Qui presentiamo un protocollo di frazionamento della membrana cerebrale che rappresenta una procedura robusta per isolare le proteine appartenenti a diversi compartimenti sinaptici.
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Articolo metodologico
Frazione di membrana del cervello: An
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Sommario
Abstract
La valutazione della composizione e della funzione sinaptica della proteina costituisce una sfida importante nella neuroscienza. Tuttavia, non è facile valutare la neurotrasmissione che si verifica all'interno delle sinapsi perché è altamente regolata da interazioni proteiche-proteiche dinamiche e eventi di fosforilazione. Di conseguenza, quando uno qualsiasi metodo viene utilizzato per studiare la trasmissione sinaptica, un obiettivo principale è quello di preservare queste modifiche fisiologiche transitorie. Qui presentiamo un protocollo di frazionamento della membrana cerebrale che rappresenta una procedura robusta per isolare le proteine appartenenti a diversi compartimenti sinaptici. In altre parole, il protocollo descrive una metodologia biochimica per realizzare arricchimento proteico dai compartimenti presinaptici, postinaptici e extrasinaptici. In primo luogo, sinaptosomi o terminali sinaptici vengono ottenuti da neuroni che contengono tutti i compartimenti sinaptici mediante un gradiente discontinuo di saccarosio. Da notare, la qualità di questa preparazione iniziale della membrana sinaptica è critical. Successivamente, l'isolamento dei diversi compartimenti sottinaptici viene raggiunto con la solubilizzazione leggera usando detergenti delicati a condizioni di pH differenziali. Ciò consente la separazione mediante gradiente e centrifughe isopiche. Infine, l'arricchimento delle proteine nei differenti compartimenti subsintaptici ( cioè frazioni di membrana pre-, post- ed extrasinaptiche) viene convalidato mediante analisi di immunoblot mediante marcatori proteici sinaptici ben caratterizzati ( cioè SNAP-25, PSD-95 e sinaptofisina, Rispettivamente), consentendo così una valutazione diretta della distribuzione sinaptica di qualsiasi particolare proteina neuronale.
Introduzione
La trasmissione sinaptica si basa sull'integrità fisica della sinapsi, un concetto che era stato previsto già nel 1897 da Foster e Sherrington 1 . Così, la comprensione della distribuzione dei componenti chiave di neurotrasmissione ( es. Canali ionici, recettori, ecc. ) È essenziale per chiarire la funzione sinaptica, sia in condizioni normali che patologiche. La microscopia elettronica (EM) ha contribuito enormemente all'attuale nozione ultrastrutturale delle sinapsi prototipali del sistema nervoso centrale (CNS). In tal modo, EM ha stabilito finemente le differenze tra densità pre- e postinaptica, che sono separate da una fessura di una distanza piuttosto uniforme (~ 25 nm) 2 . È interessante notare che l'apparato postinaptico presenta un ispessimento relativamente continuo, elettrone-denso, sotto la sua membrana plasmatica, la cosiddetta densità postinaptica o PSD 2 . Al contrario, all'apparato presinaptico, un avvisoLa rete cytomatica discontinua è disposta appena sotto la membrana plasmatica, che è essenziale per l'allineamento e l'ancoraggio delle vescicole sinaptiche alla zona attiva della membrana plasmatica 3 . Quindi, EM costituisce l'approccio sperimentale d'oro per studiare la distribuzione delle proteine all'interno di sinapsi CNS strutturalmente conservati. Tuttavia, le informazioni fornite da microscopi elettronici sono statici. Infatti, le evidenze accumulate mostrano che le sinapsi in vivo sono estremamente dinamiche, provando quindi drammatiche modifiche strutturali alla trasmissione sinaptica sostenuta. Inoltre, la morfologia e la composizione delle sinapsi possono cambiare in diverse regioni del CNS e su sviluppo, maturazione, invecchiamento e sviluppo di condizioni neuropatologiche. Nel complesso, un protocollo focalizzato sull'isolamento di proteine appartenenti a diversi compartimenti sinaptici in condizioni fisiologiche rappresenta uno strumento prezioso per uno studio più completo del funzionamento sinaptico.
