Articolo metodologico

Luce Scheda a base di microscopia a fluorescenza di vita o fissate e colorate Tribolium castaneum embrioni

DOI:

10.3791/55629

⸱

28 aprile 2017

 ,  , 
1Physical Biology, Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), 2Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes, 3Goethe-Universität Frankfurt am Main – Campus Riedberg

In questo articolo

Sommario

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Imaging della morfogenesi di embrioni insetto con luce microscopio a fluorescenza foglio basata è diventato stato dell'arte. Questo protocollo descrive e confronta tre tecniche di montaggio appropriate per gli embrioni Tribolium castaneum, presenta due linee transgeniche misura romanzo ben adatto per l'imaging in tempo reale, discute controlli di qualità essenziali e indichi limitazioni dell'esperimento corrente.

Abstract

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La farina di rosso coleottero Tribolium castaneum è diventato un importante organismo modello di insetti in genetica dello sviluppo e biologia evolutiva dello sviluppo. L'osservazione di embrioni Tribolium con luce microscopio a fluorescenza foglio a base ha molteplici vantaggi rispetto widefield convenzionale e microscopia a fluorescenza confocale. A causa delle proprietà uniche di un microscopio foglio a base di luce, immagini tridimensionali di campioni viventi possono essere registrati con elevati rapporti segnale-rumore e significativamente ridotto fotometabolismo nonché fototossicità lungo più direzioni per periodi che durano vari giorni. Con più di quattro anni di sviluppo metodologico e un continuo aumento dei dati, il tempo sembra opportuno stabilire procedure operative standard per l'uso della tecnologia foglio di luce nella comunità Tribolium così come nella comunità degli insetti in generale. Questo protocollo descrive tre tecniche di montaggio adatto fo diversi scopi, presenta due nuove linee transgeniche Tribolium misura appropriata per l'imaging in tempo reale a lungo termine, suggerisce cinque coloranti fluorescenti di etichettare strutture intracellulari di embrioni fissi e fornisce informazioni post-elaborazione dei dati per la valutazione puntuale dei dati registrati. Risultati rappresentativi concentrano su immagini dal vivo a lungo termine, sezionamento ottico e l'osservazione dello stesso embrione lungo molteplici direzioni. Rispettivi set di dati sono forniti come una risorsa scaricabile. Infine, il protocollo discute controlli di qualità per saggi di imaging vivi, attuali limitazioni e l'applicabilità delle procedure descritte ad altre specie di insetti.

Questo protocollo è destinato principalmente per i biologi dello sviluppo che cercano soluzioni per l'imaging che superano attrezzature di laboratorio standard. Promuove il continuo tentativo di colmare il divario tra i tecnicamente orientati laboratori / comunità, che si sviluppano e perfezionare microscopiare metodologicamente, ed i laboratori di scienze della vita / comunità, che richiedono soluzioni 'plug-and-play' a sfide tecniche. Inoltre, supporta un approccio assiomatico che muove le questioni biologiche al centro di attenzione.

Introduzione

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Il rosso di farina coleottero Tribolium castaneum, che appartiene alla grande famiglia dei coleotteri Darkling (Tenebrionidae), ha una lunga storia all'interno delle scienze agricole e la vita ed è il modello modello di insetto organismo secondo miglior studiata dopo la mosca della frutta Drosophila melanogaster. Nel corso degli ultimi quattro decenni, è diventato un potente e popolare organismo modello di insetti in genetica dello sviluppo, nella biologia evolutiva dello sviluppo e, nel corso degli ultimi venti anni, nella morfogenesi embrionale per una serie di motivi:

Drosophila e Tribolium entrambi appartengono alla Holometabola, ma divergevano circa 300 milioni di anni fa 1, 2, 3, 4. Mentre lo sviluppo embrionale di Drosophila è comunemente considerato come altamente derivato, Tribolium mostra una modalità più ancestrale di sviluppo che si trova in una proporzione considerevolmente più grande di specie di insetti 5, 6, 7, 8, 9. In primo luogo, Tribolium presenta sviluppo testa non involuta, cioè le sue boccale e antenne emergono già durante l'embriogenesi 10, 11, 12, 13, 14, 15. In secondo luogo, Tribolium segue i principi di sviluppo corto germe, cioè segmenti addominali vengono aggiunti in sequenza da una zona di crescita posteriore durante germband allungamento 16, 17, 18, 19. In terzo luogo, Tribolium sviluppa e degrada successivedue membrane extra-embrionali cioè l'amnion, che copre l'embrione unico ventrale, e sierose, che avvolge completamente l'embrione 20, 21, 22. Entrambe le membrane giocano un morfogenetica fondamentale 23 nonché ruolo protettivo contro i microrganismi 24, 25 e 26 essiccazione. In quarto luogo, le gambe embrione di sviluppo sono completamente funzionali durante la fase di vita larvale e servono come primordi per le gambe adulti durante la metamorfosi pupa 27, 28, 29, 30, 31.

