Articolo metodologico

FRET di alta precisione a singolo livello molecolare per la determinazione della struttura biomolecola

DOI:

10.3791/55623

⸱

13 maggio 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Clemson University, 2Department of Physics and Astronomy, Clemson University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center for Membrane Biology, Graduate School for Biomedical Sciences, University of Texas Health Science Center

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui viene presentato un protocollo per esperimenti FRET ad alta precisione a livello di singola molecola. Inoltre, questa metodologia può essere usata per identificare tre stati conformazionali nel dominio legante del legame del recettore N-metil-D-aspartato (NMDA). Determinare le distanze precise è il primo passo verso la costruzione di modelli strutturali basati su esperimenti FRET.

Abstract

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Qui viene illustrato un protocollo su come effettuare misure di distanza interdette ad alta precisione utilizzando il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) a livello di singola molecola nel modo di rilevamento a fluorescenza multiparametrica (MFD). MFD massimizza l'utilizzo di tutte le "dimensioni" della fluorescenza per ridurre gli artefatti fotofisicali e sperimentali e permette di misurare la distanza interdetta con una precisione fino a ~ 1 Å in biomolecole rigide. Questo metodo è stato utilizzato per identificare tre stati conformazionali del dominio ligando-legame del recettore N-methyl-D-aspartato (NMDA) per spiegare l'attivazione del recettore dopo legame legame. Quando si confrontano le strutture cristallografiche note con misure sperimentali, si sono accordati entro meno di 3 Å per biomolecole più dinamiche. Raccogliere un insieme di limitazioni di distanza che copre l'intera dimensionalità delle biomolecole permetterebbe di fornire un modello strutturale di biomoleculo dinamicoes.

Introduzione

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Un obiettivo fondamentale degli studi di biologia strutturale è quello di svelare il rapporto tra la struttura e la funzione delle macchine biomolecolari. La prima impressione visiva delle biomolecole ( es. Proteine ​​e acidi nucleici) si è verificata negli anni '50 attraverso la cristallografia a raggi X a sviluppo. La cristallografia a raggi X fornisce informazioni strutturali statiche ad alta risoluzione, vincolate dall'imballaggio in cristallo. Pertanto, l'immobilità intrinseca dei modelli strutturali a raggi X evita la natura dinamica delle biomolecole, un fattore che influenza la maggior parte delle funzioni biologiche 3 , 4 , 5 . La risonanza magnetica nucleare (NMR) 6 , 7 , 8 ha fornito una soluzione alternativa al problema risolvendo i modelli strutturali in soluzioni acquose. Un grande vantaggioDi NMR è la sua capacità di recuperare la natura dinamica intrinseca delle biomolecole e degli ensemble conformazionali, che aiuta a chiarire le relazioni intrinseche tra struttura, dinamica e funzione 3 , 4 , 5 . Tuttavia, NMR, limitato per dimensione del campione e grandi quantità di campioni, richiede strategie complesse di etichettatura per i sistemi più grandi. Pertanto, c'è una necessità urgente di sviluppare metodi alternativi nella biologia strutturale.

Storicamente, il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) 9 non ha assunto un ruolo importante nella biologia strutturale a causa del malinteso che FRET fornisce misure di distanza a bassa precisione. Lo scopo di questo protocollo è quello di rivedere la capacità di FRET di determinare le distanze sulla scala nanometrica, in modo tale che queste distanze possano essere utilizzate per la costruzione di modelli strutturali di biomolecole. La prima verifica sperimentaleLa dipendenza della R - 6 dall'efficienza FRET è stata fatta da Stryer nel 1967 10 misurando poliproline di varie lunghezze come "righello spettroscopico". Un esperimento simile è stato raggiunto a livello monomolecolare nel 2005 11 . Le molecole di poliproline risultarono non ideali e quindi le molecole a DNA a doppio filamento sono state successivamente utilizzate 12 . Questo ha aperto la finestra per la misurazione precisa delle distanze e l'idea di utilizzare FRET per identificare le proprietà strutturali delle biomolecole.

FRET è ottimale quando la distanza di interdye è da ~ 0.6-1.3 R 0 , dove R 0 è la distanza di Förster. Per i fluorofori tipici utilizzati nei singoli esperimenti di FRET, R 0 è ~ 50 Å. Tipicamente, FRET offre molti vantaggi rispetto ad altri metodi nella sua capacità di risolvere e differenziare le strutture e le dinamicheI sistemi eterogenei: (i) A causa della massima sensibilità della fluorescenza, gli esperimenti FRET a singola molecola 13 , 14 , 15 , 16 possono risolvere complessi eterogene contando direttamente e caratterizzando simultaneamente le strutture dei singoli membri. (Ii) I percorsi complessi di reazione possono essere decifrati direttamente negli studi di FRET mono-molecolari perché non è necessaria alcuna sincronizzazione di un ensemble. (Iii) FRET può accedere a un'ampia gamma di domini temporali che durano più di 10 decenni nel tempo, coprendo un'ampia gamma di dinamica biologicamente rilevanti. Iv) Gli esperimenti FRET possono essere eseguiti in tutte le condizioni di soluzione, sia in vitro sia in vivo . La combinazione di FRET con microscopia a fluorescenza consente lo studio delle strutture molecolari e delle interazioni direttamente nelle cellule viventi 15 , 16 , Sup> 17 , 18 , 19 , anche con alta precisione 20 . (V) FRET può essere applicato a sistemi di quasi tutte le dimensioni ( ad es. Oligomeri poliprolina 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , reversi transcriptasi HIV 26 e ribosomi 27 ). Vi) Infine, una rete di distanze che contenga tutta la dimensionalità delle biomolecole potrebbe essere utilizzata per derivare modelli strutturali di molecole statiche o dinamiche 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref "> 35 , 36 , 37 .

