Qui viene presentato un protocollo per esperimenti FRET ad alta precisione a livello di singola molecola. Inoltre, questa metodologia può essere usata per identificare tre stati conformazionali nel dominio legante del legame del recettore N-metil-D-aspartato (NMDA). Determinare le distanze precise è il primo passo verso la costruzione di modelli strutturali basati su esperimenti FRET.
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Articolo metodologico
FRET di alta precisione a singolo livello molecolare per la determinazione della struttura biomolecola
In questo articolo
Sommario
Abstract
Qui viene illustrato un protocollo su come effettuare misure di distanza interdette ad alta precisione utilizzando il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) a livello di singola molecola nel modo di rilevamento a fluorescenza multiparametrica (MFD). MFD massimizza l'utilizzo di tutte le "dimensioni" della fluorescenza per ridurre gli artefatti fotofisicali e sperimentali e permette di misurare la distanza interdetta con una precisione fino a ~ 1 Å in biomolecole rigide. Questo metodo è stato utilizzato per identificare tre stati conformazionali del dominio ligando-legame del recettore N-methyl-D-aspartato (NMDA) per spiegare l'attivazione del recettore dopo legame legame. Quando si confrontano le strutture cristallografiche note con misure sperimentali, si sono accordati entro meno di 3 Å per biomolecole più dinamiche. Raccogliere un insieme di limitazioni di distanza che copre l'intera dimensionalità delle biomolecole permetterebbe di fornire un modello strutturale di biomoleculo dinamicoes.
Introduzione
Un obiettivo fondamentale degli studi di biologia strutturale è quello di svelare il rapporto tra la struttura e la funzione delle macchine biomolecolari. La prima impressione visiva delle biomolecole ( es. Proteine e acidi nucleici) si è verificata negli anni '50 attraverso la cristallografia a raggi X a sviluppo. La cristallografia a raggi X fornisce informazioni strutturali statiche ad alta risoluzione, vincolate dall'imballaggio in cristallo. Pertanto, l'immobilità intrinseca dei modelli strutturali a raggi X evita la natura dinamica delle biomolecole, un fattore che influenza la maggior parte delle funzioni biologiche 3
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Protocollo
1. Preparazione del buffer PBS e trattamento della camera
NOTA: Indossare un cappotto di laboratorio e guanti monouso durante l'esecuzione di esperimenti chimici bagnati. Utilizzare la protezione dell'occhio durante l'allineamento del laser.
- Preparazione del buffer PBS
- Sciogliere 4,5 g di Na 2 HPO 4 , 0,44 g di NaH2P04 e 3,5 g di NaCl in 400 ml di acqua distillata. Assicurarsi un pH di 7,5 e sterilizzare la soluzione autoclave su un ciclo liquido per 1 h (a seconda del sistema autoclave).
- Prendere 15 ml della soluzione PBS e mescolarlo con 0,1 g di carbone. F....
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Risultati
Negli esperimenti tipici smFRET che utilizzano una configurazione MFD (linee laser: 485 nm a 60 μW e 640 nm a 23 μW, sezione 5.1), il campione di fluorescenza viene diluito a una concentrazione picomolare bassa ( 10-12 M = 1 pM) In un microscopio confocale, dove un impulso laser sub-nanosecondo eccita molecole etichette che diffondono liberamente attraverso un volume di eccitazione. Un volume confocale tipico è <4 femtolitri (fL). A tali basse concentrazioni, solo una singo.......
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Discussione
In questo lavoro viene presentato il protocollo per allineare, calibrare e misurare le distanze interdite con alta precisione usando esperimenti FRET di una molecola PIE-MFD. Calibrando attentamente tutti i parametri strumentali, è possibile aumentare l'accuratezza delle distanze misurate e raggiungere l'accuratezza di Angstrom. A tal fine vengono utilizzati diversi istogrammi multidimensionali per analizzare e identificare le popolazioni per ulteriori caratterizzazioni. Utilizzando il tempo medio di macro per v.......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti con i contenuti di questo articolo.
