Articolo metodologico

Valutare il flusso autofagico misurando LC3, p62 e LAMP1 Co-localizzazione usando la citometria del flusso di imaging multispettrale

34.4K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/55637

⸱

21 luglio 2017

1Amnis Biology Department, MilliporeSigma

In questo articolo

Sommario

Qui, la citometria a flusso di imaging multispectrale con una caratteristica analitica che confronta immagini luminose di dettagli di 3 marcatori autofag e quantifica la loro co-localizzazione, insieme al conteggio spot LC3, è stata utilizzata per misurare l'autofagia in modo oggettivo, quantitativo e statisticamente robusto.

Abstract

L'autofagia è un percorso catabolico in cui i componenti cellulari normali o disfunzionali che si accumulano durante la crescita e la differenziazione sono degradati attraverso il lisosoma e vengono riciclati. Durante l'autofagia, la proteina LC3 citoplasmatica viene lipidizzata e reclutata alle membrane autofagosomali. L'autofaggo quindi si fonde con il lisosoma per formare l'autolysosoma, dove si verifica la rottura della vescicola di autofagosoma e il suo contenuto. La proteina associata con ubiquitina p62, che si lega a LC3, è anche usata per monitorare il flusso autofagico. Le cellule sottoposte a autofagia dovrebbero dimostrare la co-localizzazione di marcatori p62, LC3 e lisosomiali. La microscopia immunofluorescenza è stata usata per identificare visivamente LC3 puncta, p62 e / o lysosomi su base per cellula. Tuttavia, può essere difficile ottenere una valutazione oggettiva e statisticamente rigorosa. Per ovviare a questi problemi, è stata utilizzata citometria di flusso multispectrale di imaging e una caratteristica analitica che confronta la luminosità(LC3, p62 e lysosomal LAMP1) e quantifica la loro co-localizzazione in combinazione con il conteggio dei punti LC3 per misurare l'autofagia in modo oggettivo, quantitativo e statisticamente robusto.

Introduzione

Macroautophagy, qui di seguito denominato autophagy, è un percorso catabolico in cui i componenti danneggiati o disfunzionali, le proteine ​​a lungo termine e gli organelli sono degradati attraverso il lisosoma e vengono riciclati 1 . L'autofagia è un processo dinamico e multistep che coinvolge la formazione di un autofago; La fusione dell'autofaggo con il lisosoma, formando l'autolysosoma; E il degrado del contenuto dell'autolysosoma 2 . Il marcatore biologico cruciale utilizzato per identificare l'autofagia nei sistemi di mammiferi è la catena leggera 1A / 1B-light 3 (LC3) legata alla microtubula, che costituisce la membrana autofagosomica. Durante l'autofagia, LC3-1 citosolico è coniugato alla fosfatidiletiletanolo per formare LC3-II; LC3-II è quindi incorporato nella membrana autofosfoma 3 . Un altro marcatore ampiamente utilizzato per il flusso autofagico è il sequestosoma 1 del recettore autofagico (SQSTM1, p62) che fisicamente liNks cargo autofagico alla membrana autofagica 4 , 5 .

I metodi tradizionalmente utilizzati per misurare l'autofagia sono blots occidentali e microscopia a fluorescenza 7 . Tuttavia, nessuno di questi metodi è considerato come "standard d'oro" , 2 , 6 poiché ci sono sfide associate a entrambe queste tecniche. Le macchie occidentali danno solo una media perché usano un campione omogeneo, in modo che gli osservatori non riescano a vedere cosa succede nelle singole cellule. D'altra parte, la microscopia a fluorescenza dà informazioni a livello di singola cellula, ma manca di capacità di trasmissione, rendendo difficile ottenere valutazioni oggettive e statisticamente rigorose. Negli ultimi anni la misurazione di LC3 e p62 mediante citometria a flusso di imaging multispectrale (MIFC, vedi tabella dei materiali ) sta guadagnando popuLeggerezza dovuta al suo potere quantitativo, alle capacità di trasmissione elevata, al potenziale di multiplexing e alla capacità di immagine di ogni cella. Uno dei metodi più utilizzati per misurare l'autofagia utilizzando il MIFC, insieme al software di analisi companion (vedi tabella dei materiali ), è attraverso il conteggio a spot di LC3 puncta o autofagosomi 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Tuttavia, un aumento degli autofosomi non implica necessariamente un aumento dell'autofagia, in quanto potrebbe anche rappresentare un blocco nel processo 2 . Il fatturato LC3-II è un parametro utile per misurare il flusso autofagico analizzando le cellule in presenza eAssenza di un inibitore della degradazione lisosomiale, come la clorochina. Il clorochina inibisce la fusione dell'autofaggoma al lisosoma, consentendo così la quantitazione della formazione di autofaggo come misura del grado di autofagia arrestando il flusso autofagico prima che possa verificarsi il degrado lisosomico 18 . Inoltre, p62 è degradato principalmente da autofagia, e se la degradazione lisosomiale della autofagosoma e il suo contenuto è bloccato, un accumulo di p62 è previsto 17, 19.

L'autofagia è un processo multistep e la misurazione di LC3 o p62 da solo non fornisce un quadro completo di ciò che sta accadendo nelle cellule. Le pubblicazioni recenti hanno sottolineato la necessità di esaminare la formazione concorrente dell'autolysosoma 2 , 17 , 20 , 21 . Il MIFC èunica in grado di misurare la formazione della autolysosome dal imaging del co-localizzazione del autofagosoma al lisosoma 15 - 17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26. Inoltre, è stata esplorata la co-localizzazione di p62 e LC3 utilizzando MIFC per misurare il flusso autofagico 5 . Nel software di analisi di riferimento, la "funzionalità" che misura la co-localizzazione è chiamata "Bright Detail Similarity R3" (BDS) ed è stata specificamente progettata per confrontare i piccoli dettagli luminosi di due immagini. BDS è il coefficiente di correlazione Pearson trasformato dal log con i punti luminosi localizzati con un raggio di 3 pixel o meno; In altre parole, il BDS calcola il grado di oConfronta pixel da due diversi canali fluorescenti. I punti luminosi sono correlati ( cioè, la stessa posizione spaziale) o non correlati ( vale a dire differenti posizioni spaziali). Pertanto, il coefficiente di correlazione varia tra 0 (non correlato) e 1 (perfetta correlazione). Il coefficiente è log-trasformato per aumentare l'intervallo tra zero e infinito 26 , 27 . BDS da solo potrebbe non essere sufficiente; Rajan et al. Ha scoperto che l'utilizzo di solo BDS potrebbe portare a risultati falsi positivi o falsi negativi 21 . BDS valuta la co-localizzazione di due marcatori di autofagia, ma non prende in considerazione il numero di autofosomi. Per tenere conto del numero di autofosomi, Rajan et al. Incluso il punteggio a punti della LC3 puncta 21 . Rajan et al. Ha proposto di utilizzare un diagramma di dispersione bivariato di punti spot LC3 contro BDS. Utilizzando questa trama bivariata, due popolazioni sono andateE in primo luogo identificato: uno con le cellule che hanno un alto livello di LC3 e uno con le cellule che hanno un basso livello di LC3 macchie. La popolazione a punti LC3 è stata ulteriormente classificata in due popolazioni: le cellule con bassa co-localizzazione ( ossia l' accumulo di autofosomi) e le cellule con elevata co-localizzazione ( ossia l' accumulo di autolysosomi). Questa trama bivariata permette di distinguere tra cellule con pochi autofosomi e cellule con un accumulo di autofosomi e / o autolysosomi 21 .

