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Articolo metodologico

Isolamento di proteine ​​filamentose intermedie da tessuti multipli di topo per studiare modificazioni post-traduzionali associate all'invecchiamento

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DOI:

10.3791/55655

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18 maggio 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, School of Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

In questo articolo

Sommario

In questo metodo, presentiamo procedure biochimiche per l'isolamento rapido ed efficace delle proteine ​​del filamento intermedio (IF) dai tessuti multipli del topo. Gli IF isolati possono essere utilizzati per studiare i cambiamenti nelle modificazioni post-traslazionali mediante spettrometria di massa e altri dosaggi biochimici.

Abstract

I filamenti intermedi (IFs), insieme ai filamenti e ai microtubuli attinici, formano il citoscheletro - elemento strutturale critico di ogni cellula. IFs funzionanti normalmente forniscono le cellule con meccaniche e resistenza allo stress, mentre un citoscheletro IF disfunzionale compromette la salute cellulare e è stato associato a molte malattie umane. Le modificazioni post-traduzionali (PTMs) regolano criticamente la dinamica IF in risposta a cambiamenti fisiologici e in condizioni di stress. Pertanto, la capacità di monitorare i cambiamenti nella firma PTM di IF può contribuire a una migliore comprensione funzionale e, in ultima analisi, del sistema IF come risposta responsabile dello stress durante le lesioni cellulari. Tuttavia, il gran numero di proteine ​​IF, codificate da più di 70 geni individuali e espresse in maniera dipendente dal tessuto, è una sfida importante nell'eliminare l'importanza relativa di diversi PTM. A tal fine, metodi che consentono il monitoraggio di PTM sulle proteine ​​IFSu un livello organizzativo, piuttosto che per i membri isolati della famiglia, può accelerare il progresso della ricerca in questo settore. Qui presentiamo metodi biochimici per l'isolamento della frazione totale resistente al detergente e resistente ai detergenti delle proteine ​​IF da 9 diversi tessuti del topo (cervello, cuore, polmone, fegato, piccolo intestino, intestino, pancreas, rene e milza). Inoltre dimostriamo un protocollo ottimizzato per il rapido isolamento delle proteine ​​IF utilizzando la matrice di lysing e l'omogeneizzazione automatizzata di diversi tessuti del topo. Il protocollo automatizzato è utile per profilare gli IF in esperimenti con un elevato volume di campioni (come ad esempio nei modelli di malattia che coinvolgono più animali e gruppi sperimentali). I campioni risultanti possono essere utilizzati per varie analisi a valle, tra cui la profilazione PTM basata sulla spettrometria di massa. Utilizzando questi metodi, forniamo nuovi dati per dimostrare che le proteine ​​IF nei diversi tessuti del topo (cervello e fegato) subiscono cambiamenti paralleli rispetto al loro espressoLivelli di sione e PTM durante l'invecchiamento.

Introduzione

Gli IF sono una famiglia di proteine ​​che sono umane codificate da 73 geni e sono classificate in sei tipi principali: i tipi I-IV sono citoplasmatici ( ad esempio cheratine epiteliali e capelli (K), miocite desmin, neurofilamenti, proteina acido fibrillare gliale (GFAP) e altri); Tipo V sono i lamini nucleari; E il tipo VI sono IF nella lente di occhio 1 . In termini di organizzazione molecolare, le proteine ​​IF hanno tre domini comuni: un dominio "rod" a spirale a spirale altamente conservato e domini globali "testa" e "tail". IF si assemblano per formare precursori di filamenti brevi, che vengono infine incorporati in filamenti maturi che formano strutture dinamiche citoscheletriche e nucleoscheletriche coinvolte nella protezione meccanica 2 , stress sensing 3 , 4 , regolazione della trascrizione 5 e crescita e altre funzioni cellulari critiche"> 1 , 6 , 7 .

