Isolamento di proteine ​​filamentose intermedie da tessuti multipli di topo per studiare modificazioni post-traduzionali associate all'invecchiamento

Summary

In questo metodo, presentiamo procedure biochimiche per l'isolamento rapido ed efficace delle proteine ​​del filamento intermedio (IF) dai tessuti multipli del topo. Gli IF isolati possono essere utilizzati per studiare i cambiamenti nelle modificazioni post-traslazionali mediante spettrometria di massa e altri dosaggi biochimici.

Abstract

I filamenti intermedi (IFs), insieme ai filamenti e ai microtubuli attinici, formano il citoscheletro - elemento strutturale critico di ogni cellula. IFs funzionanti normalmente forniscono le cellule con meccaniche e resistenza allo stress, mentre un citoscheletro IF disfunzionale compromette la salute cellulare e è stato associato a molte malattie umane. Le modificazioni post-traduzionali (PTMs) regolano criticamente la dinamica IF in risposta a cambiamenti fisiologici e in condizioni di stress. Pertanto, la capacità di monitorare i cambiamenti nella firma PTM di IF può contribuire a una migliore comprensione funzionale e, in ultima analisi, del sistema IF come risposta responsabile dello stress durante le lesioni cellulari. Tuttavia, il gran numero di proteine ​​IF, codificate da più di 70 geni individuali e espresse in maniera dipendente dal tessuto, è una sfida importante nell'eliminare l'importanza relativa di diversi PTM. A tal fine, metodi che consentono il monitoraggio di PTM sulle proteine ​​IFSu un livello organizzativo, piuttosto che per i membri isolati della famiglia, può accelerare il progresso della ricerca in questo settore. Qui presentiamo metodi biochimici per l'isolamento della frazione totale resistente al detergente e resistente ai detergenti delle proteine ​​IF da 9 diversi tessuti del topo (cervello, cuore, polmone, fegato, piccolo intestino, intestino, pancreas, rene e milza). Inoltre dimostriamo un protocollo ottimizzato per il rapido isolamento delle proteine ​​IF utilizzando la matrice di lysing e l'omogeneizzazione automatizzata di diversi tessuti del topo. Il protocollo automatizzato è utile per profilare gli IF in esperimenti con un elevato volume di campioni (come ad esempio nei modelli di malattia che coinvolgono più animali e gruppi sperimentali). I campioni risultanti possono essere utilizzati per varie analisi a valle, tra cui la profilazione PTM basata sulla spettrometria di massa. Utilizzando questi metodi, forniamo nuovi dati per dimostrare che le proteine ​​IF nei diversi tessuti del topo (cervello e fegato) subiscono cambiamenti paralleli rispetto al loro espressoLivelli di sione e PTM durante l'invecchiamento.

Introduction

Gli IF sono una famiglia di proteine ​​che sono umane codificate da 73 geni e sono classificate in sei tipi principali: i tipi I-IV sono citoplasmatici ( ad esempio cheratine epiteliali e capelli (K), miocite desmin, neurofilamenti, proteina acido fibrillare gliale (GFAP) e altri); Tipo V sono i lamini nucleari; E il tipo VI sono IF nella lente di occhio ¹ . In termini di organizzazione molecolare, le proteine ​​IF hanno tre domini comuni: un dominio "rod" a spirale a spirale altamente conservato e domini globali "testa" e "tail". IF si assemblano per formare precursori di filamenti brevi, che vengono infine incorporati in filam....

Protocol

Il protocollo è approvato e svolto in conformità con il comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) presso l'Università della Carolina del Nord.

1. Preparativi

1. Preparare il tampone Triton-X (1% Triton X-100, 5 mM di acido etilendiammina-tetraacetico (EDTA), portare il volume in soluzione salina fosfata (PBS), pH 7,4). Per ottenere 500 mL: mescolare 5 mL ciascuno di Triton X-100 e 500 mM EDTA in 490 mL di PBS, pH 7,4. Conservare la soluzione tampone Triton-X a 4 ° C.
2. Preparare il bucato di sale elevato (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 140 mM NaCl, 1,5 M KCl, 5 mM EDTA, 0,5% Triton X-100, portare volume in doppia distil....

Results

Un nuovo metodo rapido per l'estrazione elevata di proteine ​​IF dai diversi tessuti del topo usando la matrice di lysazione.

Il metodo tradizionale ^{25 , 26} di isolare la maggior parte della frazione proteica filamentosa intermedia dal tessuto epiteliale è stato modificato qui per includere 9 diversi organi e una .......

Discussion

I metodi che permettono la caratterizzazione biochimica delle proteine ​​IF possono essere utili per comprendere numerosi fenomeni patofisiologici nei sistemi mammiferi, in quanto le proteine ​​IF sono entrambi marcatori e modulatori dello stress cellulare e del tessuto ²⁹ . Il principio dietro il metodo attuale si basa sulle procedure iniziali sviluppate negli anni '70 e '80 per isolare, separare e ricostituire proteine ​​IF dalle cellule e dai tessuti, generalmente impiegando soluzioni .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dynabeads Protein G	ThermoFisher Scientific	10009	perle di immunoprecipitazione
PBS	ThermoFisher Scientific	10010049	per tamponi
Purelink RNA mini kit	ThermoFisher Scientific	12183018	l'estrazione dell'RNA dal tessuto
Purelink DNAse set ThermoFisher	Scientific	12185010A	su colonna Digestione
Magnete Dynamag-2	ThermoFisher Scientific	12321D	per l'uso con dynabeads
Reagente colorante GelCode Blue ThermoFisher	Scientific	24592	Colorazione gel compatibile con la spettrometria di massa
Pierce ECL Western Blotting Substrato	ThermoFisher Scientific	32106	per l'uso in western blot
Kit di trascrizione inversa cDNA ad alta capacità	ThermoFisher Scientific	4368813	per l'uso nell'analisi dell'espressione genica
Sistema PCR Proflex 3 x 32 pozzetti	PCR	4484073	ThermoFisher Scientific
Membrana di trasferimento PVDF	ThermoFisher Scientific	88520	per western blot
Power Up SYBR master mix	ThermoFisher Scientific	A25778	per analisi qPCR
Soluzione RNAlater	ThermoFisher Scientific	AM7020	per la conservazione dei tessuti prima dell'isolamento dell'RNA
Novex 4-20% Tris Glycine Gel	ThermoFisher Scientific	XP04205BOX	Gel proteico prefabbricato
Anti-cheratina 8 anticorpo (TS1)	ThermoFisher Scientific	MA514428	per la rilevazione di western blot di K8
Anti-Vimentina	ThermoFisher Scientific	MA511883	per la rilevazione di western blot di vimentina
Tris Glycine Transfer Buffer (25x)	ThermoFisher Scientific	LC3675	per il trasferimento a umido di gel proteici
2x SDS Sample Buffer	ThermoFisher Scientific	LC2676	per la preparazione campioni di gel proteico
Tris Glycine SDS Running Buffer (10x)	ThermoFisher Scientific	LC26755	per la corsa di gel proteici
Perle di lisi - Matrix D	MP Biomedicals	116913100	Perle di lisi e provette per matrice per la disgregazione dei tessuti e l'estrazione dell'RNA
Perle di lisi - Matrix SS	MP Biomedicals	116921100	Perle di lisi e provette per matrici per la disgregazione dei tessuti e l'estrazione di proteine
Spettrofotometro NanoDrop Lite	ThermoFisher Scientific	ND-LITE	Misura di proteine e acidi nucleici
Omogeneizzatore Precellys 24	Bertin	Instruments EQ03119	Omogeneizzatore tissutale automatizzato