Fino ad ora la co-localizzazione simultanea di LC3, p62 e LAMP1 (marker lizosomico) non era possibile utilizzando un singolo "tipo di funzionalità" nel software di analisi del companion MIFC (vedi tabella dei materiali ). Tuttavia, una nuova funzionalità, recentemente introdotta nella versione 6.1, si chiama Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 confronta le immagini del dettaglio luminoso da ciascuna delle tre immagini (in questo caso, LC3, p62 e LAMP1) e quantifica la co-localizzazione delle tre sonde ( es. LC3, p62 e LAMP1). La funzione BDC3 calcola il coefficiente di correlazione di Pearson modificato per estendersi a tre immagini. Poiché le macchie luminose nelle tre immagini sono correlate o non correlate, il coefficiente di correlazione varia tra 0 (non correlato) e 1 (perfetta correlazione). Il coefficiente è log-trasformato per aumentare l'intervallo dinamico tra 0 e infinito. Attivando la funzione BDS con la funzione BDC3, il metodo di analisi presentato da Rajan et al. Ora possono incorporare i tre indicatori più utilizzati per misurare l'autofagia in un unico sistema contemporaneamente. La capacità di co-localizzare questi tre marcatori di autofagia in un singolo dosaggio potrebbe portare a nuovi approfondimenti sull'induzione e la regolazione dell'autofagia. Il seguente protocollo descrive i passi per indurre l'autofagia nelle cellule Jurkat; Etichettare le cellule con gli anticorpi LC3, p62 e LAMP1; Acquisire dati su un multispCitometro di flusso ectrale di imaging; E analizzare i dati per valutare il flusso autofagico.

Protocollo

1. Preparazione di inibitori della coltura media e della degradazione lisosomiale

  1. 1.1. Fai ~ 500 mL di mezzo 1x di coltura RPMI. Aggiungere 5 ml di amminoacidi non essenziali MEM (100 volte), 5 ml di piruvato di sodio (100 mM), 5 ml di penicillina-streptomicina-glutamina (100 volte) e 25 ml di siero di fegato fetale (FBS) Bottiglia di media RPMI - 1640 1x. Il mezzo dovrebbe essere preparato in un armadio per la biosicurezza. Conservare il supporto di coltura RPMI a 2-8 ° C. Scaldare il terreno di coltura RPMI a 37 ° C prima di aggiungerlo alle cellule Jurkat.
  2. Realizzare 100 mM clorochina, inibitore lisosomiale di degradazione. Ponderate 0,05 g di sale di fosfato di clorochina e aggiungilo a 1 ml di acqua di coltura a cellule in un tubo da centrifuga da 15 ml. Vortex fino a quando la clorocina si è dissolta.

2. Coltura delle cellule

  1. Cultura 80 ml di cellule Jurkat clone E6-1 nel terreno di coltura RPMI a 37 ° C e 5% CO 2 .
    NOTA: quando si coltivano le celluleO lavorare con le cellule Jurkat prima della fissazione, tutto il lavoro dovrebbe essere fatto nell'armadio della biosicurezza.
  2. Prima di indurre l'autofagia, contano le cellule Jurkat usando un emocitometro o un altro dispositivo di conteggio delle cellule per determinare le cellule / mL.

3. Induzione dell'autofagia nelle cellule

  1. Prendete le cellule Jurkat in fase di crescita esponenziale e suddivise in quattro campioni di 20 ml ciascuno in tubi da 50 ml di centrifuga. Etichettare i tubi come "Controllo", "Control + Chloroquine", "Fame" e "Starved + Chloroquine".
    NOTA: Le cellule Jurkat dovrebbero avere una concentrazione di 2,5-5 x 10 5 cellule / ml.
  2. Lavare le cellule aggiungendo 30 mL di Solution Salt Balanced Hank senza Ca 2+ o Mg 2+ (HBSS) ad ogni campione. Centrifugare a 250 xg per 10 min. Versare il supernatante in un bicchiere di scarto.
  3. Riposizionare i campioni di controllo in 20 ml di terreno di coltura RPMI pipettando su e giù usando un 25 mlPipetta usa e getta usa successivamente seguita da vortexing leggero. Allo stesso modo, risospendere i campioni affamati in 20 ml di soluzione salina equilibrata di Earle senza Ca 2+ o Mg 2+ (EBSS).
  4. Usando una pipetta usa e getta usa 25 ml, trasferire i campioni di controllo e fame in tazze T75 che sono state contrassegnate con "Control", "Control + Chloroquine", "Starved" e "Starved + Chloroquine".
  5. Aggiungere 20 μl di 100 mM clorocina ai 20 mL di terreno di coltura cellulare nella colonna "Control + Chloroquine" e "Starved + Chloroquine". Mescolare in clorochina girando delicatamente il pallone. Posizionare tutte le fiasche in un incubatore di CO 2 di 37 ° C e 5% per 2 ore.

4. Preparazione dei buffer per la fissazione e l'etichettatura di LC3, LAMP1 e p62

  1. Preparare 10 ml di soluzione di fissazione di formalina al 4% in PBS. Aggiungere 4 mL di 10% di formalina a 1 mL di 10 volte Dulbecco's Phosphate-BufferedSoluzione salina senza Ca 2+ o Mg 2+ (PBS) e 5 ml di acqua ultrapure in un tubo di centrifuga da 15 ml.
    NOTA: ATTENZIONE. Formalin / formaldeide è tossico se inalato o inghiottito; È irritante per gli occhi, il sistema respiratorio e la pelle; E può provocare sensibilizzazione per inalazione o per contatto con la pelle. Esiste il rischio di gravi lesioni agli occhi. È un potenziale cancerogeno.
  2. Preparare 10 ml di soluzione di resuspensione finale di formalin 1% in PBS. Aggiungere 1 ml di 10% di formalina a 9 ml di 1x PBS in un tubo di centrifuga da 15 ml.
  3. Preparare 500 mL di tampone di lavaggio aggiungendo 10 mL di FBS in una bottiglia da 500 mL di 1x PBS.
  4. Preparare 50 mL di tampone di permeabilizzazione in un tubo di centrifuga da 50 mL aggiungendo 0,5 mL di tritone X-100 al 10% al tampone di lavaggio di 49,5 mL preparato al punto 4.3.
  5. Preparare la soluzione di lavoro di tampone anticorpale / permeabilizzazione anti-SQSTM1 / p62-Alexa 488 (AF488) aggiungendo 5 μL di anti-SQSTM1 / p62-AF488 a 495 μl del tampone di permeabilizzazione effettuato in sTep 4.4. Assicurarsi che la concentrazione finale di anticorpi sia di 5 μg / mL.
    NOTA: Effettuare la soluzione di lavoro di buffer permeabilizzazione dell'anticorpo appena prima di aggiungerla al campione. Proteggere la soluzione dalla luce.
  6. Preparare la soluzione di lavoro del tampone anti-LC3 / permeabilizzazione del mouse aggiungendo 5 μL di mouse anti-LC3 a 495 μL del tampone di permeabilizzazione effettuato nel punto 4.4. Assicurarsi che la concentrazione finale degli anticorpi sia di 20 μg / mL.
    NOTA: Fare soluzioni di lavoro permeabilizzanti anticorpali appena prima di aggiungerlo al campione. Proteggere la soluzione dalla luce.
  7. Preparare la soluzione di lavoro di tampone anti-mouse-Alexa 647 (AF647) / permeabilizzazione aggiungendo 5 μL di anti-mouse-IgG di asina di etichetta AF647 a 495 μL del tampone di permeabilizzazione effettuato nel punto 4.4. Assicurarsi che la concentrazione finale degli anticorpi sia di 20 μg / mL.
    NOTA: Effettuare la soluzione di lavoro permeabilizzazione dell'anticorpo appena prima di aggiungerla al campione. Proteggi tLa soluzione dalla luce.
  8. Preparare la soluzione di lavoro del tampone anti-umano CD107a (LAMP1) -PE anti-umano / permeabilizzazione aggiungendo 25 μL di anti-CD107a (LAMP1) -PE a 475 μl del tampone di permeabilizzazione effettuato al punto 4.4. Assicurarsi che la concentrazione finale degli anticorpi sia di 21 μg / ml.
    NOTA: Effettuare la soluzione di lavoro permeabilizzazione dell'anticorpo appena prima di aggiungerla al campione. Proteggere la soluzione dalla luce.
  9. Preparare la macchia nucleare 10x DAPI aggiungendo 4 μL di 5 mg / mL DAPI e 100 μl di 10% tritone X-100 a 896 μL di 1x PBS.