et al . (2001) 4 , si basa su un cambiamento di pH che indebolisce le interazioni adesive che si verificano all'interno dell'apparato pre- e postinaptico. In primo luogo, utilizzando detergenti delicati a pH 6,0, è possibile distinguere la giunzione aderente che contiene l'apparato pre- e postsinaptico e che viene mantenuto dal dominio della membrana extrasynaptica, che è solubilizzato e quindi può essere estratto dai contatti sinaptici. Successivamente, sollevando il pH da 6,0 a 8,0 in presenza di detergenti delicati, indebolisce la forza della giunzione aderente che mantiene la zona attiva presinaptica strettamente legata alla densità postinaptica. Quindi, lo scompartimento presinaptico è cosìLubrificata e può essere separata dalla densità postsinaptica, che è per lo più conservata perché la concentrazione del detergente utilizzato non promuove la sua solubilizzazione 4 . È interessante notare che l'efficienza di frazionamento, eventualmente superiore al 90%, può essere confermata da diversi marcatori sottosintesi: i ) la proteina associata alla sinaptosoma 25 (SNAP-25), dalla zona attiva presinaptica; Ii ) sinaptofisina, dalla frazione extrasinaptica ( cioè, al di fuori della zona attiva e microsomi inclusi); E iii ) proteina densità postinaptica 95 (PSD-95), dalla densità postinaptica. In particolare, questo metodo di frazionamento della membrana cerebrale è stato utilizzato con successo. Di conseguenza, è stato possibile determinare con precisione la localizzazione subsynaptica di diversi recettori, quali i recettori 5 dell'acido alfa-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isossazolepropionico (AMPA), il recettore dell'adenosina A1 (A 1 R) 6 ,Adenosina A 2A (A 2A R) 7 , adenosine trifosfato (ATP) P2, 8 recettori recettori del acetilcolino nicotinico 9 e recettore GPR3710 associato alla malattia di Parkinson. Tuttavia, una serie di limitazioni può ostacolare la corretta valutazione della distribuzione sinaptica di una particolare proteina neuronale. Quindi, in questa procedura, non solo descriviamo completamente l'intero protocollo, ma evidenziamo anche alcuni punti critici da prendere in considerazione, come la quantità piuttosto elevata di tessuti necessari, la bassa resa proteica e il requisito obbligatorio per convalidare l'efficienza Ogni separazione prima di eseguire l'esperimento definito.
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Protocollo
Tutte le procedure sperimentali animali sono state approvate dal Comitato di Barcellona per l'Uso e la Cura degli Animali (CEEA), conformemente alle linee guida descritte nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio11 e seguendo la Comunità Europea, la legge 86/609 / CCE, FELASA e ARRIVE. Così, i topi sono alloggiati in gabbie standard, con accesso ad libitum all'alimentazione e all'acqua e vengono mantenute in condizioni standard controllate (ciclo scuro / leggero da 12 ore a partire da 7:30 AM, temperatura di 22 ° C e umidità del 66%).
1. Ottenere Synaptosomes del cervello del mouse usando un Gradiente Discontinuo di Sucroso
Nota: Questo metodo è stato segnalato in precedenza 10 .
- Preparare tampone di isolamento fresco (IB), pH 7,4; 2 M saccarosio; 1 M saccarosio / 0,1 mM CaCl2; E 0,1 mM CaCl2 (vedi tabella 1 ). Chill le soluzioni sul ghiaccio.
- SaCrizione di cinque topi per dislocazione cervicale. Decapitate e rimuovete rapidamente il cervello di ogni animale. Disciogliere la regione cerebrale di interesse (cioè l'ippocampo, 0,25-0,35 g di tessuto fresco) e metterlo in un tubo di vetro Potter-Elvehjem da 5 ml su ghiaccio con 1 ml di IB.
- Homogenizzare il tessuto utilizzando un agitatore omogeneizzante (10 colpi a 700-900 rotazioni al minuto), preferibilmente in un bagno di ghiaccio per evitare il riscaldamento del campione.
- Posizionare il tessuto omogeneizzato (1 mL) in un tubo da 15 mL contenente 6 mi di saccarosio da 2 M e 2,5 mL di 0,1 mM CaCl2 a 4 ° C. Mescolare lentamente invertendo il tubo.