A causa delle loro dimensioni e modeste esigenze di piccole dimensioni, la coltivazione del Tribolium in laboratorio è abbastanza semplice. Le colture di wild-type (WT) ceppi o linee transgeniche consistono tipicamente di circa 100-300 adulti e può essere mantenuto entro bottiglie da un litro in vetro (impronta 80 cm 2) riempito tre quattro centimetri alta (circa 50 g) con terreno di coltura costituito da frumento pieno fiore farina integrato con lievito secco attivo. Una fornitura di acqua non è necessaria. Questo permette anche piccoli laboratori di mantenere decine di culture beetle all'interno incubatori insetti disponibili commercialmente piccole o medie dimensioni. Successive fasi di sviluppo di larve Tribolium (dopo circa il quarto instar, pupe e adulti) sono facilmente separati dal mezzo di crescita mediante setacciatura. embrioni sincronizzati sono ottenuti incubando adulti per brevi periodi a medio deposizione delle uova. Per un rapido sviluppo, culture coleotteri sono mantenuti a 32 ° C (circa quattro settimane per generazione), mentre del magazzino viene tipicamente eseguita a 22-25 ° C (circa dieci settimane per generazione).

Negli ultimi dieci anni, molti tec di seriehniques sono stati gradualmente adattati e ottimizzati per Tribolium, come riassunto nei libri emergenti organismi modello 32. Di grande importanza sono avanzati metodi genetici come embrionale 33, larvale 34, 35 o parentale 36, 37 RNA interferenza basati silenziamento genico, trasformazione linea germinale sia con il piggyBac 38, 39 o il sistema trasposasi Minos 40 e CRISPR / genoma Cas9 basata ingegneria 41. Inoltre, il genoma è stato sequenziato Tribolium circa un decennio fa 42, ed è ora nel terzo turno di genoma gruppo di rilascio 43, che consente l'identificazione efficiente e genoma-larga e analisi sistematica dei geni 44 o altri elementi genetici 45, 46. Inoltre, i genomi di altre quattro specie di coleotteri sono disponibili per approcci genetici comparativi 47, 48, 49, 50. In associazione con il genoma sequenziato, due analisi genetiche su larga scala sono state eseguite, ossia uno schermo mutagenesi inserzionale 51 e uno schermo silenziamento genico basato RNA interferenza sistematica 52, 53.

Fluorescenza di imaging in tempo reale con widefield, confocale o la microscopia foglio a base di luce (LSFM) permette di osservare la morfologia embrionale di Tribolium in funzione del tempo (cioè la morfogenesi) in un contesto multidimensionale (Tabella 1). In widefield e confocale microscopia a fluorescenza, la excitzione e emissione di luce viene guidato attraverso la stessa lente obiettivo. In entrambi gli approcci, l'intero campione viene illuminato per ogni piano bidimensionale registrata. Quindi, i campioni vengono sottoposti a livelli energetici molto elevati. In LSFM, solo i fluorofori nel piano focale sono eccitati a causa di un disaccoppiamento di illuminazione e rilevazione utilizzando due lenti obiettivo perpendicolarmente disposti (figura 1). LSFM disponibile in due implementazioni canonici - il piano unico illuminazione microscopio (SPIM) e la luce laser digitalizzata foglio basata microscopio a fluorescenza digitale (DSLM, Figura 2) - e offre diversi vantaggi importanti rispetto agli approcci tradizionali: (i) capacità sezionamento ottico intrinseco, (ii) risoluzione buona assiale, (iii) fortemente ridotto livello di fotometabolismo, (iv) basso fototossicità, (v) alto rapporto segnale-rumore, (vi) relativamente elevata velocità di acquisizione, (vii) l'imaging lungo molteplici direzioni e (viii) la penetrazione nei tessuti più profondi grazie all'utilizzo di bassa apertura numerica illuminazione lenti obiettivo 54, 55, 56.

LSFM è già stato applicato con successo in Tribolium per documentare quasi tutta la morfogenesi embrionale 57 e di analizzare i principi di rottura della membrana extra-embrionali, all'inizio della chiusura dorsale 23. Per aumentare l'attrattiva del LSFM nella comunità Tribolium e per la scienza degli insetti in generale, è di grande importanza per stabilire procedure operative standard e per migliorare i metodi, protocolli e il pool di risorse ad un livello in cui il microscopio diventa una facilità d' -utilizzare strumento standard nei laboratori di biologia dello sviluppo, e le questioni biologiche rimangono al centro dell'attenzione.