5. Etichettare le celle Jurkat con LC3, LAMP1 e p62

  1. Rimuovere 2 x 10 6 celle per campione (contare le celle come nel punto 2.2). Posizionare ogni campione in un tubo da centrifuga da 15 ml etichettato con il nome del campione appropriato ( cioè Controllo, Controllo + Chloroquine, Fame o Starved + Chloroquine).
    1. Aggiungere il tampone di lavaggio in modo che lìIl volume totale di 15 ml in ogni tubo di centrifuga da 15 ml. Centrifugare i campioni a 250 xg per 10 min. Aspirare il surnatante.
  2. Aggiungere 100 μl di soluzione di fissazione di formalina al 4% a ciascuna pellicola cellulare. Riposizionare pipettando verso l'alto e in basso con una pipetta P200. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Durante la fase di fissaggio, trasferire i campioni su tubi di microcentrifuga in polipropilene silicati etichettati.
    NOTA: non sovraccaricare le celle; Ciò potrebbe provocare risultati di etichettatura poveri.
  3. Dopo la fase di fissazione di 10 minuti, aggiungere a ciascun campione 1 ml di tampone di lavaggio. Pipette su e giù con una pipetta P1000 per mescolare il campione. Centrifugare a 250 xg per 5 min. Aspirare il surnatante.
  4. Aggiungere a ciascun campione 100 μL di soluzione anticorpi anti-SQSTM1 / p62 - AF488 permeabilizzazione. Riposizionare pipettando verso l'alto e in basso con una pipetta P200. Incubare per 30 minuti al buio a temperatura ambiente.
  5. Lavare le cellule aggiungendo 1 mL diTampone di permeabilizzazione ad ogni campione. Pipette su e giù con una pipetta P1000 per mescolare il campione. Centrifugare a 250 xg per 5 min. Aspirare il surnatante.
  6. Ripetere i passaggi 5.4-5.5 per ciascuna delle soluzioni di lavoro anticorpali.
    NOTA: Le soluzioni di lavoro anticorpali sono la soluzione di lavoro del tampone anti-LC3 / permeabilizzazione del mouse, la soluzione di lavoro di tampone anti-mouse-AF647 / permeabilizzazione dell'asino e la soluzione di lavoro del tampone anti-umano permeabilizzazione CD107a (LAMP1). Ogni anticorpo deve essere fatto separatamente e nell'ordine elencato. L'ordine è stato scelto per minimizzare la reattività incrociata indesiderata tra gli anticorpi.
  7. Aggiungere 100 μl di soluzione formalina al 1%. Riposizionare pipettando verso l'alto e in basso con una pipetta P200. Aggiungere 10 μL della macchia nucleare 10x DAPI ad ogni campione. Vortice leggermente ogni campione da miscelare. Incubare per 10 minuti al buio a temperatura ambiente prima di eseguire uno dei campioni dello strumento.
    NOTA: A questo punto, il campione può bEseguire sul MIFC o conservare protetti dalla luce a 2-8 ° C per una settimana.

6. Etichettatura dei controlli monocromatici

  1. Per ciascun controllo singolo colore (cioè, AF488, PE, AF647, e DAPI), da 1 x 10 6 cellule Jurkat, che possono essere da qualsiasi delle popolazioni campione. Mettete 1 x 10 6 cellule in tubi di centrifuga da 15 ml etichettati come AF488, PE, AF647 o DAPI.
  2. Aggiungere un tampone di lavaggio in modo da avere un volume totale di 15 mL in ogni tubo centrifuga da 15 mL. Centrifugare i campioni a 250 xg per 10 min. Aspirare il surnatante.
  3. Aggiungere 100 μL di tampone di lavaggio ai tubi AF488, PE e AF647.
    NOTA: Per il tubo DAPI, andare al punto 6.8.
    1. Riposizionare pipettando verso l'alto e in basso con una pipetta P200. Trasferire in tubi da 1,5 ml.
  4. Aggiungere 5 μl di anti-CD45-AF488, anti-CD45-PE o anti-CD45-AF647 rispettivamente ai tubi AF488, PE o AF647. Mescolare dal vortexing lightly.
  5. Incubare i tubi AF488, PE e AF647 per 30 minuti al buio a temperatura ambiente.
    NOTA: possono essere usati altri marcatori, ad esempio gli anticorpi LC3, p62 e LAMP-1 anziché anticorpi anti-CD45. Tuttavia, CD45 è un indicatore affidabile per i controlli monocromatici.
  6. Lavare le celle AF488, PE e AF647 aggiungendo 1 mL di tampone di lavaggio ad ogni campione.
    1. Pipette su e giù con una pipetta P1000 per mescolare il campione. Centrifugare a 250 xg per 5 min. Aspirare il surnatante.
  7. Aggiungere 100 μl di soluzione formalina al 1%. Riposizionare pipettando verso l'alto e in basso con una pipetta P200.
    NOTA: A questo punto il campione può essere eseguito sul MIFC o conservato protetto dalla luce a 2-8 ° C per una settimana.
  8. Aggiungere 100 μl di soluzione di fissazione di formalina al 1% al tubo DAPI.
    1. Riposizionare pipettando verso l'alto e in basso con una pipetta P200. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
    2. Aggiungi 101; L di 10x DAPI nucleare macchia al campione DAPI. Vortice leggermente per mescolare. Incubare per 10 minuti al buio a temperatura ambiente prima di eseguire lo strumento.
      NOTA: A questo punto il campione può essere eseguito sul MIFC o conservato protetto dalla luce a 2-8 ° C per una settimana.

7. Avvio e calibrazione del MIFC

  1. Verificare che i contenitori del rivestimento, del reagente di calibrazione del sistema (vedi tabella dei materiali ), del debubbler, dei detergenti e dei contenitori di sterilizzazione siano pieni e il serbatoio di scarico sia vuoto. In caso contrario, riempire i contenitori e vuotare il serbatoio di scarico.
  2. Accendere il sistema e fare doppio clic sull'icona del software (vedere la tabella del materiale s) per avviare l'applicazione; Questo avvierà il software MIFC.
  3. Fare clic sul pulsante Avvio e assicurarsi che sia selezionato Avvia tutte le calibrazioni e test . Questo farà scorrere il sistema, il guaina di carico, il reagente di calibrazione del sistema,E calibrare il sistema.