Nota: l'aggiunta di calcio è essenziale per mantenere le interazioni adesive tra gli organelli e quindi per preservare la struttura delle diverse "densità". - Posizionare la soluzione in un tubo da centrifuga da 12 ml e aggiungere lentamente 2,5 ml di saccarosio di 1 M / 0,1 mM CaCl2 sopra ogni tubo per formare il gradiente di saccarosio.
Nota: contrassegnare la posizione oF l'interfaccia di gradiente sul tubo centrifuga utilizzando un indicatore permanente. - Pesare e equilibrare i tubi di centrifuga con soluzione IB all'interno dei rispettivi supporti in acciaio e con i loro coperchi di chiusura.
- Centrifugare i tubi per 3 ore a 100.000 x g e 4 ° C utilizzando una centrifuga a rotore a pozzo. Riempire completamente il rotore con tutti i supporti in acciaio (anche vuoto, se necessario).
- Scartare il livello superiore contenente mielina. Con una pipetta Pasteur raccogliere l'anello bianco tra l'interfaccia di saccarosio 1,25-M e 1-M corrispondente alla frazione sinaptosoma.
- Diluire i sinaptosomi con 9X il loro volume usando IB in un tubo di centrifuga.
- Pesare e equilibrare i tubi di centrifuga con soluzione IB all'interno dei rispettivi supporti in acciaio e con i loro coperchi di chiusura.
- Centrifugare i tubi per 30 minuti a 15.000 x g e 4 ° C utilizzando una centrifuga a rotore a pozzo.
- Scartare il surnatante e riposizionareE con 10 ml di soluzione IB. Raccogliere 100 μL di questa soluzione sinaptosomica e centrifugare per 5 minuti a 11.000 x g e 4 ºC.
- Riposizionare il pellet sinaptosomico in sodio dodecil solfato (SDS) al 5% e memorizzare questo campione a -20 ° C.
Nota: Questo campione corrisponderà alla frazione totale di sinaptosomi per ulteriori analisi Western blot. La restante frazione sinaptosomica (~ 1 ml) può essere congelata a -20 ° C fino all'uso o elaborata per la successiva frazionamento subsintattico. I sinaptosomi o le sinapsi purificati rappresentano tra il 1 e il 2% del volume totale ippocampale 12 .
2. Isolamento pre-, post- ed extrasinaptico
- Preparare un tampone di solubilizzazione fresco 2x, pH 6,0; 1x tampone di solubilizzazione, pH 6,0; Tampone di solubilizzazione, pH 8,0; E 0,1 mM CaCl2 (vedi tabella 1 ). Chill le soluzioni sul ghiaccio.
Nota: il pH di queste soluzioni dovrebbe essere accuratelY regolato per ottenere una buona frazionamento subsynaptic. - Diluire lentamente la frazione sinaptosomale resuspendente da 1 mL (vedere la fase 1.12) con 5 mL di 0,1 mM CaCl2.
- Aggiungere lo stesso volume (5 mL) di tampone di solubilizzazione 2x a ghiaccio freddo, pH 6,0 e incubare per 50 minuti su ghiaccio sotto agitazione elevata in un bicchiere su ghiaccio.
Nota: mentre l'1% di Triton X-100 a pH 6.0 solubilizza tutte le proteine della membrana plasmatica, conserva le proteine all'interno dei contatti o dei giunti sinaptici ( vale a dire, strutture pre e postsynaptiche). - Mettere la soluzione in un tubo di centrifuga. Pesare e equilibrare i tubi con volumi equivalenti di 0,1 mM CaCl2 e 2x soluzione tampone di solubilizzazione, pH 6,0, all'interno dei rispettivi supporti in acciaio e con i loro coperchi di chiusura.
- Centrifugare i tubi per 30 minuti a 40.000 x g e 4 ° C utilizzando una centrifuga a rotore a pozzo. Il supernatante risultante rappresenta la frazione extrasinaptica,E il pellet corrisponde alle giunzioni sinaptiche ( cioè, frazioni pre- e postinaptiche).
- Concentrare il supernatante contenente la frazione extrasinaptica a un volume finale di 200 μL usando un tubo filtrante da 15 mL di 10K centrifugato a 4.000 xg e 4 ºC.
- Precipitare la frazione extrasinaptica risultante risultante (200 μL) con 5 volumi (1 ml) di acetone pre-refrigerato (-20 ° C) per una notte a -20 ° C.