Questo protocollo inizia con le basi del Tribolium </ em> coltivazione, cioè la manutenzione, la riproduzione e la raccolta degli embrioni. Successivamente, due strategie sperimentali sono illustrati: (i) l'imaging dal vivo di linee transgeniche misura e (ii) l'imaging di embrioni fissi che sono state colorate con coloranti fluorescenti (Tabella 2). Successivamente, tre tecniche di fissaggio con scopi leggermente diversi sono spiegati in dettaglio (Figura 3 e Tabella 3): (i) la colonna agarosio, (ii) l'emisfero agarosio e (iii) il titolare ragnatela romanzo. Il protocollo spiega poi la procedura di acquisizione dati con LSFM. modalità di imaging e considerazioni chiave sono delineati. Infine, il recupero degli embrioni è spiegato e sono forniti suggerimenti per l'elaborazione dei dati di base. Nei risultati rappresentativi, dati di immagini in diretta da due nuovi su misura e le 58 linee transgeniche Glia-blu sono mostrate e rispettivi set di dati di imaging sono forniti come una risorsa scaricabile. Inoltre, l'immagineDati di embrioni fisse che sono state colorate con una varietà di coloranti fluorescenti sono presentati. La discussione si concentra sul controllo della qualità, le attuali limitazioni dell'approccio di imaging dal vivo e l'adattamento del protocollo ad altre specie.

Il protocollo è scritto per microscopi a fluorescenza foglio a base di luce che sono dotati di una camera di campione e un meccanismo di serraggio girevole per i possessori standardizzati campione 54, 59, 60, che sono tipicamente elementi a forma di cilindro di metallo, plastica o vetro con un diametro nella gamma di millimetro. Il protocollo è adatto anche per entrambe le implementazioni canoniche, cioè SPIM e DSLM, nonché per configurazioni con due o più bracci di illuminazione e di rilevamento 61, 62, 63. I risultati rappresentativi mostrano dati in due canali spettrali, verde (illumination con un laser 488 nm, rilevamento attraverso un filtro passabanda 525/50) e rosso (illuminazione con un laser 561 nm, rilevamento attraverso un filtro passabanda 607/70), ma il protocollo può essere esteso a tre o quattro canali spettrali.

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Protocollo

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1. Husbandry delle Culture Tribolium

NOTA: condizioni standard sono definite come una temperatura di incubazione di 25 ° C e 70% di umidità relativa in 12 h luminose / 12 h ciclo scuro. Per ulteriori informazioni su Tribolium allevamento, rispettive linee guida sono disponibili 64. Questo protocollo richiede due supporti a base di farina diversi, che possono essere preparati in quantità chilogrammo e conservati per diversi mesi.

  1. Prima di lavorare con farina e lievito secco inattivo, memorizzare i pacchetti sigillati a -20 ° C per 24 ore e poi lasciarli riscaldare a temperatura ambiente. Questa procedura elimina potenziali patogeni.
  2. Passare pieno farina di frumento di grano e lievito secco attivo attraverso un setaccio a 710 micron di maglia, quindi preparare mezzo di crescita integrando la farina di grano integrale setacciata con il 5% (w / w) setacciata lievito secco inattivo.
  3. Passare 405 farina di grano fine e lievito secco attivo attraverso un setaccio a 250 & #181; m di maglia, poi preparare medio deposizione delle uova di completarlo 405 farina di grano raffinata setacciata con il 5% (w / w) setacciata lievito secco inattivo.
  4. Passare il rispettivo cultura Tribolium attraverso un setaccio con 800 micron dimensione delle maglie. Eliminare il terreno di coltura residuo. Trasferire le larve, pupe e gli adulti ad un grande piatto di vetro.
  5. Se non esiste la cultura progenie, trasferire circa 80 larve e / o pupe ad una nuova bottiglia di vetro per stabilire una nuova cultura progenie. Se nessun larve e / o pupe sono presenti, prendere invece circa 40 adulti. Aggiungere 50 g di mezzo di crescita e incubare in condizioni standard.
  6. Raccogliere circa 300 adulti (500-700 mg) in un'altra nuova bottiglia di vetro per stabilire la cultura di imaging. Aggiungere 50 g di mezzo di crescita e incubare in condizioni standard. Lasciare che la cultura di imaging di stabilirsi per almeno 24 h in mezzo di crescita fresco prima di raccolta degli embrioni.
  7. Sostituire il terreno di crescita della cultura di imaging almeno ogni due abbiamoeks, che può essere fatta in collaborazione con raccolta di embrioni (vedi 3.2). Dopo due o tre mesi, sostituire la cultura di imaging completamente dai nuovi adulti della cultura progenie.
  8. Se si usa una linea transgenico non omozigote, curare le culture progenie spesso rimuovendo animali non transgenici. Idealmente, generare linee omozigoti se il rispettivo transgene non è letale o cause di sterilità quando presenti su entrambi i cromosomi. culture omozigoti hanno tipicamente un livello di fluorescenza media superiore e le condizioni sperimentali generali sono più strette, poiché soltanto un genotipo è presente.