L'importanza funzionale del sistema IF è evidenziata dall'esistenza di molte malattie umane causate da mutazioni missense nei geni IF, comprese le neuropatie, le miopatie, i disturbi della fragilità cutanea, le disfunzioni metaboliche e le sindromi di invecchiamento precoce 8 . Alcune mutazioni del gene IF non causano, ma predispongono i loro carrier alla progressione della malattia, come le semplici keratine epiteliali nella malattia epatica 9 . Quest'ultima è dovuta alle funzioni critiche di protezione dello stress di IF in epitelio. Le IF sono in genere tra le proteine ​​cellulari più abbondanti in condizioni basali, ma sono inoltre fortemente indotte durante vari tipi di stress 10 . Ad esempio, studi recenti che valutano le variazioni del proteome nel nematode C. elegans hanno dimostrato che IF multipli sono altamente regolati e soggetti ad aggregatiDurante l'invecchiamento organico 11 , 12 . Poiché la manutenzione di una corretta struttura IF è essenziale per la resistenza cellulare a varie forme di stress 10 , l'aggregazione IF può anche contribuire al declino funzionale durante l'invecchiamento. Tuttavia, mancano gli studi sul livello organico che esaminano più proteine ​​di mammiferi IF nei diversi tessuti sottoposti a stress.

Le IF sono strutture altamente dinamiche che si adattano per soddisfare le esigenze cellulari. Le cheratine, ad esempio, subiscono un ciclismo indipendente dalla biosintesi tra il pool solubile (non filamentoso) e quello insolubile (filamentoso) 13 . In normali condizioni fisiologiche, circa il 5%, la piscina totale K8 / K18 può essere estratta in tampone privo di detersivo, rispetto a circa il 20% che può essere solubilizzata nel detergente non ionico Nonidet P-40, biochimicamente paragonabile a Triton- X100 14 , 15 . Durante la mitosi c'è un notevole aumento della solubilità dell'epitelio di tipo semplice K8 e K18 14 , che è meno evidente nelle cheratine epidermiche ma più evidente in vimentin e in altre proteine ​​di tipo III IF 15 e 16 . Le proprietà di solubilità delle proteine ​​IF sono fortemente regolate dalla fosforilazione, una modifica post-traduzionale chiave (PTM) per il riarrangiamento del filamento e la solubilità 17 , 18 , 19 , 20 . La maggior parte degli IF sono sottoposti ad una vasta regolazione da parte di un certo numero di PTM nei siti conservati, con conseguenti modifiche funzionali 17 .

Lo scopo di questo metodo è introdurre gli investigatori che sono nuovi al campo IF per l'estrazione biochimica e metodi analitici per lo studio delle proteine ​​IF attraverso diversi tessuti del topo. SpecificaCi concentriamo sull'isolamento delle proteine ​​IF usando un metodo di estrazione ad alto sale e la valutazione dei cambiamenti nei PTM tramite spettrometria di massa e da anticorpi di targeting PTM. Questi metodi si basano su procedure precedentemente pubblicate21 ma includono modifiche per estrarre diversi tipi di proteine ​​IF per scoprire il meccanismo comune per la regolazione nella famiglia IF. Ad esempio, l'acetilazione K8 in un residuo di lisina specifico regola l'organizzazione del filamento, mentre l'iperacetilazione favorisce l'insolubilità di K8 e la formazione di aggregati 22 . I recenti studi di profilom proteomici globali hanno inoltre evidenziato che la maggior parte delle proteine ​​IF del tessuto-specifico sono anche obiettivi per l'acetilazione e che la maggior parte dei siti di acetilazione IF sono limitati al dominio asta altamente conservato. Ciò evidenzia la necessità di metodi adatti alla profilazione globale del sistema IF. Introduciamo anche un rapido metodo di isolamento delle proteine ​​IF dai tessuti multipli utilizzando l'omogeneizzazione automatizzata in optiMatrice di lysazione. I preparati risultanti sono adatti per l'analisi PTM a valle tramite spettrometria di massa e altri metodi.

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Protocollo

Il protocollo è approvato e svolto in conformità con il comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) presso l'Università della Carolina del Nord.