8. Eseguire i campioni ei controlli monocromatici sul MIFC

  1. Caricare il modello predefinito andando alla scheda File e selezionando Load Default Template .
    NOTA: Il modello predefinito contiene i pixel di massima pixel pixel.
  2. Accendere i laser a 488 nm, 405 nm, 642 nm e SSC facendo clic sui rispettivi pulsanti. Impostare la potenza del laser inserendo la potenza desiderata accanto a ciascun pulsante laser. Vedere la Figura 1 .
    NOTA: Per questo esperimento, le potenze laser sono rispettivamente di 200 mW, 20 mW, 150 mW e 5 mW (Ch06) per i 488 nm, 405 nm, 642 nm e SSC. L'ingrandimento del modello predefinito MIFC impostato su 40X, la sensibilità predefinita è Ciao e tutti i canali sono abilitati.
  3. Confermare che il cursore di ingrandimento sia impostato su 40X, la modalità ad alta sensibilità sia selezionata e tutti i canali si trovano nella galleria di immagini; Figura 1 mostra le impostazioni degli strumenti utilizzati in questo esperimento.
  4. Caricare il campione "Starved + Chloroquine" facendo clic sul pulsante Load e caricando il tubo da 1,5 ml sullo strumento.
    NOTA: Questo campione sperimentale dovrebbe avere il segnale più alto di tutti i campioni per AF488, PE e AF647 (il segnale DAPI dovrebbe avere circa la stessa forza del segnale per tutti i campioni sperimentali, incluso il campione "Starved + Chloroquine").
  5. Utilizzare il campione "Starved + Chloroquine" per verificare che siano impostati i potenziali laser per i laser a 488 nm, 405 nm, 642 nm e SSC. Utilizzare i grafici a punti pixel massimi del modello predefinito per regolare le potenze laser in modo che i segnali siano forti ma non raggiungano un valore massimo di pixel pari a 4.096, che satura la telecamera CCD sullo strumento. Utilizzare questa impostazione laser per tutti i campioni sperimentali.
  6. Fai clic sull'icona Create Dot Plots per creare un nuovo plot di punti. Seleziona "Area_M01 "sull'asse X e" Aspect Ratio_M01 "sull'asse Y per la popolazione" tutto ", fare clic sull'icona della regione Crea poligono, tracciare una regione intorno alle celle.
    NOTA: Gli utenti possono aggiungere altri diagrammi e regioni per limitare le celle da raccogliere. Una trama aggiuntiva comune per aggiungere sarebbe Gradient RMS per identificare le celle che sono a fuoco.
  7. Impostare i parametri di acquisizione. Specificare il nome del file e la cartella di destinazione, modificare il numero di eventi a "5.000" e selezionare la popolazione di raccolta "Cell". Fare clic sul pulsante Acquisisci per acquisire il file. Dopo aver raccolto il file, restituite il campione facendo clic sul pulsante Return . Rimuovere il tubo di campionamento dallo strumento.
  8. Per i tre campioni successivi ("Starved", "Control" e "Control + Chloroquine") caricare il campione, immettere il nome del campione, acquisire il campione e restituire il campione utilizzando le stesse impostazioniPer il campione "Starved + Chloroquine", sopra.
  9. Dopo che i campioni sono stati acquisiti, eseguire i campioni di controllo monocromatico e acquisire i dati in modo che sia possibile effettuare una matrice di compensazione. Spegnere il laser SSC facendo clic sul pulsante SSC . Disattivare i canali luminosi cliccando sul pulsante Brightfield e selezionando OFF .
    NOTA: se i canali sono stati rimossi dalla galleria immagini per l'acquisizione di campioni sperimentali, riattivare tutti i canali. In alternativa, i controlli monocromatici possono essere acquisiti facendo clic sulla scheda Compensi e selezionando Crea matrice ; Questo apre la procedura guidata di compensazione, che passerà attraverso la fase di raccolta di file e di una matrice di compensazione.
  10. Caricare il controllo monocromatico DAPI facendo clic sul pulsante Load e caricando il tubo da 1,5 mL nello strumento. Immettere il nome del campione (solo DAPI), impostare la popolazione di raccolta in "Tutti" e modificare il numero di eventiS a "500".
    1. Fai clic sul pulsante Acquisisci per acquisire il file di controllo monocromatico.
    2. Una volta completata la raccolta dei file, restituisci il campione facendo clic sul pulsante Ritorna . Rimuovere il tubo di campionamento dallo strumento.
    3. Dopo il campione DAPI, caricare il 10% di candeggina proprio come un campione facendo clic sul pulsante Load e caricando 100 μl di candeggina del 10% in un tubo da 1,5 ml. Lasciate che il campione venga eseguito per ~ 15 s. Questo rimuoverà qualsiasi residuo DAPI dal tubo.
    4. Eseguire 100 μL di 1x PBS, come fatto in 8.10.3, per rimuovere il candeggiante residuo del 10%. Lo strumento è pronto per eseguire i controlli monocromatici AF488, PE e AF647.
    5. Ripetere i passaggi 8.10-8.10.2 per ciascuno dei controlli monocromatici (ad esempio, AF488, PE e AF647).
      NOTA: Non è necessario eseguire il candeggiamento del 10% o il PBS tra questi campioni, solo dopo il controllo monocromatico DAPI.