- Il giorno dopo, centrifuga la frazione extrasinaptica per 30 minuti a 18.000 x g e -15 ° C. Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante di acetone e asciugare il pellet per rimuovere qualsiasi traccia di acetone.
- Infine, risospendere il pellet contenente le proteine extrasinaptiche con 200 μL di 5% SDS. Sonicare il pellet, se necessario.
- Senza interromperla, lavare attentamente il pellet contenente le frazioni pre- e postsinaptiche con 2 mL di tampone di solubilizzazione 1x, pH 6,0. Scartare il buffer.
- RisospendereIl pellet con 10 ml di tampone di solubilizzazione 1x, pH 8,0, utilizzando una pipetta di vetro Pasteur.
Nota: mentre l'1% di Triton X-100 a pH 8,0 solubilizza la specializzazione presinaptica, conserva la densità postinaptica insolubile 4 . - Incubare la sospensione per 50 minuti su ghiaccio sotto agitazione elevata in un bicchiere su ghiaccio.
- Mettere la soluzione in un tubo di centrifuga. Pesare e equilibrare i tubi con una soluzione di tampone di soluzione solubilizzazione, pH 8,0, all'interno dei relativi supporti in acciaio e con i loro coperchi di chiusura.
- Centrifugare i tubi per 30 minuti a 40.000 x g e 4 ° C utilizzando una centrifuga a rotore a cilindro oscillante; Il supernatante risultante corrisponde alla frazione presinaptica e al pellet alla frazione postsinaptica.
- Processare il surnatante contenente la frazione presinaptica, come descritto nei passaggi 2.6-2.9.
- Resuspendere la pellicola contenente la frazione postsinaptica con 200 μL di SDS al 5%. Sonicare il pellet, iF richiesto.
3. Analizzare i campioni mediante immunoblot per convalidare la frazionamento della membrana
- Determinare la quantità di proteine in ciascuna frazione ( cioè le frazioni totali, extra-, pre- e post-sinaptiche) utilizzando il saggio della proteina dell'acido bicinconico.
- Prendere 20 μg di proteine da ciascuna frazione e diluire fino ad un volume finale di 50 μl di SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Bollite per 5 min a 100 ºC.
- Separare le proteine mediante elettroforesi SDS-PAGE 10%, con un gel di concentrazione del 4% in condizioni riducenti. Elettroforesi a tensione costante di 80 V fino a quando il colorante entra nel gel inferiore e quindi aumenta la tensione a 120 V.
- Trasferire le proteine in una membrana PVDF e bloccare con IB soluzione di bloccaggio per 45 minuti a temperatura ambiente a scuotimento continuo.
- Incubare la membrana durante la notte a 4 ºC con l'anticorpo primario indicato ( cioè anti-SNAP-25,Anti-PSD-95, anti-sinaptofisina o anti-GPR37) diluita nella soluzione di blocco IB sotto scosse continue.
- Lavare la membrana tre volte (10 min ciascuno) con la soluzione di lavaggio IB per eliminare l'anticorpo primario non legato.
- Incubare con l'anticorpo secondario indicato per 90 min in condizioni scure a temperatura ambiente sotto scosse continue.
- Lavare la membrana tre volte (10 min ciascuna) con la soluzione di lavaggio IB per eliminare l'anticorpo secondario non legato.
- Incubare la membrana con substrato chemiluminescente (preparare il miscuglio in condizioni scure e seguire la proporzione 1: 1 della soluzione A e B fornita dal produttore).
- Analizzare la membrana in un dispositivo di rilevamento chemiluminescente.
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Risultati
La metodologia descritta è stata ampiamente utilizzata per l'analisi subsynaptica delle proteine neuronali in generale e per l'isolamento e la caratterizzazione biochimica dei ricercatori sinaptici 5 , 6 , 7 , 8 , 9 in particolare. È interessante notare che il risultato rappresentativo mostrato qui mostra l'utili...