Pertanto, la spettroscopia FRET a singola molecola può essere utilizzata per ottenere distanze sufficientemente precise da utilizzare per la modellazione strutturale a distanza 26 . Ciò è possibile sfruttando il rilevamento di fluorescenza multiparametri (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , che utilizza otto dimensioni di informazioni di fluorescenza ( es. Spettro di eccitazione, spettro di fluorescenza, anisotropia, durata della fluorescenza, Tempo macroscopico, intensità della fluorescenza e distanza tra i fluorofori) per fornire precisi e precisi ritratti di distanza. Inoltre, l'eccitazione interpolata pulsata (PIE) è combinata con MFD(PIE-MFD) 42 per monitorare la fluorescenza dell'accettore di eccitazione diretta e per selezionare eventi a singola molecola derivanti da campioni contenenti uno stoichiometria donatore da accettazione a 1: 1. Una tipica configurazione PIE-MFD utilizza laser a eccitazione interpolati a due pulsanti collegati ad un corpo microscopio confocale, dove il rilevamento fotonico è suddiviso in quattro canali diversi in diverse finestre spettrali e nelle caratteristiche di polarizzazione. Ulteriori dettagli possono essere trovati nella Figura 1 .

È importante notare che la FRET deve essere combinata con metodi computazionali per ottenere modelli strutturali simili a quelli atomici che sono coerenti con i risultati FRET 26 , 30 . Non è l'obiettivo del presente protocollo di superare la metodologia associata per costruire modelli strutturali con distanze derivate da FRET. Tuttavia, questi approcci sono stati applicati in combinazione con altre tecniche ( ad esempio, dispersione a raggi X a piccole angolazioni)O risonanza paramagnetica dell'elettrone), dando vita al campo della biologia strutturale integrativa 43 , 44 , 45 , 46 . L'obiettivo attuale è quello di aprire la strada a FRET come strumento quantitativo nella biologia strutturale. Ad esempio, questa metodologia è stata usata per identificare tre stati conformazionali nel dominio legante-legame (LBD) del recettore N-methyl-D-aspartato (NMDA). Il fine ultimo è quello di superare le limitazioni di cui sopra e di portare FRET tra i metodi integrativi utilizzati per la determinazione strutturale delle biomolecole fornendo distanze misurate con alta precisione.

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Protocollo

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1. Preparazione del buffer PBS e trattamento della camera

NOTA: Indossare un cappotto di laboratorio e guanti monouso durante l'esecuzione di esperimenti chimici bagnati. Utilizzare la protezione dell'occhio durante l'allineamento del laser.

  1. Preparazione del buffer PBS
    1. Sciogliere 4,5 g di Na 2 HPO 4 , 0,44 g di NaH2P04 e 3,5 g di NaCl in 400 ml di acqua distillata. Assicurarsi un pH di 7,5 e sterilizzare la soluzione autoclave su un ciclo liquido per 1 h (a seconda del sistema autoclave).
    2. Prendere 15 ml della soluzione PBS e mescolarlo con 0,1 g di carbone. Filtrare il mix utilizzando un filtro a siringa regolare da 20 ml con un diametro di 0,2 μm . Sigillare e memorizzare il buffer PBS a temperatura ambiente.
  2. Trattamento vetro vetro coperchio microscopio
    1. Aggiungere 500 μl di acqua distillata e 5 μL di tensioattivo non ionico polisorbato 20 (vedi elenco dei materiali)Ad un sistema di vetro a copertura (vedere l'elenco dei materiali) e mescolare bene. Lasciatela immergere per 30 min. Rimuovere la polisorbato 20 e lavare la camera con acqua distillata due volte. Lasciatelo asciugare.
      NOTA: la camera è pronta per l'uso.

2. Preparazione del campione del DNA

NOTA: Utilizzare i fili di DNA designati (vedere l'elenco dei materiali) per la creazione di campioni standard a doppio filamento (dsDNA). Gli oligini progettati non devono avere coloranti alla fine di un polimero al fine di evitare manufatti che possono compromettere la determinata distanza. La sequenza del DNA dovrebbe essere scelto per comportarsi come un corpo rigido.

  1. Aggiungere 1,5 μL di un filo di DNA etichettato con donatore e 4,5 μL di un DNA (omaggio con etichetta omologato o non etichettato) in un tubo microfugo e mescolarli con 24 μL di acqua priva di nucleasi.
    NOTA: a seconda del mix degli oligonucleotidi selezionati, verranno generati i seguenti campioni: no-FRET, loW-FRET o high-FRET dsDNAs.
  2. Ibridizzare il DNA utilizzando un miscelatore termico e il seguente processo: 95 ° C per 10 min, 90 ° C per 10 min, 80 ° C per 10 minuti, 70 ° C per 10 min, 60 ° C per 10 min, 50 ° C Per 10 minuti, 40 ° C per 10 minuti, 30 ° C per 10 minuti, 20 ° C per 10 minuti, 10 ° C per 10 minuti e tenere a 5 ° C.
    NOTA: Gli standard dsDNA generati possono essere conservati in un congelatore a -20 ° C per la conservazione a lungo termine o possono essere utilizzati immediatamente.