9. Analisi dei dati nel MIFC AnSoftware di alysis

  1. Avviare il software di analisi MIFC (vedere la tabella dei materiali ).
  2. Fare clic su Start Analysis per avviare la Creazione guidata file aperto . Selezionare il file di dati da aprire facendo clic sul file immagine grezzo "Starved + Chloroquine" (.rif). Selezionare il file e fare clic sul pulsante Apri . Fare clic su Avanti .
    1. Applicare la compensazione. Selezionare una matrice di compensazione precedentemente creata e fare clic su Avanti . In alternativa, crea una nuova matrice di compensazione facendo clic sul pulsante Nuovo matrice .
      NOTA: i passaggi 9.2.1.1-9.2.1.2 sono i passaggi per creare una nuova matrice.
      1. Aggiungere i file di controllo a colori singoli (ad esempio, solo DAPI , solo AF488, solo PE e solo AF647) nell'elenco File di controllo facendo clic su Aggiungi file , selezionando i file e facendo clic sul pulsante Apri . Fare clic su Avanti .
      2. La finestra Crea matrice di compensazione verrà visualizzata per questo esperimento. assicuE selezionare Ch02, Ch03, Ch07 e Ch11 e fare clic su Avanti . Verrà creata la matrice di compensazione. Fare clic su Fine per salvare la matrice di compensazione. Aggiungere il file di compensazione all'Aggiunta guidata file e fare clic su Avanti .
    2. Applicare il modello di analisi. A questo punto non esiste alcun modello di analisi da applicare, quindi fare clic su Avanti .
      NOTA: per gli altri file sperimentali, questo file "Starved + Chloroquine.daf" può essere utilizzato come modello.
    3. Nome del file (i nomi di file corrispondono ai nomi "rif" generati automaticamente) e fare clic su Avanti . Impostare le proprietà di visualizzazione delle immagini selezionando i canali "02", "03", "07" e "11"; Vengono selezionati i canali 01, 06 e 09. Fare clic su Avanti .
  3. Al termine della Creazione guidata file aperta , selezionare la procedura guidata Apoptosis . Fai clic sull'icona di Apoptosis Wizard e poi suIl pulsante Seleziona guidata per aprire la Creazione guidata Apoptosis .
    1. Selezionare il canale di immagine nucleare (Ch07) e fare clic su Avanti . Porta le celle in ottima concentrazione. Fai clic sull'icona della regione Crea riga e disegna una regione sul Gradient RMS_M01_Ch01 da 60 a 90. Digitare questa regione "Focus", fare clic su OK e fare clic su Avanti .
    2. Porta le singole celle. Fai clic sull'icona della regione Crea poligono . Disegna una regione intorno alle singole celle, denomina la regione "Single", fai clic su OK e fai clic su Avanti . Fai clic su No per "Desideri analizzare le sotto-popolazioni?"
    3. Porta le cellule nucleate. Fai clic sull'icona della regione Crea riga e disegna una regione che include tutte le cellule nucleate. Nome della regione "Nucleated". Scegliere OK e Avanti .
    4. Porta le cellule apoptotiche. Fai clic sull'icona della regione Crea poligono . Disegnare una regione intorno alle cellule apoptotiche; Queste sono le celluleCon un basso livello nucleare Area_T50% e un elevato contrasto luminoso. Fare clic su Fine . Aggiungere una seconda regione cliccando sull'icona Crea poligono regione e disegnando una regione intorno alle celle non apoptotiche; Chiamare questa regione "Cellule".
  4. Selezionare le celle positive per LAMP1, p62 e LC3. Fai clic sull'icona Building Blocks , seleziona Fluorescence Positives - One Color e seleziona la popolazione "Cells" e Intensity_MC_Ch03 . Etichetta l'intensità X-Axis LAMP1. Disegnare una regione che include le celle con intensità superiore a 10.000 facendo clic sull'icona della regione Crea linea e disegnando la regione. Etichetta questa regione "LAMP1 +." Seguire lo stesso procedimento descritto in 9.4 per selezionare le celle positive per p62 e LC3.
    1. Per p62 + selezionare la popolazione "LAMP1 +" e Intensity_MC_Ch02 . Etichetta l'intensità X-Axis "p62" e la regione delle celle p62 + "LAMP1 + / p62 +".; Per il LC3 +, selezionare la popolazione "LAMP1 + / p62 +" e Intensity_MC_Ch11. Etichetta l'intensità X-Axis "Intensità LC3" e la regione delle cellule LC3 + "LAMP1 + / p62 + / LC3 +". Utilizza questa popolazione "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" per il resto dell'analisi.
  5. Crea una funzione di conteggio dei punti per contare i punti LC3.
    NOTA: Questo dovrebbe essere creato utilizzando il campione "Starved + Chloroquine".
    1. Fare clic sulla scheda Analisi e selezionare Maschera . Fare clic sul pulsante Nuovo e quindi sul pulsante Funzione . In Funzione , selezionare Peak ; Maschera , selezionare M11 ; E Canale , selezionare Ch11 . Impostare il rapporto Spot a Cell Background a 4 . Fare clic su OK per chiudere la finestra Funzione maschera di protezione e OK per aggiungerlo all'elenco Maschera . Fare clic su Chiudi per uscire dalla Gestione maschera .
    2. Fare clic sulla scheda Analisi e selezionare Caratteristiche. Fare clic sul pulsante Nuovo . In Tipo di funzionalità , seleziona Spot Count e sotto Maschera , selezionare Peak (M11, Ch11, Bright, 4). Digitare "Spot Count LC3" per il nome e fare clic su OK e chiudi per uscire dal Gestore funzionalità .
      NOTA: è anche possibile utilizzare la procedura guidata Spot per creare una funzione di conteggio spot. La caratteristica di conteggio spot utilizzata in questo esperimento potrebbe non essere appropriata per altri esperimenti e / o linee cellulari. L'utente deve testare diverse maschere / funzioni di conteggio per decidere su una maschera / funzionalità per un set di dati specifico. Pugsley 2017 ha ulteriori dettagli sul conteggio dei punti utilizzando il software di analisi MIFC 26 .
    3. Fai clic sull'icona Nuovo istogramma . Selezionare la popolazione "LAMP1 + / p62 + / LC3 +". Selezionare la funzione Spot Count LC3 e fare clic su OK .
  6. Creare la funzionalità BDC3.
    1. CLeccate la scheda Analisi e selezionate Funzioni . Fare clic sul pulsante Nuovo . In Tipo di funzionalità , selezionare Colocalizzazione luminosa dettagli 3 ; Maschera , selezionare MC ; Immagine 1 , selezionare Ch02 (p62); Immagine 2 , selezionare Ch03 (LAMP1); E io mage 3 , selezionare Ch11 (LC3). Digitare "BDC3 p62 / LAMP1 / LC3" per il Nome e fare clic su OK e Chiudi per uscire da Feature Manager .
    2. Fai clic sull'icona Nuovo istogramma . Selezionare la popolazione "LAMP1 + / p62 + / LC3 +". Selezionare la funzione BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 e fare clic su OK .
  7. Fai clic sull'icona New Scatterplot . Selezionare la popolazione "LAMP1 + / p62 + / LC3 +". Selezionare BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 per l'asse X. Selezionare la funzionalità Spot Count LC3 per l'asse Y. Fare clic su OK .
  8. Salvare thE file "Starved + Chloroquine". Fai clic su File e seleziona Salva file di analisi dati (.daf) . Fare clic su Salva e Sì per sostituire la versione precedente del file; Questo file può ora essere utilizzato come modello.
  9. Aprire il file "Control". Fai clic su File e quindi Apri . Selezionare il file "Control.rif" e fare clic su Apri . Selezionare la matrice di compensazione dal punto 9.2.1 e il file "Starved + Chloroquine.daf" come modello. Fare clic su OK .
  10. Creare regioni per l'accumulo di autofagosomia e l'accumulo di autolysosoma utilizzando il campione "Control" per impostare le regioni.
    1. Fai clic sull'icona della regione Crea rettangolo . Disegna una regione dalle coordinate X da -0,1 a 3 e le coordinate Y da 1,5 a -0,3. Denominare questa regione "Punti bassi". Clicca sul Crea un'icona della regione rettangolare . Disegnare una regione da coordinate X da -0,1 a 1 e coordinate YDa 17,5 a 1,5. Nome di questa regione "High Spot / Low BDC3".
    2. Fai clic sull'icona della regione Crea rettangolo. Disegna una regione dalle coordinate X da 1 a 3 e le coordinate Y da 17,5 a 1,5. Nome della regione "High Spots / High BDC3".
  11. Salvare il file "Control". Fai clic su File e seleziona Salva file di analisi dati (.daf ) . Fare clic su Salva e Sì per sostituire la versione precedente del file; Questo file può ora essere utilizzato come modello.
  12. Apri il file "Control + Chloroquine" facendo clic su File e quindi Apri . Selezionare il file "Control + Chloroquine.rif" e fare clic su Apri . Selezionare la matrice di compensazione dal punto 9.2.1 e il file "Control.daf" come modello. Fare clic su OK . Ripetere questo per i file "Starved" e "Starved + Chloroquine".
    NOTA: la funzione batch nel software di analisi può anche essere utilizzata per applicare la compensazioneMatrice e / o modello per gli altri file. La strategia di gating finale è mostrata in Figura 2 .

