Articolo metodologico

Sfruttamento del fenotipo della popolazione laterale innescato dal DNA per rilevare e purificare le cellule staminali del cancro da campioni biologici

DOI:

10.3791/55634

⸱

10 maggio 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Immunobiology, Kantonsspital St. Gallen, 2Internal Medicine V, Medical University of Innsbruck, 3Tyrolean Cancer Research Institute (TKFI), 4Medical Clinic III, Oncology, Hematology, Immunoncology and Rheumatology, University Clinic Bonn (UKB)

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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I metodi che consentono la caratterizzazione e l'isolamento delle popolazioni di cellule staminali da campioni biologici sono critici per l'avanzamento dei trattamenti mirati alle cellule staminali nei cancri e oltre. Qui forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento delle cellule staminali del cancro usando il fenotipo della popolazione laterale innescato dal colorante.

Abstract

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Il cancro è una malattia a base di cellule staminali e l'eradicazione di queste cellule è diventata un importante obiettivo terapeutico. Decifrare le vulnerabilità delle cellule staminali del cancro (CSC) e identificare opportuni obiettivi molecolari si basa su metodi che permettono la loro discriminazione specifica in campioni eterogenei come linee cellulari e tessuti tumorali ex vivo . La citometria di flusso / FACS è una tecnologia potente per analizzare in maniera multiparametrica campioni biologici a livello di singola cellula e finora è il metodo di scelta per recuperare le cellule vive per analisi a valle. I marcatori di superficie come CD44 e CD133 e la rilevazione di attività enzimatica di aldeideideideide sono state spesso utilizzate per definire e risolvere CSC da campioni tumorali da parte di FACS. Un approccio complementare, descritto qui in dettaglio metodologico, utilizza l'estrusione funzionale di coloranti da parte dei trasportatori di farmaci ABC, che identifica una popolazione distinta di cellule di fluorescenza dimamente comunemente definite come popolazione laterale (SP). SP, Le cellule tumorali presentano caratteristiche delle cellule staminali canoniche e possono essere abrogate e confermate funzionalmente utilizzando agenti che inibiscono il trasportatore di droga estrudente (più spesso ABCB1 / P-glicoproteina / MDR1 / CD243 e ABCG2 / Bcrp1 / CD338). Inoltre, il saggio SP è compatibile con altre valutazioni citometriche di flusso, quali la colorazione di antigeni superficiali, la rilevazione di deidrogenasi di aldeide e la discriminazione delle cellule morte ( ad es . Con 7-AAD o ioduro di propidium (PI)). Quindi descriviamo un metodo prezioso e ampiamente applicabile per l'identificazione, l'isolamento e la sub-caratterizzazione CSC meccanicamente basata su un parametro funzionale, piuttosto che fenotipico. Anche se in origine viene eseguito con Hoechst 33342 come tintura di innesco, qui ci concentriamo sul più recente fenotipo SP a base di coloranti Violet che è risolvibile su qualsiasi cytometro di flusso dotato di una sorgente laser viola.

Introduzione

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L'efficacia delle terapie tumorali primarie è migliorata sostanzialmente nell'ultimo decennio a causa di progressi impellenti nella comprensione genetica e molecolare della malattia e l'avvento di farmaci mirati come anticorpi terapeutici e inibitori di piccole molecole. Al contrario, la malattia metastatica e recidiva è ancora tipicamente incurabile e la morbilità e la mortalità rimangono elevate in questi ambiti clinici. I CSC rappresentano una sottopopolazione distinta all'interno dei tumori e sono dotate di proprietà canoniche delle cellule staminali come la clonogenicità / tumorigenicità, la resistenza multi-farmaco e la divisione asimmetrica delle cellule 1 , 2 . Così, i CSC non solo guidano la progressione metastatica e l'eterogeneità dei tumori, ma persistono anche durante il trattamento per predisporre il paziente alla ricaduta. L'eliminazione terapeutica del CSC è quindi un importante bisogno medico per prevenire la ricorrenza delle malattie e consentire la cura a lungo termine del cancro 3 .