1. Preparativi

  1. Preparare il tampone Triton-X (1% Triton X-100, 5 mM di acido etilendiammina-tetraacetico (EDTA), portare il volume in soluzione salina fosfata (PBS), pH 7,4). Per ottenere 500 mL: mescolare 5 mL ciascuno di Triton X-100 e 500 mM EDTA in 490 mL di PBS, pH 7,4. Conservare la soluzione tampone Triton-X a 4 ° C.
  2. Preparare il bucato di sale elevato (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 140 mM NaCl, 1,5 M KCl, 5 mM EDTA, 0,5% Triton X-100, portare volume in doppia distillazione (dd) H 2 O). Per ottenere 500 ml: mescolare 10 ml di 0,5 M Tris-HCl (pH 7,6), 14 ml di 5 M NaCl, 55,9 g KCl, 5 ml di 0,5 M EDTA e 2,5 ml di Triton X-100, regolare il volume a 500 ML utilizzando doppia acqua distillata). Conservare la soluzione ad alto contenuto di butadiene a 4 ° C.
  3. Appena prima dell'uso, aggiungere una quantità appropriata di Triton-X e High Buffer di sale ( Ad esempio 1 mL per ogni campione di tessuto da 25 mg) con un cocktail di proteasi o proteasi / fosfatasi e scartare qualsiasi tampone non utilizzato che contiene gli inibitori.
  4. Preparare 5 mM EDTA in 1x PBS, pH 7,4. Per ottenere 500 mL: mescolare 5 mL di 0,5 M EDTA in 495 mL di 1x PBS, pH 7,4.
  5. Isolare diversi organi del topo (cervello, cuore, polmone, fegato, pancreas, colon, intestino, rene, milza) utilizzando protocolli approvati conformi alle linee guida veterinarie e norme istituzionali 23 . La procedura di raccolta dei tessuti dovrebbe durare non più di 5 minuti per preservare l'integrità di RNA e proteine ​​dei tessuti ricchi di proteasi ( ad esempio, il pancreas dovrebbe essere trattato in primo luogo).
  6. Tagliare una piccola quantità di tessuto (~ 5-20 mg) e collocare nella soluzione di RNA per la successiva estrazione di RNA, la sintesi di cDNA e l'analisi quantitativa PCR in tempo reale per l'espressione del gene IF. Collocare i tubi della soluzione di stoccaggio RNA con tessuto a 4 ° C per una notte e seguire il protocollo del produttore per ulteriori sTorage e isolamento.
  7. Tagliare il resto del tessuto in frammenti più piccoli ( p. Es. 0,5 cm) e collocare in crioviale. Fissare a freddo e conservare flaconi a -80 ° C o azoto liquido per conservare a lungo termine.

2. IF Gene Expression Analysis

  1. Estrarre l'RNA dai tessuti conservati nel reagente della soluzione di storage RNA. Utilizzare qualsiasi metodo di estrazione appropriato / preferito secondo il protocollo del produttore.
  2. Quantificare la concentrazione di RNA e utilizzare 2 μg di RNA per generare cDNA usando un idoneo kit di trascrizione inversa secondo il protocollo del produttore.
  3. Utilizzando i primer genetici specifici del cDNA e del mouse del mouse, sono state create reazioni qPCR, tra cui tre repliche tecniche di ciascun campione, nonché un controllo in bianco secondo il protocollo del produttore.
  4. Quantifica l'espressione genica IF come un cambiamento pieghevole confrontando condizioni diverse ( ad esempio, giovani rispetto ai vecchi tessuti).