Risultati

Questo metodo di analisi utilizza molteplici funzionalità per assaggiare il flusso autofagico. Per comprendere appieno la trama bivariata finale, bisogna prima studiare le caratteristiche di analisi individuale. Il conteggio degli autofosomi è un modo logico per misurare l'autofagia; Tuttavia, la dimensione / forma / luminosità di LC3 puncta può variare drasticamente tra le celle. La variazione può rendere difficile il conteggio manuale di autofagozomi o l'utilizzo di una funzione spot-count nel software di analisi. Pertanto, nessuna funzione di conteggio dei punti sarà perfetta a causa di questa grande variabilità in autofosomi. Tuttavia, una buona funzione di conteggio dei punti funzionerà sulla maggior parte delle celle 26 . La figura 3 mostra esempi di maschera spot di LC3 puncta nelle celle Jurkat usando differenti maschere spot. La funzione di conteggio spot selezionata per questo set di dati è Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4, il che significa che la funzione di conteggio spot conta i punti che il peMaschera AK individuata all'interno del canale predefinito 11 maschera (M11) sul canale 11 (Ch11-LC3-AF647) con un rapporto di sfondo spot-to-cell 4 (Bright, 4). La Figura 4 mostra istogrammi di conteggio spot e immagini rappresentative per il conteggio spot medio per le cellule Control, Control + Chloroquine, Starved e Starved + Chloroquine Jurkat etichettate con anti-LC3-AF647. I conteggi spot di Controllo e Starving non sono significativamente diversi; Con l'aggiunta di clorochina, c'è una grande differenza nella media del Control + Chloroquine rispetto alla Starved + Chloroquine.

La prossima funzionalità da indagare è BDC3. BDC3 è una misura della co-localizzazione di tre marcatori / sonde, in questo caso, LC3, p62 e LAMP1. La Figura 5A - 5D mostra gli istogrammi BDC3 per le cellule di Control, Control + Chloroquine, Starved e Starved + Chloroquine Jurkat etichettate con anti-p62-AF488, Anti-LAMP1-PE e anti-LC3-AF647. C'è uno spostamento tra la media del Controllo e la media Starved, così come il Control + Chloroquine media alla media di Starved + Chloroquine. Tuttavia, guardando le immagini delle cellule dai punteggi medi di BDC3 nella figura 5E - 5H , c'è una maggiore differenza tra i campioni che gli istogrammi possono portare a credere. Questo perché BDC3 non prende in considerazione il numero di organi di autofagia che co-localizzano, con conseguente grande variabilità del numero di autofosomi per lo stesso punteggio BDC3. Nella maggior parte dei casi, vi sono sovrapposizioni tra tutte le tre sonde perché, anche a livelli basali, p62, LAMP1 e LC3 dovrebbero in una certa misura co-localizzare o risiedere in regioni simili nelle cellule. In contrasto, un esempio di tre sonde che non dovrebbero essere co-localizzate sono il colorante nucleare anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 e DAPI per il campione Starved + Chloroquine, mostrato in Figura 6.

Quando si combinano la funzione di conteggio dei punti e la funzione BDC3, è evidente la presenza di diverse sottopopolazioni che migliorano la capacità di distinguere tra i diversi campioni / condizioni. La figura 7 mostra la trama bivariata di conteggio spot di LC3 rispetto a BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 per i quattro campioni: Controllo, Controllo + Chloroquine, Fame e Starved + Chloroquine. Il campione di Controllo è stato utilizzato per impostare la strategia di gating per tre popolazioni: Low Spots, High Spots / Low BDC3 e High Spots / High BDC3. I campioni di controllo hanno dimostrato che più del 98% delle cellule avevano 1 o meno punti. Il limite tra le High Spots / Low BDC3 e High Spots / High BDC3 è stato impostato su un punteggio BDC3 di 1 perché più del 91% del campione di controllo ha ottenuto un punteggio BDC3 inferiore a 1. Un riepilogo dei risultati dei plotter bivariati È mostrato nella tabella 1 .

age = "1"> figure-results-1
Figura 1: Impostazione strumento MIFC. Uno screenshot delle impostazioni dello strumento MIFC utilizzato per questo esperimento descritto nel passaggio 8 del protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Analisi Software Gating Strategy. Uno screenshot dello schema di analisi del software di analisi, descritto nel passaggio 9 del protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Fig3.jpg "/>
Figura 3: Maschera Spot LC3. Le immagini delle cellule Jurkat e le maschere utilizzate per creare la funzione di conteggio spot. Sono mostrati i picchi (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright 2) , Bright, 5), Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 5, 3, 1) e Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 6, 2, 1). La maschera che ha funzionato meglio per tutte le celle mostrate era Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 4: istogrammi LC3 di conteggio dei punti. Utilizzando la funzione Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4 e gli istogrammi di conteggio spot LC3-AF647 per controllo ( A , azzurro), Control + ChloroquinE ( B , blu), Fame ( C , rosa) e Starved + Chloroquine ( D , rosso). I conteggi spot medi per Control, Control + Chloroquine, Starved e Starved + Chloroquine sono rispettivamente 0,07, 1,13, 0,10 e 2,77. Sono mostrati i controlli di controllo (punti E , 0), controllo + clorochina ( F , 1 spot), Starved ( G , 0 spot), e Starved + Chloroquine ( H , 3 spot). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 5: istogrammi BDC3 di p62 / LAMP1 / LC3. Istogrammi BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 perR Controllo ( A , azzurro), Control + Chloroquine ( B , blu), Fame ( C , rosa) e Starved + Chloroquine ( D , rosso). Il punteggio medio BDC3 per Controllo, Controllo + Chloroquine, Fame e Starved + Chloroquine è rispettivamente di 0,57, 0,82, 0,74 e 0,98. BF; P62-AF488 (verde); LAMP1-PE (giallo); LC3-AF647 (rosso); E un composito delle immagini p62-AF488, LAMP1-PE e LC3-AF647 di cellule rappresentative per il BDC3 medio sono mostrate per Control ( E ), Control + Chloroquine ( F ), Starved ( G ) e Starved + Chloroquine H ). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-5
Figura 6: istogrammi BDC3 di p62 / LC3 / DAPI per il campione Starved + Chloroquine. ( A ) L'istogramma BDC3 p62 / LC3 / DAPI per il campione Starved + Chloroquine è mostrato. Il punteggio medio BDC3 è 0,07. ( B ) BF; P62-AF488 (verde); LC3-AF647 (rosso); DAPI (blu); E un composito delle immagini p62-AF488, LC3-AF647 e DAPI delle cellule rappresentative per il BDC3 medio è mostrato per il campione Starved + Chloroquine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-6
Figura 7: Parti Bivariate di Count LC3 Spot Count nei confronti di BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( A ) Parti bivariate di punti LC3 contro BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 per le cellule di controllo, controllo + clorochina, fame e starved + Chloroquine Jurkat. ( B ) BF; P62-AF488 (verde); LAMP1-PE (giallo); LC3-AF647 (rosso); E un composito delle immagini p62-AF488, LAMP1-PE e LC3-AF647 provenienti da tre regioni ( cioè, punti bassi, alti punti / bassi BDC3 e High Spots / High BDC3) sono mostrati per il campione Starved + Chloroquine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Cell Count Bright Detail Colocalization 3 Medio Punto di conteggio LC3 Mean % Basso punto % Alto punto / basso BDC3 % Alto punto / alto BDC3
Controllo 439 0.57 0,07 98,2 1.8 0.0
Control + Chloroquine 1432 0.82 1.13 68,9 19.5 11.7
Starved 1204 0.74 0.10 98.4 0.6 1.0
Starved + Chloroquine 1811 0.98 2.77 32.1 36.9 31,0

Tabella 1: Sommario del conteggio di punti Jurkat LC3 contro BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 Bivariate Plot

Discussione

Quando si esegue questa analisi, ci sono alcune cose da considerare. È importante avere campioni di controllo appropriati. Per questo esperimento sono stati utilizzati due diversi controlli: Controllo e Controllo + Chloroquine. Il campione di controllo è stato utilizzato per impostare la soglia per le regioni. Rappresenta il livello basale dell'autofagia senza interrompere il degrado lisosomico ed è il controllo del campione di Starved. Tuttavia, il campione di controllo non è un controllo appropriato da confrontare con i risultati del campione di Starved + Chloroquine, in quanto il clorochina influisce sul campione di controllo. Pertanto, è stato necessario avere un campione Control + Chloroquine.