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Discussione
Il protocollo qui presentato costituisce un potente strumento biochimico per lo studio della distribuzione subsinaptica di specifiche proteine all'interno di qualsiasi regione del cervello. Tuttavia, ci sono alcuni inconvenienti inerenti alla tecnica che meritano di essere evidenziati qui. Ad esempio, uno dei principali limiti è la quantità relativamente grande di tessuto necessaria per purificare una quantità ragionevole di proteine al fine di eseguire l'analisi immunoblot di tutte le frazioni subsinaptiche. Questo prob...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero dell'Economia e della Compagnia / Instituto de Salud Carlos III (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 e PIE14 / 00034), Institutional Catalonia de Recerca i Estudis Avançats (ICREA Academia-2010 (SBO-140028) a FC Inoltre, X. M, VF-D e FC appartengono al gruppo di ricerca accreditato "Neuropharmacology and Pain" (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251) . Il lavoro è stato sostenuto anche dal "Programa Pesquisador Visite Especial-Ciência sem Fronteiras" da CAPES (Brasile) a FC
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Saccarosio | Pancreac Quí mica SL, Barcellona, Spagna | 1.316.211.211 | |
| CaCl2 | Pancreac Quí mica SL, Barcellona, Spagna | 2.112.211.210 | |
| MgCl2· 6H2O | Pancreac Quí mica SL, Barcellona, Spagna | 1.313.961.210 | |
| Cocktail di inibitori della proteasi Set III | Millipore, Darmstadt, Germania | 535140 | |
| Trizma Base | Sigma, St. Louis, MO, USA | T1503 | |
| Tris-HCl | Pancreac Quí mica SL, Barcellona, Spagna | 1.236.541.209 | |
| Triton X-100 | Sigma, St. Louis, MO, USA | X100 | |
| SDS | Sigma, St. Louis, MO, USA | L3771 | |
| Glicerolo | Sigma, St. Louis, MO, USA | G5516 | |
| Blu Pancreas Bromofenolo | Quí mica SL, Barcellona, Spagna | 1.311.651.604 | |
| Ditiotreitolo | Sigma, St. Louis, MO, USA | D0632 | |
| Tween 20 | Sigma, St. Louis, MO, USA | P2287 | |
| Latte | |||
| NaCl | Pancreac Quí mica SL, Barcellona, Spagna | 1.216.591.211 | |
| KCl | Pancreac Quí mica SL, Barcellona, Spagna | 1.314.941.210 | |
| KH2PO4 | Merck | 4873 | |
| Na2HPO4 | Pancreac Quí mica SL, Barcellona, Spagna | 1.316.781.211 | |
| Basic 20 pH | Crison, Alella, Spagna | ||
| Polytron VDI 12 Omogeneizzatore adattabile | VWR, Radnor, PA, USA. | ||
| Provette ultratrasparenti (14x89 mm) | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcellona | 344059 | Le provette devono essere riempite quasi completamente quando vengono utilizzate per evitare collassi dovuti all'ultracentrifugazione. |
| Filtri centrifughi Amicon Ultra-15 Ultracel -10K | Merck Millipore, Darmstadt, Germania | UFC901008 | |
| Centrifuga 5430R | Eppendorf, Amburgo, Germania | ||
| Optima L-90K Ultracentrifuga | Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcellona | ||
| Sonifier 250 | Branson, Danbury, Connecticut | ||
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Europe GmbH, Barcellona, Spagna | ||
| Vetro monouso Pasteur Pippetes 230 mm | VWR, Radnor, PA, USA | 612-1702 | |
| Bilancia compatta EK-610 | A& D, Tokyo, Giappone | ||
| Pierce&commercio; Kit per il dosaggio delle proteine BCA | Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA | ||
| Substrato chemiluminescente SuperSignal west pico | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | ||
| GR 200 Bilancia di precisione | A& D, Tokyo, Giappone | ||
| Anti-GPR37 | Anticorpo anti-GPR37 fatto in casa prodotto e convalidato nel laboratorio Francisco Ciruela. | Anticorpi primari utilizzati a una concentrazione finale di 0,250 μ g/mL | |
| Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-sinaptofisina | Abcam, Cambridge, Regno Unito | Anticorpi primari diluiti 1:10.000 | |
| HRP-coniugati capra anti-topo IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Anticorpo secondario diluito 1:10.000 | |
| HRP-coniugato capra anti-coniglio IgG | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA. | Anticorpo secondario diluito 1:30.000 |
Riferimenti
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