3. PRiparazione di lysati totali di tessuto per immunoblot

  1. Omogeneizzare 25 mg di tessuto in 1 mL di tampone di campione SDS non riducente. Uscire il colorante blu bromofenolo dal campione di tampone se si deve eseguire un test di proteina colorimetrico per quantificare la concentrazione proteica.
  2. Aggiungere 5% (v / v) di 2-mercaptoetanolo (2-ME) per ottenere campioni ridotti. A 200 μL di campioni non riducenti, aggiungere 10 μL di 2-ME.
  3. Determinare la concentrazione proteica usando un dosaggio proteico compatibile con detergente e agente riducente. Se la tintura è già inclusa nel buffer di campionamento, la quantità di proteine ​​può essere stimata dopo l'esecuzione di un gel attraverso una serie di tecniche, tra cui la macchia 24 a base di Coomassie.
  4. Vortex tutti i campioni e calore a 95 ° C per 5 min.
  5. Effettuare la blotting occidentale in condizioni sia riducenti che non riducenti. La membrana espositiva brevemente (<1 min) rivela specie monomeriche e più a lungo (> 1 min) per rivelare complessi di massa molecolare alta contengonoNg di proteine ​​IF. Se monitorare l'aggregazione, esamini intero gel / membrana (compresi i fondi dei pozzetti di gel).
  6. Eseguire un gel parallelo e macchia con una macchia proteica come un controllo di caricamento 24 . In modelli di malattia o esperimenti di lesioni, la proteina totale di proteine ​​dovrebbe essere utilizzata come un controllo di caricamento, a differenza di immunoblots per le proteine ​​di "pulizia" ( ad esempio, actina, GAPDH) perché quest'ultimo cambia in condizioni di stress differenti.

4. Preparazione di estratti solubili in detersivo e ad alto sale di IFs specifici per tessuti

  1. Aggiungere 1 ml di triturazione Triton X-100 ghiacciata in un omogeneizzatore di tubo di vetro e metterlo in ghiaccio.
  2. Rimuovere un piccolo pezzo di tessuto (~ 25 mg) dall'ammasso di azoto liquido e collocare direttamente nell'omogenizzatore di vetro. Utilizzare un pestello di politetrafluoroetilene per omogeneizzare (50 colpi) e evitare di fare bollicine. Tenere l'omogeneizzatore e il freddo lysate in ogni momento.
  3. Trasferire il lisato in un micron da 1,5 mlCondensare il tubo di ghiaccio e centrifugare a 20.000 xg per 10 min in una centrifuga pre-raffreddata (4 ° C).
  4. Raccogliere la frazione supernatante in un tubo separato. Questa è la frazione solubile in Triton X, che può essere usata per l'immunoprecipitazione (ip) e l'analisi del pool detergente-solubile di proteine ​​IF. Si noti che le fasi 4.1-4.4 possono essere ripetute per ottenere un estratto più pulito IF dal tessuto cerebrale.
  5. Aggiungere 1 mL di alti bufsi di sale al pellet di tessuto, trasferire in un omogeneizzatore pulito e scaricare 100 colpi. Trasferire l'omogenato al tubo di microcentrifuga e mettere il tubo su un agitatore rotante nella stanza fredda per 1 ora.
  6. Centrifugare gli omogeneati a 20.000 xg per 20 minuti a 4 ° C. Scartare il surnatante.
  7. Aggiungere 1 ml di bufalo PBS / EDTA al pellet e omogeneizzare il pellet (20 colpi) in un omogeneizzatore pulito come fase finale di pulizia *. Trasferire in un nuovo tubo e centrifugare a 20.000 xg per 10 minuti a 4 ° C per ottenere la proteina IF-Ricco di estratto di sale elevato (HSE).
    * Facoltativamente, vortice invece di omogeneizzazione a questo punto.
  8. Scartare il surnatante e sciogliere i pellet in 300 μL di buffer di campionamento SDS non ridotto che è stato pre-riscaldato. Rilasciare inizialmente il pellet pipettando e vorticando, quindi riscaldare i campioni per 5 minuti a 95 ° C.
  9. Vortex e pipetta come necessario per garantire che il pellet sia sciolto. Può richiedere alcuni minuti per dissolvere completamente i pellet.
  10. Conservare tutti i campioni a -20 ° C fino all'analisi.