L'identificazione delle vulnerabilità e la spiegazione delle strategie di eradicazione dei CSC dipendono fortemente da metodi che permettono la loro depurazione da campioni biologici per la successiva profilazione dell'espressione e / o l'analisi funzionale. A loro volta, tali metodi si basano su marcatori superficiali, intracellulari o funzionali che sono specifici per queste cellule. I marcatori di superficie specifici del CSC includono, ma non sono limitati a, CD44, CD133, CD24 e CD90 e sono stati utilizzati per identificare le popolazioni CSC in una varietà di entità tumorali tra cui il cancro al seno e il cancro del colon 4 . Un altro marcatore, l'aldehyde dehydrogenase (ALDH), mostra localizzazione intracellulare e può essere rilevato funzionalmente fornendo un rispettivo substrato la cui conversione enzimatica produce luce. Utilizzando questo test, le popolazioni CSC sono state identificate anche in diverse entità tumorali 5 . Un metodo complementare, comunemente indicato come analisi SP e rappresentato qui in m Dettaglio etodologico, utilizza efflux attivo di coloranti da parte dei trasportatori di droga ABC per identificare piccole popolazioni di cellule simili allo stelo-like fluorescenza 6 , 7 , 8 . A tal fine, un determinato campione viene incubato in presenza di un fluoroforo lipofilico legato al DNA che entra in tutte le cellule attraverso la diffusione passiva e colpisce DNA nucleare e mitocondriale per il legame. Non-CSC privi di espressione di trasportatore di droga ABC accumulano il colorante con conseguente fluorescenza luminosa, mentre CSC estrudono attivamente il colorante che riduce la fluorescenza. L'inibizione farmacologica dell'attività del trasportatore di farmaci abroga e conferma funzionalmente il fenotipo della SP e deve essere utilizzato per scopi di controllo. Le popolazioni CSC che presentano caratteristiche SP sono state divulgate, tra l'altro, nei tumori ovarici 9 , 10 , cancro alla prostata 11 ,> 12, cancro mammario 13 , cancro polmonare 14 , cancro endometriale 15 , glioma 16 , 17 e sarcoma osseo 18 . Importante, il saggio SP è compatibile sia con le linee cellulari sia con i tessuti tumorali primari, anche se il materiale primario presenta ulteriori sfide, come il requisito di una specifica strategia di discriminazione delle cellule tumorali (alcune popolazioni delle cellule ospitanti possono anche esibire le caratteristiche della SP) 19 , 20 .

I due più tradizionali trasportatori di farmaci che forniscono SP sono ABCB1 / P-glicoproteina / MDR1 / CD243 e ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; Tuttavia, altri trasportatori di farmaci possono essere un determinante molecolare del fenotipo SP ( ad es. , ABCB5) 22 . ABCB1Possono essere bloccati in modo efficace con verapamil mentre l'attività di ABCG2 può essere specificamente abrogata con fumitremorgina C (FTC) 6,19. Una particolare forza di analisi SP è che può essere combinata con altri colorazioni ( ad esempio , marcatori superficiali e ALDH) e che consente il recupero delle cellule vive in modo compatibile con le indagini funzionali a valle. Inoltre, la rilevazione di SP è ampiamente applicabile a causa dell'alta conservazione dei trasportatori di farmaci ABC tra le popolazioni CSC 9 , 23 .

In origine, il rilevamento della SP è stato eseguito usando Hoechst 33342 come un colorante di innesco 24 . Questo colorante raggiunge un'ottima risoluzione ma richiede l'eccitazione laser ultravioletta; Pertanto la sua applicabilità è naturalmente limitata agli strumenti citometrici a flusso di alta gamma. L'avvento di DyeCycle Violet (DCV) 25 ha aperto un nuovo avenuEs per l'analisi SP e ha esteso l'applicabilità di questo metodo a standard strumenti citometrici a flusso senza una sorgente laser ultravioletta (una sorgente laser viola è sufficiente a risolvere le cellule DCV-SP). Importante, Hoechst 33342 e DCV condividono le specifiche specifiche della pompa, indicando che entrambi i coloranti dovrebbero identificare le stesse popolazioni cellulari.