Prima di effettuare qualsiasi analisi per l'autofag, è importante analizzare / portare solo su singole celle che sono in messa a fuoco (ad esempio, gradiente RMS maggiore di 60), in quanto i risultati potrebbero essere influenzati se c'è più di una cella o le immagini sono sfocato. È fondamentale che l'autofagoEs e lisosomi sono al centro per il rilevamento corretto dei punti e l'analisi BDC3. Le cellule apoptotiche devono essere rimosse prima dell'analisi dell'autofagia, in quanto possono risultare incline e non devono essere incluse. Ci dovrebbe essere una colorazione appropriata per tutti e tre i marcatori (ad es. LC3, p62 e LAMP1). Ad esempio, tutti e tre i marcatori sono intracellulari e devono avere un segnale punctato; Se il segnale non è punctato, o se è sulla superficie della cella, la colorazione non sarebbe appropriata e l'esperimento / colorazione dovrebbe essere rifatta. Inoltre, affinché la BDC3 sia accurata, è fondamentale portare le celle che sono luminose per tutti e tre i marcatori fluorescenti di interesse. È necessario disporre di eventi positivi per impedire la misura di BDC3 su manufatti non specifici, artefatti di imaging e / o rumore. Ciò è cruciale, poiché BDC3 può potenzialmente amplificare gli artefatti che non sono veri segnali. Poiché BDC3 può essere eseguito solo su eventi luminosi positivi, molte celle potrebbero non essere incluse nell'analisi finale; Questo è especVale per le celle di controllo che non hanno alcuna accumulazione di LC3, p62 e / o LAMP1. Pertanto, una limitazione di questo test è che BDC3 esamina solo le cellule positive per tutti e tre i marker, che potrebbero non essere appropriati per tutti gli esperimenti di autofagia.

Come il BDS, che è stato precedentemente riportato 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , BDC3 da solo non tiene conto del numero di organismi di autofagia che co-localizzano, risultando in larga misura Di variabilità nel numero di autofosomi. Pertanto, l'approccio bivariato presentato da Rajan et al. era impiegato. Guardando le trame bivariate, si potrebbe chiedere seLe cellule devono essere positive per LC3, p62 e LAMP1; Perché ci sono tante cellule che hanno 0 punti? Questo perché il segnale LC3 potrebbe essere abbastanza luminoso per la co-localizzazione, ma potrebbe non soddisfare la soglia impostata dalla maschera di picco (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)) necessaria per essere considerata una individuare.

Il protocollo qui presentato ha usato il MIFC per contare puncta LC3 e la co-localizzazione di tre marcatori autofagia per misurare il flusso autofagico. In condizioni basali (campione di controllo), il numero di autofagosomi era basso e alcune cellule sono state trovate con "High Spots". Con l'aggiunta di clorochina, che inibisce la fusione di autosfosi / lisosomi, si è verificato un aumento del numero di macchie LC3. Dal momento che il lisosoma non è in grado di abbattere l'autofagogo e il p62, che risiede nell'autofago, ciò porta ad un aumento della co-localizzazione dell'accumulo di autolysosomi LC3, p62 e LAMP1. Questo effetto è stato amplificato sotto lo starvat nutrienteIone, che induce autofagia. Tuttavia, senza l'aggiunta di clorochina, non vi è stato un aumento significativo del numero di autofosomi, probabilmente a causa di un aumento del tasso di turnover autofagico. Quando le cellule sono state affamate in presenza di clorochina, vi è stato un aumento della co-localizzazione e il numero di autofosomi, che supporta la conclusione che la fame aumenta il flusso autofagico. EBSS è noto per essere un potente induttore di autofagia. Pertanto, si prevede che l'aumento sia grande. Se si utilizza un altro metodo, ad esempio l'induzione di farmaci, per indurre l'autofagia, la differenza tra i controlli e quelli trattati può essere più sottile.

Questo particolare protocollo è stato progettato per misurare l'autofagia nelle linee cellulari umane, ma il dosaggio potrebbe essere adattato ad altre specie passando ad anticorpi per quella particolare specie. Inoltre, il metodo di analisi potrebbe essere utilizzato per qualsiasi applicazione intracellulare che richiede la co-localizzazioneDi tre sonde / marcatori.

Dichiarazioni

Sono impiegato da MilliporeSigma, il produttore dell'immagine ImageStream di Amnis, che è stato utilizzato in questo studio.