5. Lisi di tessuto automatizzato per l'estrazione di proteine ​​IF in esperimenti ad alto volume

  1. Per l'estrazione di RNA, inserire il tampone di lisi (600 μL di tampone per 25 mg di tessuto) in un tubo contenente la matrice di lisi D (utilizza piccole sfere ceramiche) e impulsi due volte per 25 s nel lyser tissutale. Separare il lisato dalla matrice per centrifugazione a 20.000 xg e procedere alla fase successiva in isolamento.
  2. Per l'estrazione proteica, posizionare TritSu un tubo di lysing con la matrice di lysing SS (utilizzare un singolo tallone in acciaio inossidabile) su X-100 (o buffer SDS campione per preparare il lisato totale). Dopo aver testato più matrici, questo è stato selezionato perché produce estratti di proteine ​​IF che sono di qualità simile al metodo di ribaltamento tradizionale. Si noti che il metodo automatizzato non è ottimale per il pancreas e la milza e deve essere utilizzato il protocollo di omogeneizzazione standard per questi tessuti.
  3. Per procedere alla preparazione di High Salt Extract, rimuovere il tallone dell'acciaio inossidabile dal tubo usando un magnete e centrifugare i tubi a 20.000 xg per 10 minuti a 4 ° C.
  4. Continuare con il punto 4.4 (sopra) del protocollo manuale.
  5. Conservare tutti i campioni a -20 ° C fino all'analisi.

6. Immuno-arricchimento delle proteine ​​IF modificate post-traslazione

  1. Preparare il buffer PBST (0,02% Tween-20 in PBS). Per ottenere 50 ml, aggiungere 10 μL di Tween-20 a 50 ml di PBS, pH 7,4.
  2. Preparare l'anticorpo PTMSoluzione (1-10 μg di anticorpi in 200 μL di PBST). In generale, 3 μg di anticorpo / reazione è una buona condizione di partenza che può essere ulteriormente ottimizzata se necessario.
  3. Per ogni reazione, aliquota 50 μL di perline magnetiche in un tubo di microcentrifuga, posto sul magnete e aspirare la soluzione di stoccaggio del tallone.
  4. Coniugare le perle all'anticipo di immunoprecipitazione ri-sospendere nella soluzione anticorpale e incubare su rotatore (end-over-end, per assicurare la miscelazione di piccoli volumi) a temperatura ambiente per 20 minuti.
  5. Posizionare i tubi sulla magnete e aspirare la soluzione anticorpale.
  6. Sciacquare le perle coniugate con anticorpi una volta in 200 μl di PBST e rimuovere il tampone di lavaggio.
  7. Aggiungere 0,6-1 ml del lisato tissutale alle perle, mescolare con pipetta dolce e incubare per 3 ore su rotatore in una stanza fredda.
  8. Posizionare i tubi sul magnete, rimuovere lysate e lavare le perle cinque volte con 200 μL di PBST. Dopo l'ultimo passo di lavaggio, raccogliere le perle in 100 _6, L di PBS (no Tween-20) e trasferire in un nuovo tubo pulito. Mettere il tubo sul magnete.
  9. Aspirare il PBS e aggiungere 100 μl di buffer di campionamento non riducente. Rimuovere 50 μL e aggiungere 2-ME (5%) per ridurre i campioni. Riscaldare i campioni a 95 ° C per 5 min.
  10. Separare la frazione ip dalle perle sul magnete e raccoglierla in un nuovo tubo.
  11. Conservare i campioni a -20 ° C fino all'analisi.

7. Preparazione di campioni di proteine ​​IF per l'analisi della spettrometria di massa

  1. Pianificare una consultazione con un esperto di proteomica prima di avviare uno studio poiché ci sono significativi tempi e costi con l'analisi della spettrometria di massa.
  2. Prendere precauzioni speciali per evitare contaminazioni. Maneggiare tutti i gel con guanti puliti e incubare in contenitori puliti, lavati solo con ddH 2 O (evitare sapone).
  3. Eseguire 20-50 μL del campione HSE (dalle sezioni 4 e 5) su un gel SDS-PAGE secondo le condizioni standard.
  4. Macchiare con una macchia proteica per 1 h. Sciacquare più volte e de-macchia in ddH 2 O durante la notte. Le bande di proteine ​​IF devono essere facilmente visibili dopo la de-colorazione.
  5. Posizionare il gel tra i protettori in lamiera di plastica, eseguire la scansione e contrassegnare le bande che verranno escise e inviate per l'analisi.
  6. Accisa le bande di proteine ​​IF usando un nuovo rasoio pulito.
  7. Posizionare le bande di gel in tubi di microcentrifuga puliti e trasferire in un impianto di spettrometria di massa.