2. Setup Microscopio e calibrazione

NOTA: L'embrione Tribolium ha una lunghezza antero-posteriore di circa 600-660 micron e un diametro trasversale di circa 300-330 um. Maggior parte delle fotocamere CCD moderni hanno una dimensione del chip sensore di circa 9 mm x 7 mm, cioè un diametro di 11,4 micron, e una distanza di pixel-pixel di 6,45 um.Quando combinato con una lente obiettivo 10X ingrandimento, l'embrione può essere ripreso in toto con un passo dei pixel 0,645 um. Maggior parte delle fotocamere sCMOS moderni hanno una maggiore dimensione del chip del sensore di circa 16 mm x 14 mm, cioè un diametro di 21,3 micron, e una distanza di pixel-pixel di 6,5 micron. Quando combinato con una lente obiettivo 20 ingrandimenti, l'embrione può essere ripreso in toto con un passo dei pixel 0,325 um.

  1. Collegare le lenti illuminazione e oggettivi rilevazione al microscopio. Assicurarsi che laser e filtri fluorescenza corrispondono l'assorbimento fluoroforo e spettri di emissione molto bene.
  2. Collegare la camera del campione al microscopio. Riempire la camera campione con PBS pH 7,4 o qualsiasi altro tampone di imaging appropriato.
  3. Accendere e calibrare il microscopio. le routine e le linee guida per la risoluzione dei problemi microscopi foglio a base di luce custom-built (più precisamente per l'attuazione DSLM) calibrazione completa sono stati pubblicati previously 65. Per i dispositivi commerciali, seguire attentamente le istruzioni del produttore. Maltrattamento potrebbe esaurire la camera del campione del mezzo e provocare danni allo strumento, così come il campione.

3. Raccolta dei transgenici o WT Embrioni

  1. Passare la colonia di imaging attraverso un setaccio con 800 micron dimensioni delle maglie. Raccogliere coleotteri adulti in una nuova bottiglia di vetro e aggiungere 10 g di media deposizione delle uova. Incubare la cultura ovideposizione per 1 ha 25 ° C e 70% di umidità relativa in luce.
  2. Passare la cultura deposizione delle uova attraverso un setaccio a 800 micron dimensione delle maglie per separare gli adulti dal mezzo di deposizione delle uova, che contiene circa 30-100 embrioni. Trasferire gli adulti ad una nuova bottiglia di vetro e aggiungere sia il vecchio o 50 g di terreno di coltura fresco.
  3. Se osservazione dovrebbe iniziare nella fase blastoderma uniforme (esempio di dati DS0002), incubare il mezzo di deposizione delle uova per 15 ore a 25 ° C e 70% di umidità relativa. To iniziare all'inizio di retrazione germband (esempio set di dati DS0001 e DS0003), incubare embrioni per 23 ore a 32 ° C e 70% di umidità relativa. Se altri stadi di sviluppo sono desiderati, fare riferimento alla rispettiva letteratura 64, 65 e adattare il tempo di incubazione e / o temperatura secondo necessità.

4. Embrione dechorionation

NOTA: Il corion è lo strato esterno del guscio e si compone di proteine ​​e polisaccaridi. È fortemente la luce assorbente ma non essenziale per il corretto sviluppo e può quindi essere rimossa chimicamente.

  1. Passare il mezzo di deposizione delle uova attraverso un setaccio da 300 micron dimensione delle maglie. Raccogliere gli embrioni in un colino cella con 100 um dimensione di maglia e scartare il mezzo rimanente deposizione delle uova.
  2. Preparare una piastra da 6 pozzetti come segue: riempire la A1, A2, A3 e B3 pozzetti con 10 ml di PBS pH 7,4 e B1 e B2 pozzetti con 9 ml di PBS. Poi aggiungere con cautela1 mL di sodio ipoclorito al B1 e B2. Osservare lo stato di avanzamento dei passi 4.3 a 4.8 sotto il microscopio stereo. ipoclorito di sodio ATTENZIONE è corrosivo.
  3. Inserire il filtro cellula nel pozzetto A1 (PBS pH 7,4) e lavare gli embrioni per un minuto sotto blanda agitazione. particelle di farina più grandi dovrebbero staccarsi dagli embrioni.
  4. Trasferire il filtro cella a pozzetto B1 (ipoclorito di sodio in PBS pH 7.4) e agitare la piastra energicamente per 30 s. Le particelle di farina rimanenti dovrebbero staccare completamente dagli embrioni.
  5. Trasferire il filtro cella alla A2 pozzo (PBS pH 7,4) e lavare gli embrioni per 1 min sotto blanda agitazione.
  6. Per dechorionation, trasferire il filtro cella alla B2 pozzo (ipoclorito di sodio in PBS pH 7,4). Agitare la piastra energicamente fino a quando la rottura corion e stacca dagli embrioni. Il corion sembra una membrana sottile semitrasparente con bordi lacerati, mentre embrioni dechorionated hanno una sagoma piana.
  7. esimo di trasferimentocellule filtro e alla A3 pozzo (PBS pH 7,4) e lavare gli embrioni per 1 min sotto blanda agitazione. Se eventuali frammenti corion sono ancora attaccati agli embrioni dopo il lavaggio, ripetere il punto 4.6.
  8. Memorizzare gli embrioni nel pozzo B3 (PBS pH 7,4). Bagagli per diverse ore non danneggia gli embrioni, ma di tenere presente che lo sviluppo continua.
  9. Per le linee transgeniche non omozigoti, rimuovere eventuali embrioni non fluorescenti se possibile. Per la fissazione e la colorazione dei WT o di embrioni transgenici, continuare con il passo 5. Per l'imaging dal vivo di embrioni transgenici, continuare con il passaggio 6.