3. Preparazione del campione di proteine

Nota: partendo dal DNA ricombinante per l'espressione della proteina di interesse nei sistemi batterici, è possibile mutare i residui da cui le distanze devono essere misurate in cisteina. A tal fine, utilizzare le tecniche standard di mutagenesi del sito 47 . Per facilitare la purificazione proteica, clonare il DNA ricombinante e mutato in un vettore contenente un tag di purificazione ( ad esempio,Un His-tag). È stata utilizzata la dominanza legante del legame di glutammato 1 del glutammato (LBD) del recettore ionotropico del glutammato NMDA (GluN1) LBD ( ovvero NMDA GluN1 LBD clonato nel vettore pET-22b (+)).

  1. Espressione proteica
    1. Trasformare il plasmide DNA nel sistema di espressione della scelta 48 .
      NOTA: Le seguenti fasi presuppongono che l'espressione di una proteina solubile viene trasformata in Escherichia coli . È possibile anche la depurazione da, per esempio, le cellule di mammiferi transfettate 49 o le cellule insettiche 50 trasdurate, e le fasi dettagliate possono essere trovate altrove. Assicurarsi che il ceppo E. coli selezionato sia appropriato per la proteina di interesse. Ad esempio, l'espressione di proteine ​​che contengono ponti disolfuro richiede un ceppo di cellule competenti con un comparto intracellulare meno riducente (cfr. Elenco materiali).
    2. Inoculare un antipasto E. Coli usando una punta pipetta sterile per raccogliere una singola colonia trasformata 48 . Farlo cadere in 100 ml di mezzo LB selettivo (vedere l'elenco dei materiali) e permettere alla coltura di crescere per una notte a 37 ° C.
    3. Preparare il brodo LB (vedere l'elenco dei materiali). Autoclave per sterilizzare.
    4. Inoculare le colture su larga scala di E. coli trasformato aggiungendo la coltura overnight a 2 L di mezzo selettivo di LB ad un rapporto 1: 500.
    5. Nelle prossime ore, valutare la crescita della cultura monitorando le letture di assorbanza (ass.) Della coltura a 600 nm, talvolta definite come densità ottica a 600 nm (OD 600 ) o utilizzando un misuratore di densità di cella. Si noti che le letture aumentano nel tempo.
    6. Indurre l'espressione di proteine ​​con una concentrazione finale di 0,5 mM isopropil-β-d-1-tiogalattopiranoside (IPTG) quando la coltura raggiunge un OD 600 di 0,7. Scuotere E. coli indotto a 20 ° C per 20-24 h.
    7. Dopo l'induzione della proteina, pelletare l' E. coli ruotando per 20 minuti a 3.000 xg e 4 ° C. Scartare il surnatante e conservare il pellet E. coli contenente la proteina intracellulare a -80 ° C fino all'uso.
  2. Purificazione della proteina
    1. Lyse E. coli utilizzando un metodo di lisi di scelta ( ad es. Sonicazione, stampa francese, cavitazione azotata, ecc. ) 51 .
    2. Spin giù la membrana e detriti cellulari centrifugando il lisato per 1 h a 185.000 xg e 4 ° C.
    3. Per una proteina denominata His, caricare il surnatante su una colonna di cromatografia di affinità metallica immobilizzata con nichel, caricata con nichel (IMAC) utilizzando un sistema di cromatografia a liquido veloce della proteina (FPLC) (vedi tabella dei materiali ) 52 .
      NOTA: Tampone di equilibrazione per la NMDA GluN1 LBD: 200 mM NaCl, 20 mM Tris e 1 mM Glicina, pH 8. Tampone di eluizione per NMDA GluN1 LBD: 200 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM Glicina e 400 mM Imidazolo, pH 8.
      1. Lavare la colonna IMAC con tampone contenente una quantità ridotta (~ 12 mM) di imidazolo.
      2. Eluire la proteina dalla colonna IMAC utilizzando un gradiente lineare di imidazolo da 12 mM a 400 mM.
    4. Dializzare la proteina durante la notte nel tampone di equilibratura senza imidazolo 53, posizionando l'eluato dalla fase 3.2.3.2 in tubo di dialisi e sommerso nel tampone di equilibratura sotto agitazione continua per 2-3 ore. Ripeti almeno una volta ancora.
      NOTA: i passaggi 3.2.3-3.2.6 assumono la purificazione di una proteina contrassegnata da His. Se purificando con un altro metodo, regolare il protocollo in base a questo.
    5. Quantificare la quantità di proteine ​​assumendo l'assorbanza a 280 nm della proteina dializzata e utilizzando la legge di Beer ( unità di assorbanza = ε L c dove ε È il coefficiente di estinzione (M -1 cm -1), Che può essere ottenuto qui 54 ; L è la lunghezza del percorso luce (cm); E c è la concentrazione proteica (M)).
      NOTA: sono disponibili vari test di quantificazione della proteina, incluso il saggio di Bradford e il saggio dell'acido bicinchonico. Entrambi forniscono risultati accurati.
  3. Etichettatura della proteina
    1. Aggiungere i fluorofori di donatore (colorante cianico-verde reattivo maleimido) e acetofori (maleimide reattivo colorante rosso) alla proteina purificata con un rapporto molare donatore: accettabile da 1: 1: 8.
    2. Incubare la miscela proteica e fluoroforo su ghiaccio per 30 min. Più lunghi tempi di incubazione sono possibili.
    3. Imballare una colonna di agarosio di Ni-Nitrilotriacetici (Ni-NTA) da 0,5 mL (vedere l'elenco dei materiali) e equilibrarlo usando lo stesso tampone di equilibrazione come nel punto 3.2.3 mentre la proteina sta incubando.
      NOTA: mantenere la quantità di proteine ​​caricate secondo la resistenza alla resina.
    4. Dopo i 30 minutiCubatura, caricare la miscela proteina / fluoroforo sulla colonna preparata nel punto 3.3.3 e purificare mediante flusso di gravità.
    5. Lavare l'eccesso di fluoroforo con 5 mL di tampone di equilibrazione.
    6. Eluire la proteina etichettata per gravità dalla colonna quattro volte con 0,5 mi di tampone di eluizione. Poiché la proteina è già stata purificata da altre proteine, non è necessario alcun gradiente.
    7. Controllare ogni eluato con uno spettrometro UV-Vis per identificare quale frazione contiene la proteina etichettata. Esaminare l'assorbanza da 230-700 nm per essere in grado di assicurare che i picchi di assorbanza dalla proteina (280 nm) e da ciascun fluoroforo (493 nm per il fluoroforo verde-ciano e 651 nm per il fluoroforo lontano-rosso) siano visibili nella eluato.
      NOTA: In genere, la proteina eluirà nella frazione 2.
    8. Equilibrare una colonna di sblocco (vedere la tabella dei materiali ) con PBS trattato con il carbonio (punto 1.1).
    9. Caricare la proteina etichettata sulla colonna di disidratazione con il flusso di gravità.
      NOTA: mantenere la quantità di proteine ​​caricate in base alla capacità di colata selezionata 55 .
    10. Eluire usando 3.5 mL di PBS trattato con il carbone mediante il flusso di gravità e raccogliere 0,5 mL di frazioni dell'elua.
    11. Utilizzare uno spettrometro UV-Vis per analizzare l'assorbanza di ogni eluato da 230 a 700 nm per identificare quale frazione contiene proteine ​​etichettate.
      NOTA: i passaggi 3.3.8-3.3.11 servono essenzialmente come passaggio di buffer. Altri protocolli che servono a questo fine sono anche possibili ( ad esempio, una vasta dialisi). In alternativa, si potrebbe andare direttamente al passo 3.3.8 dal punto 3.3.2.

