatori microtubuli utilizzando gli strumenti della genetica del lievito.
Le camere Concanavalina A-patinata forniscono un certo numero di vantaggi rispetto apparati precedentemente descritti, tra pastiglie fuso agar. Vetr.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Ringraziamo Kerry Bloom (University of North Carolina), Kyung Lee (NCI), Steven Markus (Colorado State University), e Elmar Schiebel (Universität Heidelberg) per la condivisione di vari plasmidi FP-tub1. Siamo grati a Melissa Gardner (University of Minnesota) per noi la formazione nel metodo di preparazione camera di scorrimento. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH) concedere R01GM112893-01A1 (a JKM) e T32GM008730 (a CE).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DOB (basi di abbandono) | Sunrise science | 1650 | |
| CSM-Leu | Scienza dell'alba | 1005 | |
| Agar | Ameresco | N833 | |
| Piastre in polistirene da 100 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| ssDNA (Samon Sperm) in sterili DiH2O | Sigma-Aldrich | D7656 | risospensione a 10 mg/mL in DiH2O. Memorizza le aliquote a -20 º C |
| Mezzi completi sintetici | Scienza dell'alba | 1459-100 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | risospensione a 2 mg/mL in DiH2O. Memorizza le aliquote a -20 º C |
| Vetrini per microscopio | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Vetrini coprioggetti per microscopio | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | film di paraffina |
| VALAP (parti uguali di vaselina, lanolina e paraffina) | fonde a 75 º C prima dell'uso | ||
| pinze | Fisher Scientific | 16-100-106 | |
| Glicole poiletilenico (PEG) 3350 | Sigma-Aldrich | 202444 | |
| Name | Azienda | Catalog Number | Comments |
| Microscopio | |||
| Ti E microscopio invertito Perfect Focus | Nikon Instruments | MEA53100 | |
| 1.45 NA 100X CFI Plan Apo objective | Nikon Instruments | MRD01905 | |
| Stadio piezoelettrico | Physik Instrumente | P-736 | |
| Scanner a disco rotante | Yokogawa | CSU10 | |
| Modulo combinatore laser | Agilent Technologies | MCL400B | |
| fotocamera EMCCD | Andor Technology | iXon Ultra 897 | |
| Name | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Software | |||
| Microsoft Excel software | Microsoft | ||
| Software MATLAB | MathWorks, Inc | ||
| ImageJ64 | NIH | Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| microscopia aperto | |||
| Name< | strong>Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmidi | |||
| pUC19-LEU2::GFP-TUB1 | pSK1050 | riferimento: Song, S. e Lee, K. S. Una nuova funzione di Saccharomyces cerevisiae CDC5 nella citochinesi. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001) |
Riferimenti
- Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nat Cell Biol. 15 (6), 688-693 (2013).
- Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic beha....
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Ristampe e permessi