5. Vitelline membrana permeabilizzazione, Fissazione e colorazione

NOTA: La membrana vitellina è lo strato interno del guscio. È impervia per coloranti fluorescenti e deve essere chimicamente permeabilizzate prima della colorazione così.

  1. Riempire una fiala di scintillazione con soluzione di fissaggio / permeabilizzazione (1,5 mL 4% (w / v) di paraformaldeide in PBS pH 6,9 aND 1.5 mL n-eptano). Trasferire gli embrioni con un pennello per le fiale. fiale coprire con un foglio di alluminio per proteggere fluorofori dalla luce e incubare per 30 min su una piattaforma oscillante a 50 giri al minuto. ATTENZIONE paraformaldeide è tossico e corrosivo, n-eptano è infiammabile e tossico.
  2. Rimuovere la soluzione di fissaggio e trattare embrioni tre volte per 15 minuti in 3 mL 0,1% (v / v) Triton X-100 in PBS pH 7,4 e successivamente una volta per 15 minuti in 3 mL 1% (v / v) Triton X-100 in PBS pH 7,4 su una piattaforma oscillante a 50 giri al minuto. ATTENZIONE Triton X-100 è corrosivo.
  3. Rimuovere la soluzione permeabilizzazione e aggiungere 0,5 ml di soluzione colorante alla fiala. Soluzioni coloranti esemplificativi sono riportate nella Tabella 2. embrioni macchia overnight a 4 ° C su una piattaforma oscillante a 50 giri al minuto. Per i coloranti proposti nella tabella 2, il lavaggio non è necessario.

6. Preparazione del montaggio Agarose

  1. Aggiungere 1 g low-meltagarosio a 100 ml di PBS pH 7,4 e scaldare la miscela per 2-3 minuti in un forno a microonde a 800 W. Se piccole particelle di agarosio sono ancora presenti, ripetere il processo di riscaldamento a intervalli di 30 sec fino a quando le particelle si dissolvono completamente. L'agarosio di montaggio non deve essere preparato fresco ogni volta, il solidificato agarosio può essere ri-liquefatti mediante riscaldamento come descritto sopra. Questo processo può essere ripetuto 5-6 volte prima troppa acqua è evaporata.
  2. Consentire l'agarosio raffreddare fino a circa 40-45 ° C, quindi riempire due provette da 1,5 ml con l'agarosio riscaldata e mantenere quei tubi a 35 ° C in un termoblocco.