4. Misurazioni necessarie in condizioni di ensemble (in Cuvette)

  1. Determinazione della costante di Förster
    1. Scansione di F D , emissione di fluorescenza fluorofori (cps), in un fluorimetro eccitando il donatore a 15 nm alla sua lunghezza d'onda massima di assorbanza per ottenere la piena emSpettro di issione. Monitorare l'emissione che inizia a 5 nm dopo la lunghezza d'onda di eccitazione e che termina 150 nm più tardi. Usare condizioni di angolo magico impostando il polarizzatore di emissione a 54,7 ° E i polarizzatori di eccitazione a 0 ° 56 .
      NOTA: Per il fluoroforo donatore utilizzato qui, il massimo di Abs si verifica a 490 nm; 475 nm viene utilizzato come lunghezza d'onda di eccitazione e viene monitorata l'emissione da 480 a 650 nm. Per l'accettore, il valore massimo di Ass arriva a 645 nm; 630 nm viene utilizzato per la lunghezza d'onda di eccitazione e viene monitorata l'emissione da 635-735 nm.
    2. Usare il fluorimetro per eseguire una scansione di eccitazione del fluoroforo dell'acceptore (Abs A ) che va da 400 a 700 nm e usa condizioni di angolo magico impostando il polarizzatore di emissione a 54,7 ° E i polarizzatori di eccitazione a 0 ° 56 . Impostare il monochromatore di emissione a 15 nm dopo la lunghezza d'onda di emissione massima. Normalizzare fino al massimo EXCTazione.
    3. Nelle tabelle pubblicate, individuare il coefficiente di estinzione dell'acceptore, ε A (M -1 cm -1 ) 56 , o utilizzare i valori forniti dal produttore.
      NOTA: Il valore pubblicato per il fluoroforo dell'accettore utilizzato in questo manoscritto è ε A647 = 270.000 cm -1 M -1 56 .
    4. Calcolare la sovrapposizione spettrale utilizzando J = Σf D · (Abs A · ε A ) · λ 4 , dove f D , Abs A e ε A sono stati definiti sopra λ ed è la lunghezza d'onda (nm). Utilizzare un foglio di lavoro per elencare in colonne tutti i valori dipendenti dalla lunghezza d'onda ottenuti nei passaggi 4.1.1-4.1.3. Allineali in base alla lunghezza d'onda. Eseguire la somma dalla lunghezza d'onda minima dell'emissione dei donatori (λ min ) alla lunghezza d'onda massima dell'assorbitore dell'acceptoreE (λ max ).
    5. Calcolare la costante di Förster (R o ) utilizzando la seguente formula R o 6 = 8,79 x 10 -5 · J · κ 2 · Φ F, D · n -4 , dove J è la sovrapposizione spettrale calcolata in precedenza nella fase 4.1.4, Κ 2 È il fattore di orientamento, Φ F, D È la resa quantistica fluorescente del fluoroforo donatore, e n è l'indice di rifrazione del mezzo in cui si trova il fluoroforo.
      NOTA: Utilizzare n = 1.33 (se si utilizza tampone acquoso) e κ 2 = 2/3.
    6. Individuare il valore di resa quantistica del fluoroforo donatore (Φ F, D , Ambiente dipendente) dalle tabelle pubblicate (cfr. Il riferimento 57) e utilizzare il valore della sovrapposizione spettrale ottenuta nel passaggio 4.1.4 per calcolare il valore finale della costante di Förster utilizzando l'equazioneDal punto 4.1.5.
      NOTA: se la resa quantistica non è disponibile, seguire la fase 4.2, di seguito, per calcolarlo. In questo caso, utilizzare Φ F, D = 0,8, che corrisponde a una durata del donatore τ D, r = 4,0 ns.
  2. Determinazione della resa quantistica di fluorescenza
    NOTA: La seguente procedura presuppone solo la vibrazione dinamica. Per considerare lo spegnimento statico, fare riferimento al riferimento 56. Tuttavia, gli esperimenti PIE-MFD sono utili anche per determinare la resa quantistica, anche in caso di spegnimento statico (vedere i risultati).
    1. Selezionare un fluoroforo di riferimento con analoghi profili di assorbanza e di emissione sia per gli acquirenti che per i fluorofori donatori per i quali è stata determinata la resa quantica (Φr).
      NOTA: Per il donatore, Φ r = 0,8 e τ r = 4 ns, mentre per l'accettore Φ r = 0,32 e τ r = 1,17 ns, wChe corrispondono agli Φ r e τ r per gli oligonucleotidi del fluoroforo ciano-verde e agli ultrafini fluorofori, rispettivamente 57 .
    2. Misurare il decadimento di fluorescenza risolto in tempo (f (t)) utilizzando il metodo di conteggio a tempo singolo-fotonico (TCSPC) a condizioni magiche.
    3. Adattare il decadimento di fluorescenza con una funzione di decadimento mono o multi-esponenziale sotto forma di f (t) = Σ i x i e t / τ i , dove x i È la frazione di popolazione e τ i È la durata della fluorescenza delle popolazioni.
    4. Calcolare la durata media delle specie, <τ> x = Σx i τ i , Dove x i È la frazione di popolazione e τ i È la durata della fluorescenza della popolazione.
    5. Usare thE formula Φ F, D = <τ D > x * Φ r / τ r Per calcolare la resa quantistica di fluorescenza del fluoroforo donatore collegando la durata della fluorescenza e la resa quantica del riferimento, così come la durata della fluorescenza del fluoroforo donatore.
      NOTA: Questo metodo assume una tensione dinamica. Per altre determinazioni di Φ F, D , seguire Lakowicz 56 .