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Risultati

Un nuovo metodo rapido per l'estrazione elevata di proteine ​​IF dai diversi tessuti del topo usando la matrice di lysazione.

Il metodo tradizionale 25 , 26 di isolare la maggior parte della frazione proteica filamentosa intermedia dal tessuto epiteliale è stato modificato qui per includere 9 diversi organi e ...

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Discussione

I metodi che permettono la caratterizzazione biochimica delle proteine ​​IF possono essere utili per comprendere numerosi fenomeni patofisiologici nei sistemi mammiferi, in quanto le proteine ​​IF sono entrambi marcatori e modulatori dello stress cellulare e del tessuto 29 . Il principio dietro il metodo attuale si basa sulle procedure iniziali sviluppate negli anni '70 e '80 per isolare, separare e ricostituire proteine ​​IF dalle cellule e dai tessuti, generalmente impiegando soluzioni ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal NIH concede NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] e P30 DK034987 [alla UNC-Chapel Hill]. Gli autori ringraziano Deekshita Ramanarayanan per l'assistenza con qPCR e western blot experiments.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Dynabeads Protein GThermoFisher Scientific10009perle di immunoprecipitazione
PBSThermoFisher Scientific10010049per tamponi
Purelink RNA mini kitThermoFisher Scientific12183018l'estrazione dell'RNA dal tessuto
Purelink DNAse set ThermoFisherScientific12185010Asu colonna Digestione
Magnete Dynamag-2ThermoFisher Scientific12321Dper l'uso con dynabeads
Reagente colorante GelCode Blue ThermoFisherScientific24592Colorazione gel compatibile con la spettrometria di massa
Pierce ECL Western Blotting SubstratoThermoFisher Scientific32106per l'uso in western blot
Kit di trascrizione inversa cDNA ad alta capacitàThermoFisher Scientific4368813per l'uso nell'analisi dell'espressione genica
Sistema PCR Proflex 3 x 32 pozzettiPCR4484073ThermoFisher Scientific
Membrana di trasferimento PVDF ThermoFisher Scientific88520per western blot
Power Up SYBR master mixThermoFisher ScientificA25778per analisi qPCR
Soluzione RNAlaterThermoFisher ScientificAM7020per la conservazione dei tessuti prima dell'isolamento dell'RNA
Novex 4-20% Tris Glycine GelThermoFisher ScientificXP04205BOXGel proteico prefabbricato
Anti-cheratina 8 anticorpo (TS1)ThermoFisher ScientificMA514428per la rilevazione di western blot di K8
Anti-VimentinaThermoFisher ScientificMA511883per la rilevazione di western blot di vimentina
Tris Glycine Transfer Buffer (25x)ThermoFisher ScientificLC3675per il trasferimento a umido di gel proteici
2x SDS Sample BufferThermoFisher ScientificLC2676per la preparazione campioni di gel proteico
Tris Glycine SDS Running Buffer (10x)ThermoFisher ScientificLC26755per la corsa di gel proteici
Perle di lisi - Matrix DMP Biomedicals116913100Perle di lisi e provette per matrice per la disgregazione dei tessuti e l'estrazione dell'RNA
Perle di lisi - Matrix SSMP Biomedicals116921100Perle di lisi e provette per matrici per la disgregazione dei tessuti e l'estrazione di proteine
Spettrofotometro NanoDrop LiteThermoFisher ScientificND-LITEMisura di proteine e acidi nucleici
Omogeneizzatore Precellys 24BertinInstruments EQ03119Omogeneizzatore tissutale automatizzato
del DNA Sistema

Riferimenti

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