Ringraziamenti

Vorrei ringraziare i miei colleghi a MilliporeSigma, Philip J. Morrissey e Sherree L. Friend, per il loro sostegno e la loro guida negli anni. Vorrei anche ringraziare Vidya Venkatachalam e Bryan R. Davidson per il loro aiuto con la funzionalità BDC3 nel software IDEAS , Ryan P. Jessup per contribuire a modificare questo manoscritto, Raymond Kong per aiuto nel giorno della ripresa e un ringraziamento speciale All'artista trucco Cynthia Xamonthiene.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provetta da centrifuga da 15 mLFalcon352096
Provetta da centrifuga da 50 mLFalcon352070
AF647 etichettato Donkey anti-Mouse - IgG InvitrogenA-31571Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-topo asino, Alexa Fluor 647. Concentrazione 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571
anti-umano CD107a-PE (LAMP1)BioLegend328607Clone H4A3. Concentrazione 400 µ g/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html
anti-umano CD45- AF488BioLegend304017Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html
anti-umano CD45- PE BioLegend304008Clone HI30.  http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html
anti-umano CD45-AF647 BioLegend304018Clone HI30.  http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html
Clone mAb anti-LC3 (umano) 4E12MBL International CorporationM152-3Clone 4E+12.  Concentrazione 2 mg/mL. https://www.mblintl.com/products/m152-3
Anticorpo anti-SQSTM1 / p62 [EPR4844] - Marcatore autofagosoma (Alexa Fluor 488)abcamab185015Clone EPR4844.  Concentrazione 0,5 mg/mL. http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html
Clorochina difosfato SaleSigma-AldrichC6628-25G
Detergente - Coltro di Clenz Beckman Coulter8546931Riempi il contenitore con 200 ml di detergente.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
DAPI Stain 5 mg/mLMilliporeSigma508741http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741
Debubbler - 70% IsopropanoloMilliporeSigma1.3704Riempire il contenitore con 200 ml di degorizzatore.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco 10xMilliporeSigmaBSS-2010-B  Ca++Mg++ Gratuito 
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco 1xMilliporeSigmaBSS-1006-BPBS Ca++Mg++ Free 
Soluzione salina bilanciata di Earle 1xGibco14155
Siero fetale bovinoHyCloneSH30071.03
Formaldeide, 10%, senza metanolo, Ultra PurePolysciences, Inc.04018Questo è ciò che viene utilizzato per la formalina al 4% e all'1%. ATTENZIONE: Formalina/Formaldeide tossica per inalazione e se ingerita. Irritante per gli occhi, il sistema respiratorio e la pelle. Può causare sensibilizzazione per inalazione o contatto con la pelle. Rischio di gravi danni agli occhi. Potenziale rischio di cancro. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Hanks' Soluzione salina bilanciata 1xGibco14175
Jurkat, clone E6-1 (ATCC TIB-152)ATCCTIB-152https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx
MEM aminoacidi non essenziali 100xHyCloneSH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark IIMilliporeSigma100220È stata utilizzata una fotocamera a 2 fotocamere ImageStreamX Mark II con i laser da 405 nm, 488 nm e 642 nm. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006
software di analisi MIFC - IDEAS 6.2MilliporeSigma100220Il software complementare al MIFC (ImageStreamX MKII).  Software IDEAS versione 6.2
MIFC - INSPIREMilliporeSigma100220Questo è il software che esegue il MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE versione 200.1.388.0
PE anti-umano CD107a (LAMP-1) Clone di anticorpi H4A3BioLegend328608
http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html Soluzione di penicilina/streptomicina/glutammina 100xHyCloneSV30082.1
Risciacquo - Acqua ultrapura o acqua deionizzataNANAPuoi usare qualsiasi acqua ultrapura o acqua deionizzata. Riempire il contenitore con 900 ml di risciacquo.
RPMI-1640 Medium 1xHyCloneSH30027.01
Guaina - PBSMilliporeSigmaBSS-1006-BQuesto è lo stesso della soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco 1X  Ca++MG++ gratuito. Riempire il contenitore con 900 ml di guaina.
Provette per microcentrifuga in polipropilene siliconatoFisherbrand02-681-320Fisherbran Provette per microcentrifuga siliconate a bassa ritenzione 1,5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936
Soluzione di piruvato di sodio (100 mM)Sterilizzatore HyCloneSH30239.01
- 0,4 - 0,7% IpocloritoVWRJT9416-1Si tratta di candeggina Clorox al 10% che può essere prodotta diluendo la candeggina Clorox con acqua. Riempire il contenitore con 200 ml di Sterilzer.
Reagente di calibrazione del sistema - SpeedBeadMilliporeSigma400041Ogni provetta contiene ~10 mL.  https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav 
Pallone T75Falcon353136
TRITON X-100, detergente PROTEIN GRADE, soluzione al 10%, Millipore filtrato sterileSigma648463-50MLhttp://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463
acqua, grado per colture cellulari HyCloneSH30529.03

Riferimenti

  1. Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).
  2. Zhang, X. J., Chen, S., Huang, K. X., Le, W. D. Why should autophagic flux be assessed? Acta Pharmacologica Sinica. 34, 595-599 (2013).
  3. Tanida, I., Takashi, U., Kominami, E. LC3 and Autophagy. Methods Mol Biol. 445, 77-88 (2008).
  4. Larsen, K. B., Lamark, T., Øvervatn, A., Harneshaug, I., Johansen, T., Bjørkøy, G. A reporter cell system to monitor autophagy based on p62/SQSTM1. Autophagy. 6 (6), 784-793 (2010).
  5. Demishtein, A., Porat, Z., Elazar, Z., Shvets, E. Applications of flow cytometry for measurement of autophagy. Methods. 75, 87-95 (2015).
  6. Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).
  7. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy. 8 (4), 445-544 (2012).
  8. Arsov, I., et al. BAC-mediated transgenic expression of fluorescent autophagic protein Beclin 1 reveals a role for Beclin 1 in lymphocyte development. Cell Death Differ. 15 (9), 1385-1395 (2008).
  9. Maloyan, A., Sayegh, J., Osinska, H., Chua, B. H., Robbins, J. Manipulation of death pathways in desmin-related cardiomyopathy. Circ Res. 106 (9), 1524-1532 (2010).
  10. Altman, B. J., et al. Autophagy is essential to suppress cell stress and to allow BCR-Abl-mediated leukemogenesis. Oncogene. 30 (16), 1855-1867 (2011).
  11. Suarez, A. L., Kong, R., George, T., He, L., Yue, Z., van Dyk, L. F. Gammaherpesvirus 68 infection of endothelial cells requires both host autophagy genes and viral oncogenes for optimal survival and persistence. J Virol. 85 (13), 6293-6308 (2011).
  12. Tra, T., et al. Autophagy in human embryonic stem cells. PLoS One. 6 (11), (2011).
  13. Yuan, N., et al. Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).
  14. Leveque-El Mouttie, L., et al. Autophagy is required for stem cell mobilization by G-CSF. Blood. 125 (19), 2933-2936 (2015).
  15. Watson, A. S., et al. Autophagy limits proliferation and glycolytic metabolism in acute myeloid leukemia. Cell Death Discov. 1, 15008(2015).
  16. Stranks, A. J., et al. Autophagy Controls Acquisition of Aging Features in Macrophages. J Innate Immun. 7 (4), 375-391 (2015).
  17. Clarke, A. J., et al. Autophagy is activated in systemic lupus erythematosus and required for plasmablast development. Ann Rheum Dis. 74 (5), 912-920 (2015).
  18. Warnes, G. Flow cytometric assays for the study of autophagy. Methods. 82, 21-28 (2015).
  19. Bjørkøy, G., et al. p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death. J Cell Biol. 171 (4), 603-614 (2005).
  20. Phadwal, K., et al. A novel method for autophagy detection in primary cells: Impaired levels of macroautophagy in immunosenescent T cells. Autophagy. 8 (4), 677-689 (2012).
  21. Rajan, R., Karbowniczek, M., Pugsley, H. R., Sabnani, M. K., Astrinidis, A., La-Beck, N. M. Quantifying autophagosomes and autolysosomes in cells using imaging flow cytometry. Cytometry A. 87 (5), 451-458 (2015).
  22. Kwok, A. S., et al. HspB8 mutation causing hereditary distal motor neuropathy impairs lysosomal delivery of autophagosomes. J Neurochem. 119 (6), 1155-1161 (2011).
  23. Lopez-Herrera, G., et al. Deleterious Mutations in LRBA Are Associated with a Syndrome of Immune Deficiency and Autoimmunity. Am J Hum Genet. 90 (6), 986-1001 (2012).
  24. Pike, L. R., Phadwal, K., Simon, A. K., Harris, A. L. ATF4 orchestrates a program of BH3-only protein expression in severe hypoxia. Mol Biol Rep. 39 (12), 10811-10822 (2012).
  25. Pike, L. R., et al. Transcriptional up-regulation of ULK1 by ATF4 contributes to cancer cell survival. Biochem J. 449 (2), 389-400 (2013).
  26. Pugsley, H. R. Quantifying autophagy: Measuring LC3 puncta and autolysosome formation in cells using multispectral imaging flow cytometry. Methods. 112, 147-156 (2017).
  27. IDEAS. Image Data Exploration and Analysis Software User's Manual Version 6.2. , (2015).

Ristampe e permessi

Esplora altri articoli

Colocalizzazione di LC3colocalizzazione di p62colocalizzazione di LAMP1marcatori dell'autofagiaquantificazione dei puncta di LC3microscopia a immunofluorescenzamarcatori lisosomiali
Valutare il flusso autofagico misurando LC3, p62 e LAMP1 Co-localizzazione usando la citometria del flusso di imaging multispettrale
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.