5. Allineamento dell'esperimento per la rilevazione a singola molecola PIE-MFD (SMD)

NOTA: è meglio spegnere le luci durante le misurazioni.

  1. Regolazione dell'apparecchiatura (Figura 1)
    NOTA: per questo esperimento viene utilizzata una configurazione MFD di casa raffigurata in figura 1 , con due laser pulsati e 4 canali di rilevazione in un corpo microscopio invertito. Esistono sistemi commerciali simili.
    1. Accendere i laser a 485 nm e 640 nm e tutti i rilevatori della configurazione MFD. Aprire il software che controlla l'acquisizione TCSPC ei laser. Assicurarsi che la frequenza di ripetizione del laser sia di 40 MHz.
    2. Impostare il potere del laser a impulsi a 485 nm a 60 μW a un piano di immagine dell'obiettivo di immersione in acqua 60X 1.2 NA e la potenza laser a impulsi a 640 nm a 23 μW in modalità di eccitazione interpolata pulsata (PIE-MFD) 42 .
      NOTA: Per impostare PIE-MFD, i due impulsi laser vengono ritardati nel software del controller laser. Per l'eccitazione laser a 485 nm, i canali TCSPC rilevanti (canali TAC) sono 1-12,499 (canale "prompt"). Per l'eccitazione laser a 640 nm, i canali TCSPC rilevanti (canali TAC) sono 12.499-50.000 (canale "ritardo").
    3. Aggiungere un liquido di immersione obiettivo (una goccia di acqua doppia distillazione) tra l'obiettivo obiettivo del microscopio e uno scivolo in vetro di copertura. Per garantire che il piano di immagine sia all'interno della soluzione e lontano dalla superficie del vetro, Ruotare la manopola di regolazione una e mezza dopo aver trovato il secondo punto focale luminoso dovuto alla riflessione dei laser all'interfaccia vetro-liquido.
    4. Aggiungere 1 μL di 100 nM Rhodamine 110 a 50 μL di acqua distillata al centro del vetro di copertura. Assicurarsi che la soluzione sia anche al centro dell'obiettivo del microscopio.
    5. Regolare le posizioni del foro (dimensioni: 70 μm) (direzione xe y una alla volta), monitorando la velocità di conteggio fotone sul software di acquisizione per massimizzare il numero di fotoni rilevati.
  2. Misura standard SMD (lavoro in camera oscura)
    1. Utilizzare il campione dal punto 5.1.4 e registrare 120 s della velocità di conteggio facendo clic sul pulsante "Avvio" nel pannello di controllo Time-resolved (TTTR) in formato "* .ht3" sul software di acquisizione.
    2. Calcola la spettroscopia di correlazione a fluorescenza offline (FCS) 59 , </ Sup> 60 , 61 ( cioè misura FCS) per determinare l'ora caratteristica della diffusione, il numero di molecole nel volume confocale, la cinetica del tripletto e la luminosità molecolare 62 .
      1. Aprire il software per FCS (Kristine, suite MFD). Seleziona le impostazioni sperimentali facendo clic su "Opzioni" -> "Seleziona Imposta". Selezionare un file con impostazioni sperimentali simili e fare clic su "ottenere parametri da file" per leggere le informazioni di intestazione del file.
      2. Selezionare "Operare" -> "Correlate" per eseguire FCS.
        NOTA: Assicurarsi che i numeri dei canali siano correttamente specificati e che la "porta TAC" (canali TCSPC) sia selezionata per selezionare in modo appropriato i canali di richiesta o di ritardo.
      3. Selezionare "Operate" -> "Global Fit of Correlation Curves" per aprire la routine di adattamento. Usa "equazione # 24" sul softwarE e fare clic su "avviare".
        NOTA: L'equazione n. 24 del software descrive la funzione di autocorrelazione ( G c ) delle molecole fluorescenti liberamente diffuse su un profilo di illuminazione tridimensionale Gaussian come 61 :
        figure-protocol-1
        Dove N è il numero medio di molecole nel volume di rilevamento, x T è la frazione di molecole che esercitano la cinetica del tripletto con il tempo caratteristico t T , t c , è il tempo di correlazione, t diff è il tempo di diffusione relativo alla geometria Il parametro ω e ω descrive il profilo di illuminazione gaussiana. Dopo la misura, prendere nota del tempo di diffusione e del numero di molecole nel volume confocale.
    3. Aggiungere 10 μL di 100 nM Rhodamine 101 in 50 μL di distillazioneAcqua e mescolare bene. Mettere questo mix sulla parte superiore del vetro di copertura e assicurarsi che la gocciolina sia al centro dell'obiettivo. Fare clic sul pulsante "start" sul pannello di controllo TTTR per registrare 120 s di dati in formato TTTR.