7. Embrione di montaggio e inserimento nella camera del campione

  1. Opzione 1: colonna agarosio (Figura 3A -C, prima colonna, tabella 3, seconda colonna)
    1. Riempire una siringa da 1,0 ml con acqua distillata e collegarlo ad una delle aperture in vetro capillari utilizzando un tubo di gomma di piccole dimensioni.Riempire la metà capillare con acqua distillata.
    2. Scegliere un embrione con un pennello e posizionarlo sul lato interno dell'altra apertura capillare di vetro. Procedere rapidamente alla fase successiva prima che l'embrione si asciuga.
    3. Attaccare il capillare nel agarosio liquido e disegnare lentamente pochi ml di agarosio liquido a fianco l'embrione nel capillare. Quindi aumentare rapidamente la forza disegno in modo che l'embrione viene trascinata con l'agarosio. Alla fine, alcuni ml di agarosio deve essere sopra e sotto l'embrione. Impostare il capillare da parte per qualche minuto e lasciare che l'agarosio solidificare.
    4. Accorciare il capillare con un cutter vetro diamante per una lunghezza di circa 5 mm. Il frammento rimanente dovrebbe essere completamente riempito con agarosio e l'embrione dovrebbe essere entro il secondo quartile.
    5. Inserire il cilindro d'acciaio con il perno nella camera del campione, e poi attaccare il frammento capillare sulla parte superiore del perno. La colonna agarosio deve sporgere di alcuni millimetri fROM frammento capillare con la parte che contiene l'embrione.
  2. Opzione 2: emisfero Agarose (Figura 3A -C, seconda colonna, tabella 3, terza colonna)
    1. Disegnare 200 ml di agarosio liquido in una siringa ml 1,0, quindi utilizzarlo per riempire il tubo di acciaio dall'alto con agarosio fino a forma di emisfero all'apertura inferiore. Il diametro emisfero deve essere uguale al diametro del tubo. Attendere qualche minuto fino a che l'agarosio si è solidificato.
    2. Scegliere un embrione con un pennello e riorganizzare sulla punta del pennello in modo che l'estremità anteriore diventa accessibile. Immergere l'emisfero agarosio in agarosio liquidi di coprirlo con una pellicola sottile.
    3. Posizionare l'embrione con la sua estremità anteriore in posizione verticale sul palo dell'emisfero agarosio. Girare il tubo d'acciaio intorno e correggere la posizione di un embrione con il pennello. Se necessario, stabilizzare l'embrione aggiungendo 2 microlitri agarosio al confine embrione / emisfero. Idealely, meno della metà della superficie dell'embrione deve essere coperta in agarosio e fianchi dovrebbe essere il più ripido possibile.
    4. Inserire il tubo in acciaio con l'emisfero ed embrione lentamente nella camera del campione.
  3. Opzione 3: Cobweb fermo (Figura 3A -C, terza colonna, tabella 3, quarta colonna)
    1. Scegliere un embrione con un pennello e metterlo da parte.
    2. Coprire il foro asolato del supporto ragnatela con 5-8 ml di agarosio liquido, quindi rimuovere la maggior parte agarosio fino solo un sottile film di agarosio rimane.
    3. Posizionare l'embrione sulla pellicola agarosio e regolarne la posizione. spostare attentamente l'embrione al centro asse x del foro asolato, e allineare il suo asse anteriore-posteriore allungata con l'asse allungato del foro asolato.
    4. Inserire il porta ragnatela con l'embrione montato lentamente nella camera del campione. Posizionare il supporto ragnatela in modo che non interferisca con eccitazione e di emissioneluce, cioè 45 ° rispetto alla xe z.

A base di fogli 8. Luce microscopia a fluorescenza

  1. Decidere insieme quante direzioni (e lungo le quali orientamenti) l'embrione deve essere ripreso. Quattro direzioni (lungo gli orientamenti 0 °, 90 °, 180 ° e 270 °) tipicamente forniscono un buon compromesso tra la copertura e carico di energia.
  2. Impostare il numero di canali di fluorescenza. I parametri principali per ciascun canale sono la linea del laser, il filtro di fluorescenza, la potenza del laser e il tempo di esposizione. Per l'imaging dal vivo a lungo termine, è importante che il carico energetico integrato non superi la tolleranza dell'embrione. Un tempo di esposizione di 25-50 ms garantisce una riproduzione veloce, mentre una potenza laser tra 100 e 300 uW non dovrebbe influenzare la vitalità dell'embrione. Per campioni fissati, tempo di esposizione e potenza del laser può essere almeno raddoppiata.
  3. Per i saggi di imaging dal vivo, configurare il lasso di tempo. il complete embriogenesi di Tribolium richiede circa sette giorni a temperatura ambiente (23 ± 1 ° C) ed un poco meno di tre giorni a 32-35 ° C 64. Definire l'intervallo temporale secondo gli eventi morfogenetici che devono essere osservate. Per gli intervalli temporali brevi, considera di riduzione del tempo di esposizione e potenza del laser (vedi 8.2).
  4. Posizionare l'embrione in modalità luce di trasmissione lungo gli assi x ed y al centro del campo di vista senza esporre al laser. Ruotare l'embrione di 360 ° a 90 ° per esaminare l'embrione per eventuali danni che potrebbero essersi verificati durante il processo di montaggio.
  5. Ruotare l'embrione opportunamente intorno all'asse y per allineare gli assi embrionali con il microscopio assi, ad esempio l'asse laterale con l'asse x, cioè l'asse dorsoventrale con l'asse z. Quando si utilizza la tecnica titolare ragnatela, allineamento potrebbe non essere possibile.
  6. Nella modalità fluorescenza, definire la z-stack for ogni direzione. Aggiungere 25-50 um come buffer spaziale davanti e dietro l'embrione. Compreso il buffer, il tipico z-stack copre circa 350-400 micron per un embrione Tribolium. Definire anche il z-spaziatura, che dovrebbe essere quattro volte la distanza laterale, cioè la distanza lungo gli assi X e Y. 66.
  7. Se due o più embrioni vengono esposte in parallelo, riavviare a 8.4 con il prossimo dell'embrione.
  8. Per l'imaging a lungo termine, assicurarsi che la camera del campione è riempita con sufficiente PBS pH 7,4 o altro buffer imaging. coprire anche l'apertura camera campione.
  9. Avviare il processo di imaging. Per l'imaging dal vivo a lungo termine, monitorare la corretta acquisizione lungo tutte le direzioni in tutti i canali di tutti gli embrioni. controllare di tanto in tanto nel corso dei prossimi giorni che gli embrioni sono vivi e nella posizione appropriata.