Qui forniamo un protocollo sperimentale dettagliato di analisi SP basata su DCV per una riproduzione rapida e facile in laboratori indipendenti. Riconosciamo pertanto il nostro articolo come risorsa per i ricercatori CSC che dovrebbero contribuire all'ottimizzazione e alla standardizzazione di questo metodo cellulare-biologico utile.

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Protocollo

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Questo protocollo è in piena conformità con le linee guida del consiglio di revisione etica istituzionale. Se il tessuto umano o animale viene studiato utilizzando il protocollo qui descritto, i ricercatori sono tenuti ad avere l'approvazione del pertinente organo di revisione della loro istituzione o paese.

Attenzione: per questo protocollo si applicano le precauzioni standard per la manipolazione sicura dei campioni biologici. Ciò include indossare guanti e un cappotto di laboratorio, e svolgere il lavoro sotto un armadietto di biosicurezza quando possibile.

1. Preparazione delle cellule

  1. Linee cellulari del cancro
    1. Coltivare una rispettiva linea di cellule tumorali umane o murine a 37 ° C in 10-30 mL di mezzo appropriato ( es . RPMI 1640 integrato con 10% ( v / v ) FBS, 2mM L-glutammina e 1x penicillina / streptomicina) Le cellule a sub-confluenza ( vale a dire 70-90%) utilizzando digestione con 0,05% di tripsina-EDTA o di un altro de-attProcedura di adesione. Determinare il conteggio delle cellule e controllare la vitalità utilizzando una camera di conteggio e la colorazione del trypan blu. La frazione delle cellule vitali dovrebbe superare l'85%.
      NOTA: Esempi di linee di cellule tumorali umane che ospitano i compartimenti SP includono MCF7 / HTB-22 e SKBR3 / HTB-30 (cancro al seno), A2780 e SKOV-3 / HTB-77 (cancro ovarico) e A549 (cancro ai polmoni) 26 .
  2. Tessuto tumor ex vivo
    1. Prendi un nuovo campione di tumori chirurgici freschi o, in alternativa, raccoglie il tessuto tumorale da un modello tumorale del topo da trapianto o geneticamente modificato. Prendete 200-1.000 mg di tessuto e generate una sospensione di una singola cellula mediante disaggregazione meccanica ( ad esempio , con forbici o bisturi) e digestione enzimatica ( ad esempio , utilizzando una collagenasi / dispasio / cocktail DNase).
    2. Filtrare il campione mediante un filtro di taglio da 70 μm. Determinare il conteggio delle cellule e controllare la vitalità utilizzando una camera di conteggio e trypan blColorazione ue.
      NOTA: I cocktail della digestione contengono frequentemente 200 μg / mL collagenasi P, dispersione da 0,8 U / mL e 25 μg / mL DNasi I e tempi di incubazione tipicamente compresi tra 20 e 50 minuti. Idealmente, la disaggregazione dei tessuti viene eseguita secondo un protocollo ottimizzato per il tessuto in esame 27 , 28 , 29 .

2. Campioni di prova

  1. Regolare la concentrazione cellulare su 1 x 10 6 cellule / mL in un mezzo di coltura fresco (un veicolo contenente sostanze nutritive è importante perché l'estrusione di tinture è un processo energetico attivo). Infine, trasferire 1 ml di campione in un tubo rotondo di fondo citometria / FACS (etichettato con "test").
    NOTA: Per risultati ottimali, può essere necessario che la concentrazione cellulare sia titolata (per esempio 5 x 10 5 -1 x 10 6 -2,5 x 106 cellule / ml), ma una concentrazione di cellule inferiore minoreRisulta più alta 19 . Solo per l'ordinamento delle applicazioni in cui un numero massimo di celle SP deve essere recuperato, si raccomanda di aumentare la concentrazione cellulare fino a 1 x 10 7 cellule / ml.
  2. Aggiungere 10 μM di DCV al campione e mescolare bene, sia con dolce vortexing che resuspendendo per 3-5 volte. Procedere ai controlli di inibizione.
    NOTA: i risultati ottimali potrebbero dipendere dalla titolazione del colorante di innesco (ad esempio 2,5; 5; 10; 20 μM), ma una concentrazione di tinture più elevata genera generalmente una maggiore risoluzione 19 .