    4. Aggiungere 1 μl di fluoroforo da 100 nM di largo rosso in 50 μl di acqua distillata e mescolare bene. Mettere questo mix al centro dell'obiettivo. Fare clic sul pulsante "Start" e registrare 120 s di dati in formato TTTR.
    5. Posizionare 50 μl di acqua distillata al centro dell'obiettivo. Fare clic sul pulsante "Start" e registrare 300 s di dati in formato TTTR.
    6. Posizionare 50 μl di buffer PBS al centro dell'obiettivo. Fare clic sul pulsante "Start" e registrare 300 s di dati in formato TTTR.
    7. Prendere 1 μl di miscela dal punto 5.1.4 e mescolare con 50 μL di acqua distillata. Mettere questo mix sul vetro di copertura. Innanzitutto, fare clic sul pulsante "Start" e raccogliere 10 s di dati in modalità TTTR. Quindi, analizza il TTTR utilizzando il software di analisi Burst Integration Fluorescence Lifetime (BIFL) (Parigi, suite MFD), come descritto nel punto 5.3.
      NOTA: Verificare il numero di esplosioni al secondo dalla selezione e dal software di analisi 26 , 61 . Se il livello di scoppio è di circa 35 ogni 10 s, è appropriato per la misurazione a singola molecola.
    8. Continuare a registrare la velocità di conteggio in formato TTTR per 1,5 h ( cioè TCSPC a SMD) per trattare come standard di misurazione a singola molecola.
      NOTA: a causa della grande dimensione del file, dividere i file "* .ht3" grezzi in file di dimensioni ridotte per caricare e elaborare utilizzando BIFL.
  3. Analisi di campioni standard utilizzando BIFL
    1. Aprire il software BIFL (Parigi).
    2. Selezionare l'impostazione per PIE nella finestra di conferma automatica "conferma configurazione" e leggere l'intestazione selezionando il file con impostazioni sperimentali simili. Fai clic su "ottenere i parametri"M file ". Fare clic su" OK ". Si noti che la finestra popup si chiude ed è integrata nel front-end di Parigi. Fare clic su" OK "sotto" Avanti ".
    3. Scegli i file da analizzare cliccando su "Seleziona" su "Array di percorso dati" per selezionare la misura da analizzare.
      1. Fare clic su "Green scatter" (per una misurazione dell'acqua), "Green BG" (per una misurazione del buffer), "Spessore verde" (per una misurazione 2 nM Rhodamine 110), "Scatter red" (per una misurazione dell'acqua) Red BG "(per una misurazione del buffer o dell'acqua)," Spessore Rosso "(per una misura di 20 nm di Rhodamine 101)," Scatter Yellow "(per una misurazione dell'acqua)," Yellow BG "(per una misurazione del buffer) "Giallo spessore" (per una misurazione del fluoroforo da 2 nm di largo rosso).
      2. Fai clic su "OK" sotto "Avanti".
        NOTA: Il canale "verde" corrisponde al segnale dei rivelatori verdi nei canali TCSPC "prompt". Il4; Rosso "corrisponde al segnale dei rivelatori rossi nei canali TCSCP" prompt "Il canale" Giallo "corrisponde al segnale dei rivelatori rossi nei canali ritardati TCSPC.
    4. Fai clic su "Regola" accanto a "Data cut Burstwise" per regolare i parametri di selezione a singola molecola. Nella nuova finestra popup, selezionare eventi a singolo molecola con due deviazioni standard dall'ora di arrivo dell'interphoto medio ("dt") modificando l'intervallo di arrivo in "Threshold" e il numero minimo di fotoni per singolo evento molecolare sotto "min #. " Fai clic su "Ritorna" per chiudere la finestra pop-up. Fai clic su "OK" sotto "Avanti".
      NOTA: La soglia, in unità ms, dipende dalla velocità di conteggio di sfondo. Il numero minimo di fotoni utilizzati è 60.
    5. Regolare la durata della fluorescenza iniziale "Parametri di adattamento del colore" ( ad esempio , da, a e convoluzione) per il generatoreD i parametri di decadimento di fluorescenza sui colori "Verde", "Rosso" e "Giallo". Nella stessa finestra, aggiustare i valori "da" e "a" per "Prompt" e "Delay". Fai clic su "Ritorna" per chiudere la finestra pop-up. Fai clic su "OK" sotto "Avanti".
      NOTA: Assicurarsi che sia selezionata la casella di controllo di eccitazione a due colori. "Da" e "a" corrispondono ai contenitori iniziali e finali sull'istogramma di decadimento di fluorescenza (numero del canale TAC). Se i parametri di adattamento iniziale sono selezionati correttamente, viene aggiunta una funzione di adattamento ai decadimenti della fluorescenza su ciascun canale.
    6. Selezionare la posizione sul disco rigido a cui salvare tutti i file ascii trattati in una cartella principale.
      NOTA: Parigi elabora tutti i burst selezionati e crea più file di output ASCII che non possono essere utilizzati da altri programmi per la visualizzazione ( ad es., Suite Margarita MFD).