9. Embrione Recupero e Controllo Qualità

  1. Una volta imaging è completata, rimuovere il portacampioni congli embrioni dalla camera campione. Solo embrioni da test di imaging dal vivo devono essere recuperate. embrioni fissate e colorate possono essere scartati.
  2. Se è stato eseguito un test di imaging dal vivo, trasferire l'embrione di uno scivolo oggetto. Per la tecnica colonna agarosio, estrarre gli embrioni dal agarosio circostante con un bisturi, micro-coltello o lama di rasoio. Per la tecnica emisfero agarosio, trasferire l'emisfero con la parte piatta alla slitta oggetto. la rimozione degli embrioni non è necessario. Per la tecnica titolare ragnatela, smontare delicatamente gli embrioni dal film agarosio con un pennello. Incubare il vetrino oggetto in un piatto di vetro in atmosfera satura di umidità in condizioni standard fino alla schiusa delle larve.
  3. Dopo la schiusa, trasferire le larve a singoli pozzetti di una piastra da 24 pozzetti e aggiungere 500 mg di mezzo di crescita a ciascun pozzetto. Incubare in condizioni standard. Confrontare il tempo di sviluppo totale e la morfologia delle larve ripreso a WT non ripreso e larv transgenicoAE (vedi la discussione). Nei saggi che caratterizzano lo sviluppo WT, senza aberrazioni morfologiche evidenti dovrebbero idealmente essere evidente.
  4. Una volta che le larve sviluppare per adulti sani, di fornire loro adeguati partner WT dello stesso ceppo di fondo. Dopo due settimane, controllare per la produzione di progenie. Considera anche per controllare la fertilità della progenie accoppiando loro inter pares. Solo quando gli embrioni imaged sviluppano in adulti fertili che producono progenie fertile, la procedura di imaging può essere considerato non invasivo.

10. Image Data Processing

NOTA: Per l'elaborazione dei dati di immagine, l'open-source software di elaborazione delle immagini ImageJ 67 o il suo derivato FIJI 68 sono raccomandati. Entrambe le versioni, nonché una documentazione completa si trovano a www.imagej.net. Il formato di file standard per i dati LSFM è il formato di file di immagine con tag (TIFF). L'opzione contenitore intrinseca consente storabbia di pile di immagine come z-stack o serie temporale di proiezioni massime z all'interno di un singolo file che possono essere aperti in ImageJ o FIJI tramite drag-and-drop.

  1. Se necessario, ruotare le z-stack per allineare l'asse anteriore-posteriore dell'embrione con l'asse y (Immagine → Trasforma → Ruota). Si ricorda che i parametri di rotazione devono essere impostati singolarmente per ciascuna direzione, ma non per il lasso di tempo ed i canali di fluorescenza.
  2. Ritagliare i z-stack lungo gli assi x, ye z assi in modo che solo sfondo minima (20 - 40 pixel lungo gli assi x ed y, 5 - 10 aerei lungo l'asse z) rimane (per x - ed y, utilizzare lo strumento di selezione rettangolare, quindi Immagine → Ritaglia, poiché l'asse z, utilizzo immagini → Pile → Strumenti → Fetta custode). Si prega di notare che i parametri di ritaglio devono essere impostati singolarmente per ciascuna direzione, ma non per i punti di tempo ed i canali di fluorescenza.
  3. Calcolare la massima sporgenza z per ogni z-stack(Immagine → pile → Z progetto, scegliere Max Intensity). calcoli proiezione intensità sono procedure dati semplificazione che rimuovere una dimensione spaziale.
  4. Per i dati di imaging dal vivo a lungo termine, è consigliabile utilizzare un ImageJ o uno script che esegue l'elaborazione FIJI passi 10,1-10,3 per tutte le direzioni, tutti i punti di tempo e tutti i canali di fluorescenza 65. Idealmente, concatenare i proiezioni massime z per canale e la direzione e salvarle come serie temporale in un contenitore TIFF. In alternativa, il plug-in BigDataViewer 69 per FIJI può essere utilizzato per navigare attraverso terabyte-dati di grandi dimensioni.
  5. A seconda della linea e di imaging transgeniche modalità, rettifiche dinamiche intensità delle pile di tempo potrebbe essere auspicabile per foto-candeggio e / o variazioni di espressione fluoroforo. O l'ImageJ- o FIJI-intrinseca funzione di correzione Bleach (Immagine → Regolare → Correzione Bleach, scegli Istogramma corrispondenza) oppure dedicasoftware ted 65 sono suggeriti.
  6. sono consigliate se l'embrione è stato registrato e / o lungo molteplici direzioni e in più canali di fluorescenza, la combinazione orizzontale delle direzioni (Immagine → Pile → Strumenti → Combina) e si fondono canale (Immagine → colori Merge → Canali).
  7. Registrazione e fusione di z-stack acquisiti lungo più direzioni 70, eventualmente in combinazione con deconvoluzione 71, permette il calcolo di immagini tridimensionali superiori di qualità uniforme e risoluzione isotropica. Entrambi i plug-in sono open source e preinstallato in FIJI, ma richiedono la presenza di punti di riferimento (microsfere fluorescenti, ad esempio perline) attorno al campione.
  8. Framework software open-source per larga scala estrazione dati quantitativi e di analisi sono anche disponibili, per esempio per la segmentazione e monitoraggio dei nuclei cellulari 72 o cell riconoscimento di figura 73.