3. Controlli di inibizione

  1. Trasferire 250 μL della sospensione cellulare contenente tintura in un nuovo tubo di flusso citometrico / FACS (etichettato con "controllo"). Aggiungere 50 μM di verapamil o 20 μM di FTC e mescolare bene pipettando.
    NOTA: Verapamil e FTC sono gli inibitori più consolidati per l'analisi SP, ma hanno diverse specifiche della pompa effluxY: Verapamil inibisce diversi trasportatori di farmaci ABC inclusi ABCB1 e ABCB5, mentre FTC è specifica per ABCG2 6,19. Se lo stato SP di un singolo campione è sconosciuto, è quindi consigliabile utilizzare sia verapamil che FTC in tubi separati.

4. Colorazione

  1. Infilare i tubi "test" e "control" e incubarli a 37 ° C al buio per 90 minuti, con agitazione leggera ogni 15 min. La maggior parte dell'estrusione di tinture nelle cellule SP si verifica entro i primi 45 minuti, ma l'accumulo di tinture in cellule non-SP (contribuendo alla risoluzione) è solo massimo dopo 75-90 min 19 .
  2. Dopo la colorazione, lavare le cellule in 3-4 mL di PBS a ghiaccio freddo e risospendere il pellet in un volume di 100 μL (anche PBS). Tenere le cellule nel buio e raffreddare sul ghiaccio, e procedere alla colorazione di marcatori aggiuntivi. In alternativa, eseguire direttamente la fase citometrica a flussolisi.

5. Conservazione per altri marcatori

  1. Aggiungere un pannello desiderato di anticorpi coniugati con fluorochrome alle cellule colorate DCV, mescolare bene e incubare le cellule a 4 ° C nell'oscurità per 20-30 min. Lavare le cellule in 3 - 4 mL di PBS a ghiaccio freddo e procedere alla discriminazione delle cellule morte.
    NOTA: i formati anticorpali che sono facilmente compatibili con DCV e praticamente non richiedono la compensazione includono PerCP o PerCP-Cy5.5, PE-Cy7, APC, Alexa Fluor 647, APC-Cy7, APC-H7, BV711, Alexa Fluor 750 e BV786 . Formati compatibili con DCV ma possono richiedere la compensazione includono FITC, Alexa Fluor 488, PE e BV650. Formati praticamente non compatibili con DCV includono BV421, V450 e V500.
  2. Aggiungere 7-AAD (o PI) alle cellule colorate DCV alla concentrazione consigliata dal produttore particolare e incubare i campioni per 5-10 minuti al buio. Filtrare i campioni con filtri cutanei da 70 μm e procedere alla analisi citometrica.

6. Analisi citometrica del flusso

NOTA: Si consiglia di accendere il rispettivo strumento citometrico durante il processo di colorazione in modo che tutto sia impostato non appena i campioni sono pronti. Ciò comprende anche procedure standard di manutenzione come il monitoraggio delle prestazioni del sistema e il riempimento del serbatoio.