6. standard dsDNA e misurazione campioneurements

  1. Aggiungere 500 μl di tampone PBS a un vetro di copertura a camera e mettere una goccia di acqua distillata tra la camera e la lente obiettivo. Fare clic sul pulsante "Start" sul pedale di controllo e raccogliere 5 minuti di dati in modalità TTTR da utilizzare per l'analisi.
  2. Prendere una piccola quantità (di solito circa 0,1 μL, concentrazione di circa 1 μM) di standard dsDNA, aggiungerla al tampone PBS e mescolare bene. In primo luogo, raccogliere 10 s di dati facendo clic su "Avvio". Quindi, controllare l'esplosione per ottenere 35 bursts per 10 s (come nei passaggi 5.2.7 e 5.3). Infine, raccogliere> 2 h di dati in formato TTTR, come sopra descritto.
  3. Analizzare i dati raccolti per i campioni dsDNA, come nel punto 5.3.3.
  4. Visualizzare gli istogrammi burst utilizzando la suite MFD (Margarita) e visualizzare l'efficienza FRET rispetto a <τ D (A) > f o F D / F A rispetto a <τ D (A) > f .
    1. Aprire tHe Margarita software e selezionare "File" -> "Importa tutti i file *. ?? 4 e * .mti". Selezionare la cartella principale contenente diverse sottocartelle.
    2. Selezionare i parametri da visualizzare facendo clic accanto alla "X" (ascissa) di uno dei parametri derivati ​​da Parigi ( ad esempio, tau verde o <τ D (A) > f ); Allo stesso modo, ripetere questa operazione per l'ordinata "Y" per selezionare il parametro desiderato da visualizzare ( ad esempio, efficienza FRET, F D / F A o S PIE PIE).
      NOTA: In questo caso, l'efficienza FRET, F D / F A o S PIE corretto per una corretta conteggio di sfondo nei canali verde, rosso e giallo; Per le rese quantiche del donatore e dell'acceptore; Per il rapporto di efficienza di rilevazione (g G / gR); E per la crosstalk (α). Qui, g G / g R = 3.7 e α = 0.017, a seconda solo dello strumento. Conteggio dei contatti di sfondoDipendono dal buffer utilizzato e sono determinati in precedenza i valori di resa quantistica.
    3. Aggiungere una linea FRET aprendo la finestra "Equazione di sovrapposizione" facendo clic su "Visualizza" -> "Equazione di sovrapposizione". Selezionare la linea FRET statica dal menu a comparsa. Selezionare le giuste durate del donatore e i parametri di rendimento quantico per generare la linea FRET corretta.
      NOTA: È possibile generare linee FRET per correlare vari indicatori FRET.
  5. Determinare il fattore di correzione per l'eccitazione dell'acceptore mediante la sorgente di eccitazione del donatore (β) usando il parametro stoichiometrico mostrando l'efficienza FRET rispetto alla stechiometria (S PIE ) in Margarita (equazione 1, sotto).
    NOTA: β è scelto in modo tale che il campione del donatore abbia un picco a S PIE = 1,0 nella scala di stechiometria; Il campione dell'acceptor-only dovrebbe avere una stechiometria di S PIE = 0.0 e la dsDNA con entrambe le etichette dovrebbe avere una stechiometria di S PIE ~ 0.5.NOTA: lo strumento è pronto e è possibile misurare campioni con FRET.
  6. Misurare e analizzare i campioni FRET etichettati preparati nella sezione 3 seguendo le fasi 6.3-6.4.

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Risultati

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Negli esperimenti tipici smFRET che utilizzano una configurazione MFD (linee laser: 485 nm a 60 μW e 640 nm a 23 μW, sezione 5.1), il campione di fluorescenza viene diluito a una concentrazione picomolare bassa ( 10-12 M = 1 pM) In un microscopio confocale, dove un impulso laser sub-nanosecondo eccita molecole etichette che diffondono liberamente attraverso un volume di eccitazione. Un volume confocale tipico è <4 femtolitri (fL). A tali basse concentrazioni, solo una singo...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo lavoro viene presentato il protocollo per allineare, calibrare e misurare le distanze interdite con alta precisione usando esperimenti FRET di una molecola PIE-MFD. Calibrando attentamente tutti i parametri strumentali, è possibile aumentare l'accuratezza delle distanze misurate e raggiungere l'accuratezza di Angstrom. A tal fine vengono utilizzati diversi istogrammi multidimensionali per analizzare e identificare le popolazioni per ulteriori caratterizzazioni. Utilizzando il tempo medio di macro per v...

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Dichiarazioni

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Tutti gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti con i contenuti di questo articolo.

