I neuroni uditivi uditivi degli aviani e dei mammiferi sono specializzati per la codifica neuronale veloce, un processo fondamentale per le normali funzioni uditive. Questi neuroni nascono da precursori distinti dell'indietro embrionale. Presentiamo tecniche che utilizzano elettroporazione per esprimere i geni nell'hindbrain degli embrioni di pollo per studiare la funzione genica durante lo sviluppo uditivo.
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Articolo metodologico
In Ovo Electroporation nel Brainstem Auditory del pollo
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'elettroporazione è un metodo che introduce geni di interesse in organismi biologicamente rilevanti come l'embrione di pollo. È da tempo stabilito che l'embrione di pollo è un modello di ricerca efficace per studiare le funzioni biologiche di base dello sviluppo del sistema uditivo. Più di recente, l'embrione di pollo è diventato particolarmente prezioso nello studio dell'espressione genica, della regolazione e della funzione associata all'udito. L' elettroporazione in ovo può essere impiegata per individuare le regioni del sistema cerebrale uditivo responsabili di funzioni uditive altamente specializzate. Queste regioni includono il nucleo di pollo magnocellularis (NM) e nucleo laminaris (NL). Neuroni NM e NL derivano da precursori distinti di rombomeri 5 e 6 (R5 / R6). Qui, presentiamo l'elettroporazione in ovo in geni codificati da plasmidi per studiare proprietà correlate al gene in queste regioni. Mostriamo un metodo per il controllo spaziale e temporale dell'espressione genica che favorisce il guadagno o la perdita di fenotipo funzionalees. Targetando regioni di progenitor neurali uditive associate a R5 / R6, mostriamo la transfezione plasmida in NM e NL. La regolazione temporale dell'espressione genica può essere ottenuta adottando un sistema vettoriale tet-on. Si tratta di una procedura indotta da droga che esprime i geni di interesse in presenza di doxiciclina (Dox). La tecnica di elettroporazione in ovo , insieme con i test funzionali biochimici, farmacologici e in vivo , fornisce un approccio innovativo per lo studio dello sviluppo del neurone uditivo e dei fenomeni patofisiologici associati.
Introduzione
La codifica neurale veloce del suono è essenziale per le normali funzioni uditive. Queste includono abilità di localizzazione sonora 1 , discorso in discriminazione di rumore 2 e comprensione di altri segnali di comunicazione rilevati dal comportamento 3 . I neuroni analoghi situati nel sistema cerebrale uditivo sia degli aviani che dei mammiferi sono altamente specializzati per la codifica neuronale veloce 4 . Questi includono il nucleo di pollo magnocellularis (NM), il nucleo laminaris (NL) ei loro analoghi dei mammiferi, il nucleo cocleare anteroventrale (AVCN) e l'....
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Protocollo
Tutte le procedure sono state approvate dai comitati di istruzione e tutela degli animali istituzionali dell'Università Northwestern e sono stati eseguiti in conformità alle istruzioni nazionali di istruzione per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Gestione dell'uovo
- Acquistate uova fecondate da un venditore locale. Conservare le uova a 13 ° C in frigorifero per non più di 5 giorni prima dell'incubazione. La vitalità dell'embrione diminuisce significativamente dopo una settimana.
- Girare ogni uovo con il 70% di etanolo prima di impostare nell'incubatrice.
- Impostare 1-2 doz....
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Risultati
Qui mostriamo che l'elettroporazione in ovo consente l'espressione genica in un sistema biologico normalmente sviluppato. I geni codificati con plasmide vengono iniettati focalamente nel tubo neurale sovrastante R5 / R6. Un esempio schematico delle posizioni dell'elettrodo e delle pipette relative a importanti marcatori anatomici è mostrato nella figura 1A . La posizione corretta dell'iniezione del plasmide è confermata 24 h dopo l'elettropor.......
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Discussione
L' elettroporazione in ovo è un metodo per esprimere o abbattere i geni di interesse per analizzare la funzione genica in vivo 8 , 9 . Nell'embrione di pollo, è un metodo innovativo per esprimere geni codificati da plasmide in diverse regioni del sistema cerebrale uditivo 8 . Per garantire un'espressione ottimale, sono necessari diversi passaggi critici. In primo luogo, solo iniettare gli embrioni le.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo i dottori. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria e la signora Ximena Optiz-Araya per l'assistenza iniziale con il set-up del protocollo e per la fornitura di plasmidi. Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione NIH / NIDCD DC013841 (JTS).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Uova di gallina livornese bianca fecondate | Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI) | ||
| Picospritzer | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III, stimolatore di corrente/tensione a canale singolo o doppio |
| Grass | Technologies | SD9 | SD9 |
| Aghi per siringa Microfil | World Precision Instruments | MF28G67-5 | calibro 28, lunghezza 67 mm, (confezione da 5) |
| Portaelettrodo | Warner Instruments | 64-1280 | MP Serie: Pressione non elettrica Applicazioni |
| Microelettrodo stimolante | FHC | PBSA1075 | PBSA1075 |
| Serbatoio/regolatore d'aria | NU Servizi | Asciugatura all'aria 300 CF | |
| Verde veloce | Sigma Aldrich | F7258-25G | F7258-25G |
| Nastro di plastica trasparente | Scotch | 191 | |
| Doxiciclina iclilato | Sigma Aldrich | D9891-1G | |
| Frigorifero per uova | Vissani Frigorifero | 13,3 - 16,1 gradi; C (56-61° F) | |
| Incubatrice | Hova-Bator | 38 gradi C (100 ° F), ~50% di umidità | |
| Oscilloscopio di dissezione | Zeiss | 4.35E+15 | SteREO Discovery, microscopio V8, 50.4X |
| Sorgente di luce fredda | Zeiss | 4.36E+15 | CL6000 |
| Micromanipolatori | LED Narishige Giappone | Modello: MM-3 | 2 Micromanipolatori |
| Tubi capillari | Strumento Sutter | BF150-86-10 | Borosilicato a pareti spesse (dimensioni) |
| Siringhe | da 1 mL, aghi da 3 mL | ||
| BD | Precision Glide | 27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2 | |
| Pinze | Stoelting | No. 5 Super Fine Dumont | |
| Porta uova | Su misura | Anche la base in argilla funziona altrettanto bene | |
| Estrattore per micropipette | Strumento Sutter Modello | P-97 | |
| Filtro per siringa | Ultra Cruz | sc-358811 | PVDF 0,22 μ m |
Riferimenti
- Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. Mechanisms of sound localization in mammals. Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).
- Anderson, S., et al. Neural timing is linked to speech perception in noise. J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).
- Shannon, R. V., et al.
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Ristampe e permessi