Ringraziamenti
VJ e HS riconoscono il supporto da NIH R01 GM094246 a VJ. HS riconosce fondi di start-up dal Clemson University Creative Inquiry Program e dal Centro per le Tecnologie di Scienza e Tecnologia dei Materiali Ottici presso l'Università Clemson. Questo progetto è stato inoltre sostenuto da una borsa di studio del Centro Keck per l'addestramento di bioscienza interdisciplinare dei Consorzi della Costa del Golfo (NIGMS Grant No. 1 T32GM089657-05) e dello Schissler Foundation Fellowship for Translational Studies di comuni malattie umane a DD. Il contenuto è esclusivamente responsabile degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istitut....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| carbone | Merck KGaA | K42964486 320 | |
| filtro per siringa | Fisherbrand | 09-719C | dimensioni: 0,20 µ vetro |
| di copertura a camera | m Fisher Scientific 155409 | 1,5 vetro borosilicato, 8 pozzetti vetro | |
| di copertura per microscopio | Fisher Scientific | 063014-9 | dimensioni: 24 x 60-1,5 |
| acqua priva di nucleasi | Fisher Scientific Fisher Scientific | 148859 | senza nucleasi |
| tween-20 | Thermo Scientific | 28320 | soluzione al 10% di polisorbato 20 |
| filamento di DNA accettore ( High FRET) | Integrated DNA Technologies | 178124895 | 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC) |
| accettore DNA filamento (Low FRET) | DNA Technologies | 177956424 | 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC) |
| filamento di DNA donatore | integrato DNA Technologies | 177951437 | 5´ -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG) |
| filamento di DNA (No FRET) | Integrated DNA Technologies | 5´ -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC) | |
| termociclatore | Eppendorf | E6331000025 | nexus gradient |
| Alexa Fluor 488 C5 Maleimide | Thermo Scientific | A10254 | chiamato fluoroforo verde ciano nel manoscritto |
| Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Thermo Scientific | A20347 | chiamato fluoroforo rosso lontano nel manoscritto |
| Rodamina 110 | Sigma-Aldrich | 83695-250MG | |
| Rodamina 101 | Sigma-Aldrich | 83694-500MG | |
| LB Brodo, Miller | Fisher Scientific | BP1426 | Per la coltura di E. coli |
| Ampicillina | Sigma-Aldrich | A0166 | Usato a 100 & micro; g/mL concentrazione finale in terreno LB selettivo per mantenere la selezione plasmidica |
| Tetraciclina | Calbiochem | 58346 | Usato a 12,5 & micro; g/mL concentrazione finale in terreno LB selettivo per mantenere la mutazione gor (flutatione reduttasi) nei ceppi Origami B(DE3) per facilitare l'ossidazione del legame disolfuro |
| Kanamicina | Fisher Scientific | BP906-5 | Utilizzato a 15 &; g/mL concentrazione finale in terreno LB selettivo per mantenere la mutazione trxB (rioredossina reduttasi) nelle colorazioni B(DE3) per facilitare l'ossidazione del legame disolfuro |
| Origami B(DE3) Cellule competenti | Millipore | 70837-3 | Cellule E. coli competenti per l'espressione di proteine con ponti disolfuro |
| Isopropil-beta;-D-tiogalattopiranoside (IPTG) | Fisher Scientific | BP1755 | Per l'induzione dell'espressione proteica E. coli |
| Chelating HiTrap HP | GE Life Sciences | 17-0409-01 | Per la purificazione FPLC su larga scala della proteina Hi-taged |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| Ni-NTA Agarosio | Qiagen | 30210 | |
| PD-10 Colonna di desalinizzazione | GE Life Sciences | 17-0851-01 | |
| AktaPurifier | GE Life Sciences | 28406264 | Strumento FPLC |
| Tubi per dialisi | Spectrum labs | 132562 | 15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 metri/rotolo |
| Dicroics | Semrock | FF500/646-Di01-25x36 | 500/646 BrightLight |
| 50/50 Polarizzatore divisore di fascio | Qioptiq Linos | G33 5743 000 | Polarizzatore di film 10 x 10 |
| Filtro passaverde | Chroma | ET525/50m | ET525/50m Attacco 25 mm di diametro |
| Filtro passa rosso | Chroma | ET720/150m | ET720/150m Misuratore |
| di potenza Misuratore di potenza | ThorLabd | PM200 | |
| Spettrofotometro UV-Vis | Varian | Cary300Bio | |
| Fluorolog 3 | Horiba | FL3-22-R3 | |
| Fluorohub TCSPC controller | Horiba | Fluorohub-B | TCSPC elettronica per misure d'insieme |
| NanoLed 485L | Horiba | 485L | Laser a diodi blu |
| NanoLed 635L | Horiba | 635L | Laser a diodi rossi |
| Olympus IX73 Microscopio | Olympus | IX73P2F | Telaio per microscopio |
| PMA 40 Hybrid Detector | PicoQuant GmbH | 932200, PMA 40 | Ottimizzato per il rilevamento del verde |
| Rivelatore ibrido PMA 50 | PicoQuant GmbH | 932201, PMA 50 | Ottimizzato per la sensibilità del cambio ed |
| a 485 nm | PicoQuant GmbH | LDH-D-C-485 | |
| 640 nm | PicoQuant GmbH | LDH-D-C-640 | |
| Hydraharp 400 e software di acquisizione TTTR | PicoQuant | 930021 | Timer per eventi a picosecondi e unità di formazione a singolo fotone correlato nel tempo, include il software di acquisizione TTTR |
| SEPIA II SLM 828 e il software SEPIA | Driver laser PicoQuant | 910028 | per impulsi a picosecondi, include il controller software SEPIA. |
| computer | Dell | optiplex 7010 | cpu: i7-3770 ram: 16GB |
| FRET Positioning and Screening (FPS) software | Heinrich Heine Unviersity | Include il clacualtor Accesibel Volume disponibile presso http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html | |
| suite MFD | Heinrich Heine Unviersity | Include il pacchetto software BIFL Paris; Margarita per la visualizzazione degli isotram multiparametrici e software di analisi della distribuzione di probabilità disponibili a http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html |
Riferimenti
- Kendrew, J. C. Architecture of a protein molecule. Nature. 182 (4638), 764-767 (1958).
- Kendrew, J. C., et al. A three-dimensional model of the myoglobin molecule obtained by x-ray analysis. Nature. 181 (4610), 662-666 (1958).
- Henzler-Wildman, K., Kern, D.
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Ristampe e permessi