Ringraziamenti

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VJ e HS riconoscono il supporto da NIH R01 GM094246 a VJ. HS riconosce fondi di start-up dal Clemson University Creative Inquiry Program e dal Centro per le Tecnologie di Scienza e Tecnologia dei Materiali Ottici presso l'Università Clemson. Questo progetto è stato inoltre sostenuto da una borsa di studio del Centro Keck per l'addestramento di bioscienza interdisciplinare dei Consorzi della Costa del Golfo (NIGMS Grant No. 1 T32GM089657-05) e dello Schissler Foundation Fellowship for Translational Studies di comuni malattie umane a DD. Il contenuto è esclusivamente responsabile degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Salute.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
carboneMerck KGaAK42964486 320
filtro per siringaFisherbrand09-719Cdimensioni: 0,20 µ vetro
di copertura a cameram Fisher Scientific 1554091,5 vetro borosilicato, 8 pozzetti vetro
di copertura per microscopioFisher Scientific063014-9dimensioni: 24 x 60-1,5
acqua priva di nucleasiFisher Scientific Fisher Scientific148859senza nucleasi
tween-20Thermo Scientific28320soluzione al 10% di polisorbato 20
filamento di DNA accettore ( High FRET)Integrated DNA Technologies1781248955´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
accettore DNA filamento (Low FRET)DNA Technologies1779564245´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
filamento di DNA donatoreintegrato DNA Technologies1779514375´ -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)
filamento di DNA (No FRET)Integrated DNA Technologies5´ -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
termociclatoreEppendorfE6331000025nexus gradient
Alexa Fluor 488 C5  MaleimideThermo ScientificA10254chiamato fluoroforo verde ciano nel manoscritto
Alexa Fluor 647 C2  MaleimideThermo ScientificA20347chiamato fluoroforo rosso lontano nel manoscritto
Rodamina 110Sigma-Aldrich83695-250MG
Rodamina 101Sigma-Aldrich83694-500MG
LB Brodo, MillerFisher ScientificBP1426Per la coltura di E. coli
AmpicillinaSigma-AldrichA0166Usato a 100 & micro; g/mL concentrazione finale in terreno LB selettivo per mantenere la selezione plasmidica
Tetraciclina Calbiochem58346Usato a 12,5 & micro; g/mL concentrazione finale in terreno LB selettivo per mantenere la mutazione gor (flutatione reduttasi) nei ceppi Origami B(DE3) per facilitare l'ossidazione del legame disolfuro
KanamicinaFisher ScientificBP906-5Utilizzato a 15 &; g/mL concentrazione finale in terreno LB selettivo per mantenere la mutazione trxB (rioredossina reduttasi) nelle colorazioni B(DE3) per facilitare l'ossidazione del legame disolfuro
Origami B(DE3) Cellule competentiMillipore70837-3Cellule E. coli competenti per l'espressione di proteine con ponti disolfuro
Isopropil-beta;-D-tiogalattopiranoside (IPTG)Fisher ScientificBP1755Per l'induzione dell'espressione proteica E. coli
Chelating HiTrap HPGE Life Sciences17-0409-01Per la purificazione FPLC su larga scala della proteina Hi-taged
ImidazoleSigma-Aldrich56749
Ni-NTA AgarosioQiagen30210
PD-10 Colonna di desalinizzazioneGE Life Sciences17-0851-01
AktaPurifierGE Life Sciences28406264Strumento FPLC
Tubi per dialisiSpectrum labs13256215 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 metri/rotolo
DicroicsSemrockFF500/646-Di01-25x36500/646 BrightLight
50/50 Polarizzatore divisore di fascioQioptiq LinosG33 5743 000Polarizzatore di film 10 x 10
Filtro passaverdeChromaET525/50mET525/50m Attacco 25 mm di diametro
Filtro passa rossoChromaET720/150mET720/150m Misuratore
di potenza Misuratore di potenzaThorLabdPM200
Spettrofotometro UV-VisVarianCary300Bio
Fluorolog 3HoribaFL3-22-R3
Fluorohub TCSPC controllerHoribaFluorohub-BTCSPC elettronica per misure d'insieme
NanoLed 485LHoriba485LLaser a diodi blu
NanoLed 635LHoriba635LLaser a diodi rossi
Olympus IX73 MicroscopioOlympusIX73P2FTelaio per microscopio
PMA 40 Hybrid DetectorPicoQuant GmbH932200, PMA 40Ottimizzato per il rilevamento del verde
Rivelatore ibrido PMA 50PicoQuant GmbH932201, PMA 50Ottimizzato per la sensibilità del cambio ed
a 485 nmPicoQuant GmbHLDH-D-C-485
640 nmPicoQuant GmbHLDH-D-C-640
Hydraharp 400 e software di acquisizione TTTRPicoQuant930021Timer per eventi a picosecondi e unità di formazione a singolo fotone correlato nel tempo, include il software di acquisizione TTTR
SEPIA II SLM 828 e il software SEPIADriver laser PicoQuant910028per impulsi a picosecondi, include il controller software SEPIA.
computerDelloptiplex 7010cpu: i7-3770 ram: 16GB
FRET Positioning and Screening (FPS) softwareHeinrich Heine UnviersityInclude il clacualtor Accesibel Volume disponibile presso http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html
suite MFDHeinrich Heine UnviersityInclude il pacchetto software BIFL Paris; Margarita per la visualizzazione degli isotram multiparametrici e software di analisi della distribuzione di probabilità disponibili a http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html
Integrated Laser Laser a

Riferimenti

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