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Risultati

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Questo protocollo descrive un quadro sperimentale per l'imaging di fluorescenza di vita o di embrioni Tribolium fissate e colorate con LSFM. A causa dei bassi livelli di fotometabolismo e foto-tossicità, una conseguenza diretta della sua capacità sezionamento ottico, LSFM è particolarmente adatto per l'imaging in tempo reale a lungo termine.

Il romanzo AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 linea transgenica esprime una protein...

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Discussione

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Controllo di qualità

In saggi di imaging dal vivo, la procedura di preparazione e la registrazione deve essere non invasiva, ossia né la meccanica e manipolazione chimica (raccolta, dechorionation, il montaggio sul supporto del campione), né il carico energetico integrato durante l'osservazione dovrebbe influenzare la vitalità del campione. Per gli studi che caratterizzano lo sviluppo WT, si consiglia di utilizzare i dati solo da esperimenti in cui l'embrion...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Autore Contributi

FS e EHKS concepito la ricerca. FS generato delle linee transgeniche AGOC. imaging di fluorescenza fogli a base di luce è stato eseguito da FS e SK. FS e EHKS ha scritto il manoscritto con il contributo di SK.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Sven Plath per il supporto tecnico. La linea transgenica Glia-blu era un gentile dono da Gregor Bucher (Göttingen, Germania). La ricerca è stata finanziata dal Cluster of Excellence Francoforte sul Meno per complessi macromolecolari (CEF-MC, EXC 115, altoparlante Volker Dötsch) concesso in parte alla EHKS presso l'Istituto Buchmann molecolare Scienze della Vita (BMLS, direttore Enrico Schleiff) presso il Goethe Universität Frankfurt am Main dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
farina integrale di frumentoDemeter e.V.1.13E+08US: farina integrale, UK: farina integrale
405 farina di grano teneroDemeter e.V.1.13E+08US: farina per pasticceria, UK: farina morbida
lievito secco inattivoFlystuff / Genesee Scientific62-106
Saine tamponato con fosfato (PBS), pH 7.4Thermo Fisher Scientific10010-023
ipoclorito di sodio, ~12% attivo ClSigma Aldrich425044-250MLAttenzione: l'ipoclorito di sodio è
un agarosio corrosivo a basso punto di fusioneCarl Roth6351.2
Piastra a 6 pozzettiOrange Scientific4430500
Piastra a 24 pozzettiOrange Scientific4430300
capillari in vetro, interni Ø 0,46 mmBrand GmbH + Co KG7087 09
SYTOX GreenThermo Fisher Scientific57020La preparazione della soluzione colorante è spiegata nella Tabella 2
YOYO-1 IoduroLaY3601è spiegata nella Tabella 2
BOBO-3 IoduroThermo Fisher ScientificB3586La preparazione della soluzione colorante è spiegata nella Tabella 2
Alexa Fluor 488 FalloidinaThermo Fisher ScientificA12379La preparazione della soluzione colorante è spiegata nella Tabella 2
Alexa Fluor 546 FalloidinaThermo Fisher ScientificA22283La preparazione della soluzione colorante è spiegata nella Tabella 2
setaccio, 800 & micro; m dimensione delle maglieVWR International200.025.222-051
setaccio, 710 &; m dimensione delle maglieVWR International200.025.222-050per la preparazione del terreno di crescita (fase 1.1)
setaccio, 300 &; m dimensione delle maglieVWR International200.025.222-040
setaccio, 250 &; m dimensione della magliaVWR International200.025.222-038per la deposizione delle uova preparazione del mezzo (passaggio 1.2)
piatto di vetro, Ø 100 mm & volte; 20 mmSigma AldrichCLS70165102
filtro cellulare, 100 &; m dimensione della magliaBD Biosciences352360
pennello, testina e Oslash; siringaVWR International149-2121
, 1,0 mLB. Braun Medical AG9166017V
fiale di scintillazioneSigma AldrichM1152-1000EA
paraformaldeide (PFA)Sigma Aldrich158127Attenzione: la paraformaldeide è tossica e corrosiva
n-eptano ≥ 99%Carl Roth8654.1Attenzione: l'n-eptano è infiammabile e tossico
Triton X-100Sigma AldrichX100-100MLAttenzione: Trition X-100 è corrosivo
preparazione della soluzione colorante Thermo Fisher Scientific da 2 mm

Riferimenti

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