  1. Acquisire le celle sul citometro di flusso e portarle su un plotter dotato di bivariate FSC / SSC (Figura 1B). Escludi doppi e aggregati confrontando i diversi segnali di FSC ( cioè l' altezza, la larghezza, l'area) (Figura 1C).
    1. Se è stato incluso un marcatore di cellule morte, la porta sulla frazione vitale della cellula ( es . 7-AAD-negativo) ( Figura 1D ). Visualizzare le singole cellule valide su un punto dotato di bivariate per emissione DCV "blu" e "rossa". A tal fine, visualizzare il canale 'fluorescente blu' sull'asse y ( ad esempio , 450/50) e il 'Rosso 'sul canale di fluorescenza sull'asse x ( es. , 525/50).
    2. Passare entrambi i canali alla modalità lineare e regolare le tensioni del rivelatore in modo che la SP individua al lato della trama nel quadrante inferiore sinistro. Al contrario, il non-SP individua nel quadrante superiore destro della trama che riflette la distribuzione del ciclo cellulare (G1 e G2). Portare la SP e arrestare l'acquisizione ( Figura 1E ).
      NOTA: Le celle SP definite DCV possono essere rilevate utilizzando strumenti citometrici a flusso forniti con una sorgente di eccitazione laser violetta ( ad esempio una linea laser 405 nm). È una specifica analisi SP che la fluorescenza emessa viene misurata in modalità lineare e in due canali distinti visualizzati su un plotter a punti bivariato. L'emissione "blu" di DCV viene misurata a circa 450 nm ( ad esempio con un filtro standard 450/40) e l'emissione "rossa" di DCV viene misurata a circa 510-585 nm ( ad esempio , con un valore di 510/50, 525/50 o un filtro 585/15) 19 . A causa della particolare chimica del saggio, la separazione tra SP e le cellule non-SP è generalmente più elevata nel canale 'fluorescente rosso' 19 .
  2. Caricare il controllo di inibizione e acquisire i dati. Le cellule SP sono ormai scomparse o sono ridotte sostanzialmente ( Figura 1F ). Se necessario, perfezionare la porta SP basata su questi dati.
  3. Per indagare l'espressione di marcatore di superficie con le celle SP, lasciare la fluorescenza "rossa" del DCV sull'asse x e visualizzare un rispettivo canale di fluorescenza sull'asse y in modalità logaritmica ( ad esempio , APC). Adeguare le tensioni del rivelatore corrispondentemente e portare la frazione delle cellule SP che colorano positivi per i marcatori indagati ( Figura 1G ). La coespressione di un particolare marcatore dalle cellule SP produce un rispettivo segnale nel quadrante superiore sinistro della trama 30 .
  4. Registrare laDati e / o ordinare le celle SP.

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Risultati

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Fornito è un'analisi SP rappresentativa delle cellule A2780, una linea di cellule tumorali ovariche umane precedentemente dimostrato di portare una contabilità SP per meno dell'1% delle cellule 9 . Le cellule sono state coltivate a 37 ° C in RPMI 1640 integrato con 10% ( v / v ) FBS, 2mM L-glutammina e 1x penicillina / streptomicina e raccolte a confluenza dell'85% utilizzando il trattamento con 0,05% di tripsina EDTA. Le cellule sono state lavate in PBS ...

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Discussione

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I progressi nella gestione clinica del cancro dipendono anche dallo sviluppo delle modalità di trattamento che mirano ai CSC. I metodi che consentono l'isolamento affidabile dei CSC da campioni biologici accelerano l'individuazione di obiettivi idonei e sono quindi di fondamentale importanza in questo sforzo. L'analisi SP è una tecnica consolidata e preziosa per identificare le popolazioni CSC che esprimono i trasportatori di farmaci ABC e l'implementazione di DCV ha esteso la sua applicabilità agli stru...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare. Non vi è anche alcun coinvolgimento di non autori nella preparazione del manoscritto.

Ringraziamenti

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Maximilian Boesch è sostenuto da una borsa Erwin Schrödinger del Fondo australiano di scienze FWF (numero di sovvenzione J-3807).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Vybrant DyeCycle VioletThermo Fisher ScientificV35003Pronto all'uso
Verapamil cloridratoSigma-AldrichV4629Sciogliere in etanolo
Fumitremorgin CSigma-AldrichF9054Sciogliere in DMSO
7-AAD (o ioduro di propidio - PI)BioLegend420403Pronto all'uso
Reagenti standard per colture cellulari (ad es. , terreno, FBS, L-glutammina, antibiotici, PBS, tripsina-EDTA, ecc.)Fornitori
Campione/cellule di interesse (ad es, linea cellulare di cancro umano o murino, tessuto tumorale umano o murino)Fornitori
Strumento citometrico a flusso (FACS; analizzatore o selezionatore cellulare)FornitoridiversiSorgente laser viola richiesta
Tubi FACS (fondo tondo)FornitoriTubi con tappo consigliati
70 & micro; m filtri cut-offFornitoriOpzionale ma consigliato
Miscela di enzimi di digestione (ad es. , collagenasi/dispasi/Dnase)FornitoriRilevante solo per la dissociazione tissutale
Anticorpi coniugati con flurocromo contro marcatori di superficie di interesseFornitoriKit
ALDEFLUORopzionale Tecnologie STEMCELL01700Opzionale
diversidiversi diversi diversi diversi diversi

Riferimenti

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